肖 壯，唐 濤，朱成華， 孫先潤(rùn)，李亞國(guó)，李曉云，李蓮娥

（1.云南省第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650034；2.云南省第一人民醫(yī)院康復(fù)科，昆明 650034；3.云南新昆華醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650300；4.云南省第一人民醫(yī)院骨科，昆明 650034；5.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)教研室，昆明 650500）

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.002

破骨細(xì)胞在骨關(guān)節(jié)炎中的增殖變化及意義*

肖 壯1，唐 濤2,5△，朱成華3， 孫先潤(rùn)4，李亞國(guó)5，李曉云2，李蓮娥5

（1.云南省第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650034；2.云南省第一人民醫(yī)院康復(fù)科，昆明 650034；3.云南新昆華醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650300；4.云南省第一人民醫(yī)院骨科，昆明 650034；5.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)教研室，昆明 650500）

目的探討破骨細(xì)胞（OC）在骨關(guān)節(jié)炎（OA）各個(gè)時(shí)期中的增殖變化及臨床意義。方法20只健康成年SD雄性大鼠用改良Hulht手術(shù)方法造模，左膝為對(duì)照組，右膝為OA模型組。分別于術(shù)后1、2、4、8 周時(shí)采集全膝關(guān)節(jié)（n=5），并置于4 ℃多聚甲醛（PFA）液固定，石蠟包埋切片，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、甲苯胺藍(lán)（TB）及番紅-O快綠染色，觀察軟骨形態(tài)學(xué)改變并半定量TRAP染色陽(yáng)性的OC數(shù)量，通過(guò)Mankin′s評(píng)價(jià)OA軟骨破壞的進(jìn)展，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果兩組間OC均呈快速增高，然后下降的一過(guò)性增殖變化。對(duì)照組（左膝）在1周時(shí)OC數(shù)量為（65.20±4.12）個(gè)/mm2，2、4周時(shí)逐漸減少，分別為（47.20±4.31）個(gè)/mm2、（26.20±3.87）個(gè)/mm2，8周時(shí)幾乎看不到，細(xì)胞數(shù)為（7.00±2.28）個(gè)/mm2；OA模型組（右膝）在1周時(shí)OC數(shù)量為（70.40±5.46）個(gè)/mm2，2周時(shí)增加至（86.20±5.42）個(gè)/mm2，4周時(shí)減少至（38.00±3.16）個(gè)/mm2，8周時(shí)幾乎看不到，細(xì)胞數(shù)為（6.21±2.93）個(gè)/mm2。模型組OC數(shù)量在2、4周時(shí)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論大鼠膝關(guān)節(jié)OA實(shí)驗(yàn)的早中期OC大量增殖，OC可能參與了骨關(guān)節(jié)炎的形成。

破骨細(xì)胞；骨關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)軟骨；軟骨下骨；關(guān)節(jié)損傷

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是臨床常見多發(fā)疾病之一，以老年患者多見，具有較高的發(fā)病率和致殘率[1]；主要病理改變是軟骨的進(jìn)行性蛻變及破壞，風(fēng)險(xiǎn)因素包括年齡、負(fù)重改變及外傷等，但發(fā)病機(jī)制仍不清楚。基礎(chǔ)和臨床研究多集中于軟骨細(xì)胞凋亡[2]與細(xì)胞因子[如白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-18、腫瘤壞死因子（TNF）-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族]等方面[3]，對(duì)破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）在OA整個(gè)發(fā)病過(guò)程中的增殖變化與臨床防治意義方面的關(guān)注甚少。本研究擬通過(guò)觀察OC在大鼠OA模型中各時(shí)期的增殖變化，探討OA的相關(guān)發(fā)病機(jī)制，為臨床更合理地預(yù)防和治療OA提供一定的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特殊病原體（SPF）級(jí)8周齡雄性SD大鼠20只（體質(zhì)量240～260 g）用于本次實(shí)驗(yàn)，均由昆明理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2主要試劑及儀器 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒；番紅-O快綠染色劑；生物組織包埋機(jī)；光學(xué)顯微鏡（日本O-LYMPUS公司）；滑行式組織切片機(jī)（日本Funakoshi公司）。

