胡畔，王加璐，何志義

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001）

北方漢族缺血性腦卒中人群ABCB1基因rs1045642多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性研究

胡畔，王加璐，何志義

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001）

目的探討中國(guó)北方漢族缺血性腦卒中人群ABCB1基因rs1045642多態(tài)性與氯吡格雷抵抗（CR）之間可能存在的關(guān)系。方法選取110例急性缺血性腦卒中患者，入院后口服氯吡格雷（75 mg/d），于首日給藥前及服用藥物7 d時(shí)分別采集靜脈血（2 mL），測(cè)定血小板聚集率。CR定義為2次血小板聚集率的變化值不超過10%。所有患者根據(jù)結(jié)果被分為CR組和非CR（NCR）組。提取基因組DNA后用PCR擴(kuò)增目的基因并用RFLP法測(cè)定SNP。結(jié)果ABCB1基因rs1045642位點(diǎn)TT基因型頻率CR組與NCR組比較明顯升高（P = 0.003）。相比于攜帶C等位基因，攜帶T等位基因頻率在CR組明顯高于 NCR 組（P = 0.001）。結(jié)論北方漢族缺血性腦卒中患者中，ABCB1基因在SNP位點(diǎn)rs1045642的多態(tài)性可能是CR發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，T等位基因可能是CR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)基因。

缺血性腦卒中； ABCB1基因； 單核苷酸多態(tài)性； rs1045642； 氯吡格雷抵抗

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康的一種疾病，其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、致殘率及死亡率均高，其中有60%～80%患者為缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）［1］。美國(guó)心臟學(xué)會(huì)和美國(guó)卒中學(xué)會(huì)的腦卒中治療指南指出，在IS或短暫腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）患者的治療中，氯吡格雷是重要的抗血小板聚集藥物［2］。作為一種不具備活性的前體藥物，其抗血小板作用并非直接產(chǎn)生，而是需要通過體內(nèi)的吸收及代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘某煞?，進(jìn)而對(duì)血小板的聚集產(chǎn)生抑制作用［3］。部分患者在長(zhǎng)期服用氯吡格雷情況下仍有缺血事件發(fā)生，該現(xiàn)象被稱為氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）［4-5］。藥物代謝動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)研究［6］表明，氯吡格雷在體內(nèi)吸收、代謝、藥理活性均可能受到基因多態(tài)性的調(diào)節(jié)，基因多態(tài)性與CR之間的關(guān)系受到越來越多學(xué)者們的關(guān)注［7］。目前對(duì)CR的檢測(cè)方法沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，最常用的方法是對(duì)血小板聚集率的測(cè)量［8］。

ABCB1基因變異可能會(huì)引起個(gè)體間藥物吸收代謝差異，影響或干擾氯吡格雷藥物的吸收，從而參與CR的發(fā)生［9］。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)與氯吡格雷吸收相關(guān)的ABCB1基因多態(tài)性在IS患者中研究很少。中國(guó)是IS的高發(fā)國(guó)家，對(duì)ABCB1基因多態(tài)性與CR間關(guān)系的研究能夠?yàn)榭寡“逅幬锏膫€(gè)體化治療提供新的依據(jù)，對(duì)于降低IS事件發(fā)生率具有重要意義及臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑包括ADP誘導(dǎo)劑（美國(guó)HELENA公司）、全血基因組DNA小量純化試劑盒（WLA057b，沈陽(yáng)Wanleibio 公司）、Goldview I （G8140，北京 Solarbio公司）、Powder瓊脂糖（11860，Spain）、50×TAE（N10053，北京海利克思公司）、2×Power Taq PCR MasterMix（PR1702，北京BioTeke公司）、引物（上海生工生物工程公司）。儀器包括血小板聚集儀（Aggram）、離心機(jī)（LD5-2A）、超純水系統(tǒng)（NW10LVF）、超速冷凍離心機(jī)（H-2050R）、微量移液器（Proline）、PCR儀（Life Express）、電泳儀（DYY-7C）、紫外分光光度計(jì)（NANO 2000）、凝膠成像分析儀（WD-9413B）。

