常超，姜宇，楊朋欣

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

副豬嗜血桿菌滅活疫苗（SYS株）生產(chǎn)工藝的初步建立

常超，姜宇，楊朋欣

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

為制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗并對(duì)其生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)分別對(duì)制苗過程的發(fā)酵工藝和滅活工藝進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)制備的疫苗進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并分析免疫效果。結(jié)果表明，制苗用含10%新生牛血清和15 μg·mL-1NAD的TSB培養(yǎng)基，并按培養(yǎng)基總量2%～4%分別接種副豬嗜血桿菌各菌株二級(jí)種子液，設(shè)定攪拌速度為100 r·min-1，37℃培養(yǎng)10 h收獲菌液，可獲得理想的制苗菌液；0.3%的甲醛于37℃滅活24 h，可完全滅活菌液。按照優(yōu)化后的工藝制備的滅活疫苗是安全的。

副豬嗜血桿菌滅活疫苗；生產(chǎn)工藝；滅活檢驗(yàn)

副豬嗜血桿菌病，又稱多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，也稱格拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌引起[1]。這種細(xì)菌在環(huán)境中普遍存在，世界各地都有，甚至是健康的豬群當(dāng)中也能發(fā)現(xiàn)。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，規(guī)模化飼養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用和飼養(yǎng)高度密集，以及突發(fā)新的呼吸道綜合征等因素存在，使得該病日趨流行，危害日漸嚴(yán)重[2]。

對(duì)該病的控制一般采取抗生素治療，但該方法易產(chǎn)生耐藥性，因此疫苗的制備是控制該病較好的手段，本文對(duì)副豬嗜血桿菌疫苗制備生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得安全、免疫效力良好的滅活產(chǎn)品，為副豬嗜血桿菌多價(jià)苗和聯(lián)苗產(chǎn)品的制備提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株和主要試劑及儀器

副豬嗜血桿菌血清4型SYS株由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司分離鑒定。

甲醛溶液和NaCl均購自國藥集團(tuán)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，V因子，氧化型輔酶I）購自LOCHE公司；新生犢牛血清購自GIBCO公司；TSA和TSB均購自O(shè)XOID；發(fā)酵罐購自福州福爾流體設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

3～5周齡健康易感豬，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司定點(diǎn)試驗(yàn)豬場(chǎng)提供，經(jīng)間接血凝試驗(yàn)，其副豬嗜血桿菌間接血凝抗體效價(jià)≤1∶4。

2 試驗(yàn)方法

2.1 副豬嗜血桿菌生產(chǎn)用種子制備

取副豬嗜血桿菌SYS株凍干菌種分別用含NAD和新生牛血清的TSB培養(yǎng)基溶解，劃線接種于含NAD和新生牛血清的TSA平皿上，置37℃培養(yǎng)24 h，挑選若干典型菌落，接種含NAD和新生牛血清的TSA固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，作為一級(jí)種子。用TSB培養(yǎng)基洗下固體培養(yǎng)基上的一級(jí)種子菌落，接種于含10%新生牛血清和15 μg·mL-1NAD的TSB培養(yǎng)基，置37℃振蕩培養(yǎng)10 h，取樣經(jīng)純檢合格后作為二級(jí)種子。

2.2 二級(jí)種子接種量的優(yōu)化

種子接種量是指接入種子體積和培養(yǎng)基體積的比例。制苗用含10%的新生牛血清和16 μg·mL-1NAD的TSB培養(yǎng)基。以1%、2%、4%和5%的比例分別接種SYS株二級(jí)種子，37℃培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)2 h后，設(shè)定攪拌速度為100 r·min-1，培養(yǎng)12 h，每隔2 h取樣，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測(cè)定不同接種量、不同培養(yǎng)時(shí)間菌液中的活菌數(shù)，確定二級(jí)種子的最佳接種劑量。

2.3 血清和NAD添加量的優(yōu)化

按含15 μg·mL-1NAD的TSB培養(yǎng)基總量的5%、10%和15%的比例來添加血清，或按含10%血清的TSB培養(yǎng)基中NAD濃度分別為10、15、20 μg·mL-1的量分別接種2%的SYS株的二級(jí)種子，37℃培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)2 h，設(shè)定攪拌速度為100 r·min-1，培養(yǎng)12 h，每隔2 h取樣，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定在TSB培養(yǎng)基中血清和NAD的最佳添加量。

2.4 按照優(yōu)化條件培養(yǎng)副豬嗜血桿菌

根據(jù)上述試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，得出制苗用含15 μg·mL-1NAD和10%血清的TSB培養(yǎng)基。按TSB培養(yǎng)基的總量2%分別接種副豬嗜血桿菌各菌株二級(jí)種子液，設(shè)定攪拌速度為100 r·min-1，37℃培養(yǎng)10 h收獲菌液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2.5 滅活方法優(yōu)化

按照優(yōu)化方法培養(yǎng)副豬嗜血桿菌，分別加入0.2%、0.3%和0.4%的甲醛溶液，然后取12、16、20、24和28 h滅活菌液進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。