1.3方法

1.3.1大鼠OA模型的制備 采用改良Hulht[4]手術(shù)方法制造OA動(dòng)物模型：大鼠左右膝關(guān)節(jié)經(jīng)剃毛、消毒后，右膝關(guān)節(jié)切斷內(nèi)側(cè)副韌帶（MCL）、前交叉韌帶（ACL）并切除內(nèi)側(cè)半月板（MM），行抽屜實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，用無(wú)菌生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，消毒并縫合術(shù)口；左膝關(guān)節(jié)僅切開關(guān)節(jié)腔，不傷及MCL、ACL、MM，然后用無(wú)菌生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，消毒、縫合術(shù)口。自然喂養(yǎng)，手術(shù)當(dāng)天和術(shù)后第1天給予抗菌藥物預(yù)防感染。

1.3.2標(biāo)本收集及檢測(cè)方法 （1）分別于術(shù)后1、2、4、8周時(shí)，選5只大鼠，乙醚麻醉后置于組織攝片機(jī)下，X射線對(duì)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織攝片。（2）組織攝片完成后處死大鼠，取全膝關(guān)節(jié)（n=5）。去皮后快速置入4 ℃，4%多聚甲醛（PFA）中固定。左側(cè)膝關(guān)節(jié)為對(duì)照組；右側(cè)膝關(guān)節(jié)為模型組。經(jīng)20%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣后，將全膝關(guān)節(jié)沿髕尖韌帶正中線矢狀面一分為二切開，常規(guī)系列脫脂、脫水、石蠟包埋，切片厚5 μm于4 ℃冷藏備用[5]。（3）TRAP、甲苯胺藍(lán)（TB）及番紅-O快綠染色：切片脫蠟至水，蒸餾水浸洗，TRAP染色，浸入TRAP液避光孵育1 h（按試劑盒說(shuō)明書操作）；TB染色，浸入TB 5 min；番紅-O快綠染色，浸入番紅-O液5 min后迅速浸入快綠液。蒸餾水3次浸洗多余染液； 逐級(jí)乙醇（70%、75%、80%、90%、100%）脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片備查。

1.3.3OC半定量 對(duì)軟骨下骨組織中TRAP染色陽(yáng)性的OC進(jìn)行分析測(cè)定：200倍鏡下選取不相重疊的5個(gè)代表性視野，測(cè)量單位面積陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)（紅色區(qū)域內(nèi)核數(shù)量大于或等于2個(gè)且緊密堆積細(xì)胞核團(tuán)計(jì)為1個(gè)OC），見圖1。

1.3.4關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)變化-Mankin′s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 關(guān)節(jié)軟骨Mankin′s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：（1）軟骨結(jié)構(gòu)，光滑整齊如常為0分；表面出現(xiàn)不規(guī)則裂痕為1分；裂痕深達(dá)輻射層為2分；裂痕深達(dá)移行層為3分；裂痕深達(dá)鈣化層為4分；軟骨脫落為5分。（2）軟骨細(xì)胞，數(shù)量正常為0分；數(shù)量彌漫性增多為1分；出現(xiàn)大量簇集樣細(xì)胞團(tuán)為2分；數(shù)量減少3分。（3）番紅-O快綠染色，正常染色為0分；染色輕度減少為1分；染色中度減少為2分；染色重度減少為3分；染色完全消失為4分。（4）TB染色，正常染色為0分；染色輕度減少為1分；染色中度減少為2分；染色重度減少為3分；染色完全消失為4分。（5）潮線完整性，完整為0分；多重潮線為1分；軟骨下骨血管入侵潮線為2分。