1.2 研究對(duì)象及方法

1.2.1 研究對(duì)象：選取2015年3月至2016年10月期間中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的IS患者110例。研究經(jīng)過中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與本項(xiàng)研究的患者均已告知具體情況并簽署知情同意書。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；NIHSS評(píng)分＜26分；急性動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死和TIA患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：心源性或其他不明原因?qū)е碌哪X梗死；患有血液系統(tǒng)或出血性疾??；血小板計(jì)數(shù)＞450×109/L或＜100×109/L；近1月內(nèi)使用對(duì)血小板聚集功能有影響的相關(guān)藥物；近1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行較大外科手術(shù)；氯吡格雷過敏或其他原因?qū)е虏荒芊?；患有癌癥、自身免疫性疾病或其他嚴(yán)重臟器疾??；年齡＜18歲；非漢族。

1.2.2 研究方法：收集研究對(duì)象的臨床資料，包括身高、體質(zhì)量、血壓、年齡、性別、是否吸煙、曾用藥物等。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括血尿常規(guī)、凝血功能、肝腎功能、空腹血糖、血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高/低密度脂蛋白膽固醇（high / low density lipoprotein cholesterol，HDL-C/LDL-C）等。入院后清晨空腹采集外周靜脈血（5 mL），EDTA抗凝，以用于基因組DNA的提取，并分析ABCB1 rs1045642位點(diǎn)的基因型。研究對(duì)象口服氯吡格雷治療，藥物劑量為75 mg/d，于首日給藥前及給藥7 d時(shí)采集靜脈血（2 mL），3.2%枸櫞酸鈉抗凝，通過光比濁法測(cè)定血小板聚集率（maximal platelet aggregation rate，MPAR），收集的血樣在室溫條件下2 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。將5 μ mol/L二磷酸腺苷 （adenosine diphosphate，ADP）誘導(dǎo)下的MPAR在服用氯吡格雷前和服用7 d后的差值≤10%定義為CR［4］。并由此將入選患者劃分為CR組和非CR（NCR）組。

1.3 基因型檢測(cè)

按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取外周血基因組DNA，通過HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)中國(guó)北京漢族人群（Chinese Han in Beijing，CHB）樣本進(jìn)行查詢，選擇本研究的標(biāo)簽SNP為rs1045642。從NCBI官網(wǎng)公布的dbSNP庫(kù)查詢r(jià)s1045642的位點(diǎn)序列，之后通過在線網(wǎng)站W(wǎng)atCut進(jìn)行內(nèi)切酶查詢，并選定DpnI作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用的內(nèi)切酶。根據(jù)NCBI網(wǎng)站的Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的ABCB1序列信息，利用primer premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。具體如下：F，5’-TGAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3’；R，5’-TACCCCTAAGGCTGACAAAGG-3’。引 物 設(shè) 計(jì)完成后由生工生物工程技術(shù)有限公司（上海）進(jìn)行引物合成。利用NCBI的BLAST核酸數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證，產(chǎn)物片段509 bp。PCR反應(yīng)體系20 μ L，其中DNA模板1 μ L，上下游引物各1 μ L，2×Taq PCR Master-mix 10 μ L，ddH2O 7 μ L。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，35個(gè)循環(huán)后，25 ℃延伸2 min。酶切反應(yīng)體系20 μ L：ddH2O 7 μ L，10×Buffer 2 μ L，PCR產(chǎn)物10 μ L，內(nèi)切酶1 μ L。酶切反應(yīng)后利用3 %的瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將患者的一般臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果建立EXCEL數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)PCR-RFLP實(shí)驗(yàn)結(jié)果整理rs1045642位點(diǎn)SNP分型信息，利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg （H-W）平衡分析。計(jì)量資料用x-±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。組間基因型及等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者臨床資料比較