2.6 滅活菌液對(duì)試驗(yàn)豬的安全性試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定各菌株的滅活條件后，取滅活徹底的菌液，按4.0 mL·頭-1的劑量頸部肌肉注射5周齡健康易感豬（副豬嗜血桿菌間接血凝效價(jià)≤1∶4）2頭，連續(xù)觀察14 d，觀察試驗(yàn)豬的臨床表現(xiàn)、健康狀態(tài)及其有無局部及全身反應(yīng)。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同二級(jí)種子接種量在不同培養(yǎng)時(shí)間的菌液中活菌濃度

副豬嗜血桿菌各菌株不同接種量、不同培養(yǎng)時(shí)間的菌液中活菌濃度見表1?？紤]生產(chǎn)成本，確定副豬嗜血桿菌各菌株二級(jí)種子的接種量為2%～4%，培養(yǎng)時(shí)間為10 h。

表1 不同接種量、不同培養(yǎng)時(shí)間副豬嗜血桿菌HB株菌液濃度cfu·mL-1

3.2 血清和NAD添加量的試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定含不同血清含量的TSB培養(yǎng)基在不同培養(yǎng)時(shí)間菌液中的活菌濃度，試驗(yàn)結(jié)果見表2。測(cè)定含不同NAD含量的TSB培養(yǎng)基在不同培養(yǎng)時(shí)間菌液中的活菌濃度，試驗(yàn)結(jié)果見表3。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，考慮生產(chǎn)成本，副豬嗜血桿菌各菌株血清添加量為10%，NAD添加濃度為15 μg·mL-1，在此添加條件下，培養(yǎng)8～10 h，副豬嗜血桿菌各菌株培養(yǎng)濃度較高，能滿足抗原生產(chǎn)需要。

3.3 按照優(yōu)化條件培養(yǎng)副豬嗜血桿菌各菌株

根據(jù)上述試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，得出制苗用培含15 μg·mL-1NAD和10%血清的TSB培養(yǎng)基。按TSB培養(yǎng)基總量的2%分別接種副豬嗜血桿菌各菌株二級(jí)種子液，設(shè)定攪拌速度為100 r·min-1，37℃培養(yǎng)10 h收獲菌液，活菌計(jì)數(shù)為7.2×109cfu·mL-1，能滿足該菌的抗原生產(chǎn)需要。

表2 副豬嗜血桿菌SYS株在不同血清添加量下培養(yǎng)的活菌濃度cfu·mL-1

表3 副豬嗜血桿菌SYS株在不同NAD濃度下培養(yǎng)的活菌濃度cfu·mL-1

3.4 滅活方法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，在37℃條件下，甲醛溶液終濃度為0.3%時(shí)，滅活24 h可徹底滅活副豬嗜血桿菌各菌株菌液，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 滅活試驗(yàn)結(jié)果

3.5 副豬嗜血桿菌各滅活菌液對(duì)試驗(yàn)豬的安全性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)滅活試驗(yàn)結(jié)果確定菌株菌液的滅活條件后，取滅活徹底的副豬嗜血桿菌各菌株菌液，按4.0 mL·頭-1的劑量頸部肌肉注射5周齡健康易感豬（副豬嗜血桿菌間接血凝效價(jià)≤1∶4）5頭，連續(xù)觀察14 d，試驗(yàn)豬注射部位均未出現(xiàn)炎性反應(yīng)，采食量及精神狀態(tài)正常，均健活。

4 討論

豬副嗜血桿菌只感染豬，可以影響從2周齡～4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5～8周齡的豬，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%。由于各血清型之間無交叉保護(hù)，制備的單苗具有針對(duì)性[3-5]。因此，研制一種防治副豬嗜血桿菌病的安全性好的滅活疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)通過對(duì)制苗工藝的優(yōu)化獲得安全性較好的疫苗，在滅活時(shí)間上，20 h也可以，但考慮到生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)等因素，選擇更為穩(wěn)定的24 h。

[1]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2002.

[2]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

[3]王艷.副豬嗜血桿菌滅活疫苗的研制[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[4]蘇丹萍,王文豪,章勝,等.副豬嗜血桿菌弱毒疫苗的研制[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39（11）:169-173.

[5]張穎.豬副豬嗜血桿菌病診治[J].四川畜牧獸醫(yī),2013,40（8）:54.

Preliminary Establishment of Inactivated Vaccine Against Haemophilus Suis(SYS strain)

CHANG Chao,JIANG Yu,YANG Pengxin

（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

To prepare inactivated vaccine against Haemophilus suis and optimized its production process,the fermentation process and inactivation process were optimized,and the quality of the prepared vaccine was tested,and the immune effect was analyzed in this experiment.The results showed that using TSB medium that containing 10%of newborn calf serum and 15 μg·mL-1NAD to prepare vaccine and 2%～4%medium respectively according to total of two stage seed inoculation of Haemophilus parasuis strains,setting the stirring speed of 100 r·min-1,after 10 h cultured at 37℃,the ideal harvested liquid was obtained;the bacterial fluid could be completely inactivated?with 0.3%formaldehyde inactivated 24 h at 37℃.The inactivated vaccine prepared according to the optimized pro?cess was safe.

inactivated vaccine against Haemophilus suis;production process;inactivated test

S852.61+2；S828

A

1001-0084（2017）10-0035-03

2017-09-16

常超（1985-），男，黑龍江佳木斯人，中級(jí)獸醫(yī)師，主要從事于動(dòng)物生物制品。