圖1 OC TRAP染色（A）及陽(yáng)性細(xì)胞半定量（B）示意圖

2 結(jié) 果

2.1膝關(guān)節(jié)X射線攝片 通過(guò)X射線攝片觀察（1、2周X射線攝片觀察沒發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)有明顯變化，故省略），模型組8周時(shí)呈現(xiàn)OA的典型表現(xiàn)：關(guān)節(jié)表面不平整、關(guān)節(jié)間隙狹窄、骨質(zhì)質(zhì)密化和囊性變，骨質(zhì)增生并伴骨贅形成（圖2）。

2.2TRAP染色及OC數(shù)量變化 脛骨軟骨下骨TRAP染色結(jié)果顯示：對(duì)照組在1周時(shí)可見大量TRAP染色陽(yáng)性的OC，2周時(shí)開始逐漸減少，8周時(shí)幾乎看不到；模型組在1周時(shí)可見大量OC，2周時(shí)明顯增加，4周時(shí)開始減少，8周時(shí)幾乎看不到。1、2、4、8周時(shí)OC數(shù)量分別為：對(duì)照組（65.20±4.12）個(gè)/mm2、（47.20±4.31）個(gè)/mm2、（26.20±3.87）個(gè)/mm2、（7.00±2.28）個(gè)/mm2；模型組（70.40±5.46）個(gè)/mm2、（86.20±5.42）個(gè)/mm2、（38.00±3.16）個(gè)/mm2、（6.21±2.93）個(gè)/mm2，模型組OC數(shù)量在2、4周時(shí)高于對(duì)照組，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

A：對(duì)照組4周；B：模型組4周；C：對(duì)照組8周；D：模型組8周；模型組8周時(shí)呈現(xiàn)典型的OA表現(xiàn)：骨面粗糙（a），骨質(zhì)密度增加、硬化（b），骨質(zhì)增生（c），囊腔形成（d），關(guān)節(jié)間隙變窄（e）
圖2膝關(guān)節(jié)X射線攝片

A、B、C、D：對(duì)照組；E、F、G、H：模型組
圖3脛骨下骨TRAP染色（×40）

A、B、C、D：對(duì)照組TB染色；E、F、G、H：對(duì)照組番紅-O快綠染色；I、J、K、L：模型組TB染色；M、N、O、P：模型組番紅-O快綠染色
圖4膝關(guān)節(jié)脛骨軟骨面TB及番紅-O快綠染色（×100）

2.3關(guān)節(jié)軟骨的破壞及Mankin′s評(píng)分 脛骨關(guān)節(jié)軟骨面經(jīng)TB及番紅-O快綠染色后，光鏡觀察：對(duì)照組軟骨表面光整，軟骨4層結(jié)構(gòu)清晰可見，在1～8周的觀察中變化很小，TB和番紅-O快綠染色正常；模型組在第1周時(shí)與對(duì)照組相當(dāng)，但在第2周時(shí)軟骨細(xì)胞即大量減少，表面出現(xiàn)不規(guī)則裂痕，染色中重度減少。至4周時(shí)軟骨幾乎全部脫落，染色消失，軟骨下骨血管入侵至潮線。各期Mankin′s評(píng)分為：對(duì)照組1分（1周）、2分（2周）、5分（4周）、6分（8周）；模型組3分（1周）、10分（2周）、17分（4周）、17分（8周），2、4、8周時(shí)兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