在5 μ mol/L ADP誘導(dǎo)下，MPAR在服用氯吡格雷前和服用氯吡格雷7 d后變化值≤10%共計(jì)35例。110例患者中有31.8%歸于CR組（35例），68.2%歸于NCR組（75例）。2組患者年齡、性別、既往卒中史等比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞ 0.05）。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果也未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞ 0.05）。見表1。

2.2 PCR-RFLP電泳結(jié)果

擴(kuò)增后的目的基因片段長(zhǎng)度為509 bp，若基因型為CC，則存在一個(gè)酶切位點(diǎn)DpnI（GA/TC），經(jīng)過酶切產(chǎn)生2個(gè)片段，分別為384 bp及124 bp；若發(fā)生變異（C＞T），則雜合子基因?qū)a(chǎn)生3個(gè)片段，509 bp、384 bp及124 bp；若基因型為TT，則酶切后表現(xiàn)為單條帶509 bp，見圖1。

表1 2組患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of clinical indexes between the CR and NCR groups

2.3 H-W平衡檢驗(yàn)

圖1 PCR-RFLP電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results for PCR-RFLP

通過H-W平衡檢驗(yàn)計(jì)算，P = 0.995，說明ABCB1 rs1045642位點(diǎn)基因型頻率分布符合H-W平衡（P ＞0.05），即本實(shí)驗(yàn)選擇的樣本基因頻率分布有群體代表性，適合進(jìn)行遺傳學(xué)分析。

2.4 標(biāo)簽SNP基因型以及等位基因頻率分布

CR組和NCR組ABCB1基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs1045642同時(shí)存在3種基因型：CC、TT與CT，基因型頻率分別為20.0%、34.3%、45.7%和41.3%、9.04%、49.3%。3種遺傳模式（顯性、隱性及共顯性）下與NCR組比較，CR組TT基因型頻率明顯增高（P ＜ 0.01）；同時(shí)，在rs1045642位點(diǎn)中，CR組攜帶T等位基因的頻率顯著高于NCR組（P = 0.001）。CR組和NCR組ABCB1基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs1045642在等位基因以及基因型分布方面均表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜ 0.05）。見表2。

表2 ABCB1基因標(biāo)簽SNP基因型及等位基因頻率分布 ［n （%）］Tab.2 Genotype and allele frequency distribution for the ABCB1 SNP ［n （%）］

3 討論

因?yàn)榇嬖贑R，臨床上仍可見到較多的缺血事件再發(fā)。因此，已有學(xué)者［10］研究CR與基因多態(tài)性間的潛在關(guān)系。影響氯吡格雷藥物體內(nèi)吸收代謝的2個(gè)主要基因是ABCB1和CYP2C19， CYP2C19已經(jīng)證實(shí)和CR有關(guān)［11］。有研究［12］指出，氯吡格雷給藥應(yīng)根據(jù)患者的不同情況及臨床特點(diǎn)決定，這樣有助于對(duì)可能出現(xiàn)藥物抵抗的患者進(jìn)行區(qū)分。

P-糖蛋白（P-gp）是一種依賴于ATP在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用的膜蛋白［13］。其作為外排泵可對(duì)抗有機(jī)陽(yáng)離子、氨基酸、多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［14］。ABCB1基因有50多個(gè)單核酸多態(tài)性位點(diǎn)存在，可以通過對(duì)P-gp蛋白表達(dá)的直接調(diào)控影響氯吡格雷的吸收、代謝。因此，ABCB1基因多態(tài)性可能是CR發(fā)生的一個(gè)因素。目前ABCB1基因的多個(gè)SNPs中rs1045642（C3435T）位點(diǎn)受到研究者的廣泛關(guān)注，但結(jié)論并不統(tǒng)一［15-17］。在印度卒中人群ABCB1基因位點(diǎn)C3435T與阿司匹林抵抗的研究中，C3435T TT基因型攜帶者發(fā)生阿司匹林抵抗的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高［15］。研究［16］發(fā)現(xiàn)，攜帶ABCB1基因rs1045642位點(diǎn)TT基因型的患者在服用氯吡格雷后再發(fā)性缺血事件發(fā)生的概率較高，而攜帶野生型CC基因型患者復(fù)發(fā)率沒有增加，與此相反，另一項(xiàng)研究［17］報(bào)道，野生型CC基因型個(gè)體氯吡格雷治療后具有更高的復(fù)發(fā)性缺血性事件風(fēng)險(xiǎn)。但是，這些早期的研究主要集中在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者而不是IS患者。

本研究所得結(jié)果提示CR的發(fā)生與高血壓、吸煙、LDL-C等因素并無明顯相關(guān)性。選取ABCB1的1個(gè)標(biāo)簽SNP，對(duì)其與CR患者進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，數(shù)據(jù)表明，在ABCB1基因單核酸多態(tài)位點(diǎn)rs1045642檢測(cè)中，CR組患者中攜帶 T等位基因的頻率明顯高于NCR組（P = 0.001）。在3種遺傳模式（顯性、隱性及共顯性）下，CR組TT基因型頻率相比于NCR組明顯升高。因此，ABCB1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1045642（C3435T）可能與CR發(fā)生存在相關(guān)性。

本研究尚不能完全排除樣本的選擇導(dǎo)致的結(jié)果差異，同時(shí)可能存在其他因素影響氯吡格雷吸收、代謝；另外，CR的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要是血小板聚集功能的測(cè)定，且目前尚缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。如果能建立一種可靠的預(yù)測(cè)方法，預(yù)先對(duì)篩選出的CR高發(fā)患者進(jìn)行特殊干預(yù)，及時(shí)調(diào)整抗血小板藥物，對(duì)IS患者的預(yù)后改善有很大的積極意義。通過對(duì)CR以及ABCB1基因多態(tài)性之間關(guān)系探討，進(jìn)一步證實(shí)基因多態(tài)性這個(gè)內(nèi)在因素在CR發(fā)生中的作用，為臨床醫(yī)生選擇抗血小板聚集藥物提供一定的理論依據(jù)。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組. 中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014［J］.中華神經(jīng)科雜志，2015，48（4）：246-257. DOI：10.3760/cma.j.issn.1006-7876.2015.04.002.

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（編輯 武玉欣）

The Correlation between the ABCB1 rs1045642 Polymorphism and Clopidogrel Resistance among Chinese Han Patients with Ischemic Stroke

HU Pan，WANG Jialu，HE Zhiyi

（Department of Neurology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between the ABCB1 rs1045642 polymorphism and clopidogrel resistance （CR）among Chinese Han patients with ischemic stroke.MethodsIn total，110 patients with acute ischemic stroke were included in the study.Venous blood samples （2 mL） were collected after oral administration of 75 mg/d clopidogrel；the platelet aggregation rate was measured before clopidogrel administration and after 7 days of clopidogrel administration. CR is defined as no more than 10% change in the platelet aggregation rate over two times . Based on the results，patients were divided into the CR group and non-CR （NCR） group. Genomic DNA was extracted，the target gene was amplified by PCR，and the SNP was determined by RFLP.ResultsThe TT genotype frequency of ABCB1 rs1045642 was significantly higher in the CR group than in the NCR group （P = 0.003）. T allele carriers in CR group show much more （57.1% vs 34%，P = 0.001） compared with those in the NCR group.ConclusionThe ABCB1 rs1045642 polymorphism may be an independent risk factor and the T allele may be a gene indicating risk for CR among Chinese Han patients with ischemic stroke.

ischemic stroke； ABCB1 gene； single nucleotide polymorphism； rs1045642； clopidogrel resistance

R743.3

A

0258-4646（2017）11-1019-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.013

胡畔（1987-），女，助教，碩士.

何志義，E-mail：hezhiyi0301@sina.com

2017-03-03