3 討 論

筆者通過(guò)手術(shù)切斷大鼠右膝關(guān)節(jié)MCL、ACL、MM建立OA疾病模型[4]，與同體異肢未傷及韌帶的左膝關(guān)節(jié)（對(duì)照組）進(jìn)行對(duì)照，模型組關(guān)節(jié)軟骨的破壞程度明顯高于對(duì)照組，8周時(shí)X射線攝片呈典型的OA病理改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，切斷關(guān)節(jié)韌帶會(huì)導(dǎo)致OA的形成。軟骨下骨TRAP染色結(jié)果顯示，對(duì)照組與模型組在術(shù)后1周時(shí)OC數(shù)量分別為（65.20±4.12）個(gè)/mm2和（70.40±5.46）個(gè)/mm2，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；第2周時(shí)對(duì)照組OC數(shù)量減少至（47.20±4.31）個(gè)/mm2，模型組則增加至（86.20±5.42）個(gè)/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；第4周時(shí)，對(duì)照組為（26.20±3.87）個(gè)/mm2，模型組也減少至（38.00±3.16）個(gè)/mm2（P<0.05）；至第8周時(shí)，對(duì)照組為（7.00±2.28）個(gè)/mm2，模型組為（6.21±2.93）個(gè)/mm2（P>0.05），兩組OC數(shù)量均明顯減少，鏡下幾乎看不到。OC在關(guān)節(jié)損傷后大量增殖，與Bertuglia等[6]的研究結(jié)果一致。不過(guò)，本實(shí)驗(yàn)還觀察到關(guān)節(jié)損傷-康復(fù)的整個(gè)周期中OC的增殖呈早期快速增高，然后下降的一過(guò)性變化，模型組OC的增殖比對(duì)照組多，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。

OC是一種巨大的多核細(xì)胞，起源于單核巨噬細(xì)胞/單核系造血前體細(xì)胞，具有重要的骨吸收功能，其骨吸收作用與成骨細(xì)胞的骨形成作用維持著骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡，是人體維系正常骨組織更新，維持骨骼的正常硬度與彈性的關(guān)鍵。OC的形成、活化及凋亡受機(jī)體眾多因素的調(diào)節(jié)，為盡量規(guī)避大鼠個(gè)體間差異的影響，本實(shí)驗(yàn)采用同體異肢進(jìn)行對(duì)照。關(guān)節(jié)經(jīng)手術(shù)造成損傷后，局部炎癥形成，大量的炎性因子和細(xì)胞因子聚集、形成，促進(jìn)OC大量增殖、分化、成熟和活性增加[7-9]。隨著損傷的逐步修復(fù)，炎癥減輕，OC的增殖也逐漸降低。模型組OC的增殖更多，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的原因，可能是切斷MCL、ACL、MM后創(chuàng)傷更大、炎癥更重，導(dǎo)致OC增殖、分化更多；同時(shí)，韌帶切斷后關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，恢復(fù)較對(duì)照組慢，大鼠活動(dòng)時(shí)即以對(duì)照側(cè)為主要支撐，模型側(cè)處于失重狀態(tài)，力學(xué)刺激減少，OC形成和活化，OC增殖進(jìn)一步增加[10-11]。

OC大量形成與活化，骨吸收作用極大增強(qiáng)，軟骨下骨基質(zhì)及鈣化層中有機(jī)質(zhì)和無(wú)機(jī)礦物質(zhì)被大量降解，骨質(zhì)破壞，吸收陷窩形成，骨面坑洼不平，不能將軟骨所承受的壓力均勻分散與傳遞，軟骨在外壓力下直接受損、破裂，局部炎癥形成，炎性因子和細(xì)胞因子等形成并聚集，軟骨代謝改變，軟骨內(nèi)形成骨化點(diǎn)，次級(jí)骨化中心形成[12]。另一方面，軟骨下骨連接著骨與軟骨，具有傳導(dǎo)垂直應(yīng)力、抵抗剪切應(yīng)力等作用[13]，其結(jié)構(gòu)改變將直接影響所支撐的軟骨的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致軟骨鈣化增加及軟骨損傷。大量OC增殖和活化，打破了軟骨下骨的代謝平衡，促使軟骨下骨重塑增加。軟骨下骨的代謝改變及重塑與OA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，軟骨和軟骨下骨相互作用，形成惡性循環(huán)，貫穿 OA病程始終[14-15]。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為，OC大量增殖和活化后，骨吸收大幅增加，骨質(zhì)被破壞，骨基質(zhì)表面不平導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨受壓而直接損傷，以及由骨吸收病理性增加導(dǎo)致的軟骨下骨骨代謝動(dòng)態(tài)平衡改變，骨重塑增加，是形成OA的又一原因。在嚴(yán)重關(guān)節(jié)損傷的臨床治療中，應(yīng)注意對(duì)OA早期的預(yù)防處理。OC在早中期OA中的一過(guò)性高增殖，為OA防治提供了新的靶點(diǎn)，也為選擇防治的最佳時(shí)間提供了科學(xué)、合理的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。早期預(yù)防性使用OC抑制劑或許是防治OA的又一有效方法。

綜上所述，大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)的早中期OC大量增殖，表明OC可能參與了骨關(guān)節(jié)炎的形成。

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Proliferationchangeandsignificanceofosteoclastsinosteoarthritis*

XiaoZhuang1,TangTao2,5△,ZhuChenghua3,SunXianrun4,LiYaguo5,LiXiaoyun2,LiLiane5

（1.DepartmentofPharmacy,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650034，China; 2.DepartmentofRehabilitation,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650034，China; 3.DepartmentofPharmacy,NewKunhuaHospital,Kunming,Yunnan650300，China; 4.DepartmentofOrthopedics,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650034，China; 5.TeachingandResearchingSectionofRehabilitation,MedicalCollegeofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,Yunnan650500，China）

ObjectiveTo explore the proliferative changes and clinical significance of osteoclasts （OC） in various stages of osteoarthritis （OA）.MethodsTwenty healthy adult male SD rats were made the model by modified Hulht procedure,the left knee served as the control group and the right knee as the OA model group.The total knee joint （n=5） was collected at postoperative 1,2,4,8 weeks,fixed at 4 ℃ 4% poly formaldehyde（PFA） liquid,embedded by paraffin for conducting sections,and stained by TRAP,toluidine blue（TB） and safranine O （Saf O）fast staining.Then the cartilage morphology change was observed and OC positive cells number with TRAP staining were semi-quantitatively detected,the OA cartilage destruction progression was evaluated by Mankin ′s method and SPSS17.0 statistics software was used to conduct statistical analysis.ResultsOC in the two groups showed the transient change of rapidly increasing and then decreasing.The OC number at 1 week in the control group （left knee） was （65.20±4.12） cells/mm2,and was gradually reduced at 2,4 weeks,which were （47.20±4.31） cells/mm and （26.20±3.87） cells/mm2,which at 8 weeks was almost invisible,the number of cells was （7.00±2.28） cells/mm2;the OC number at 1 week in the OA model group （right knee） was （70.40 ± 5.46） cells/mm2,increased to （86.20±5.42）cells /mm2at 2 weeks,reduced to （38.0±3.16） cells/mm2at 4 weeks,was almost invisible at 8 weeks,the number of cells was （6.21±2.93） cells /mm2.The OC number at 2,4 weeks in the model group was significantly higher than that in the control group,the difference had statistical significance （P<0.05）.ConclusionLarge numbers of osteoclasts are proliferated in the early and middle stages of rat knee osteoarthritis,which indicating that OC might be involved in the formation of osteoarthritis.

osteoclast;osteoarthritis;articular cartilage;subchondral bone;joint injury

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2013FZ182）；昆明理工大學(xué)引進(jìn)人才基金資助項(xiàng)目（KKZ3201460023）。

肖壯（1982-），主管藥師，在讀碩士，主要從事骨關(guān)節(jié)炎基礎(chǔ)及藥物治療的研究。△

,E-mail：taoer2324@sina.com。

R684.3

A

1671-8348（2017）30-4181-04

2017-01-18

2017-04-06）