汪 峰, 張斌斌, 郭 巍, 高繼學(xué), 強亞勇, 賈軍琪

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院, 陜西 延安, 716000)

siRNA沉默表皮生長因子受體蛋白表達(dá)對腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

汪 峰, 張斌斌, 郭 巍, 高繼學(xué), 強亞勇, 賈軍琪

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院, 陜西 延安, 716000)

目的觀察在siRNA沉默EGFR基因處理后腎癌細(xì)胞的生物學(xué)行為情況。方法將腎癌細(xì)胞株ACHN分為3組，對照組不進(jìn)行任何干預(yù)，陰性對照轉(zhuǎn)染組使用加入非特異性轉(zhuǎn)染試劑及siRNA干預(yù)，觀察組使用加入特性性轉(zhuǎn)染試劑及siRNA干預(yù)，分別檢測3組細(xì)胞的EGFR表達(dá)量、增殖活性、生長曲線、遷移及侵襲活性。結(jié)果經(jīng)siRNA處理72 h后，觀察組細(xì)胞EGFR表達(dá)水平明顯低于陰性對照轉(zhuǎn)染組和對照組; 觀察組細(xì)胞生長活躍能力顯著低于對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組，且在處理48 h后RNAi組細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組(P<0.05); 較空白組和陰性對照轉(zhuǎn)染組，觀察組細(xì)胞生長受到顯著抑制(P<0.05); 12 h時及24 h時觀察組細(xì)胞劃痕距離顯著高于對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組(P<0.05); 12 h時對照組、陰性對照轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。結(jié)論 采用siRNA沉默EGFR蛋白后，可有效改善腎癌細(xì)胞的增殖、生長、遷移及侵襲等生物學(xué)活性。

siRNA; EGFR蛋白; 腎癌細(xì)胞; 生物學(xué)行為

有研究[1-2]結(jié)果表明，在腎癌細(xì)胞中表皮生長因子受體(EGFR)多過度表達(dá)，且其與腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移等諸多過程密切相關(guān)，可作為腎癌患者的重要的治療靶點。RNA干擾(RNAi)可有效控制基因表達(dá)，也在腫瘤治療的基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用[3]。作者采用RNA干擾技術(shù)沉默EGFR基因表達(dá)，觀察在RNA沉默EGFR基因處理后腎癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中人腎細(xì)胞癌細(xì)胞株(ACHN)購自國家典型培養(yǎng)保藏中心(武漢)。RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司(美國)，胎牛血清購自BI公司(以色列), β-actin抗體、兔抗二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、噻唑藍(lán)(MTT)購買自Sigma公司(美國), EGFR抗體購買自CST公司(美國)，轉(zhuǎn)染試劑盒購買自Life公司(美國), RIPA裂解液購買自碧云天公司(上海), Transwell小室購買自Millipore公司(美國), Matrigel膠購買自BD公司(美國)。

1.2 SiRNA的設(shè)計及合成

使用OptiRNAi設(shè)計可特異性沉默EGFR的SiRNA序列，并由上海吉瑪制藥公司合成，其序列表為正義鏈5′-gaaggugagaaaguuaaaauucctt-3′, 陰性對照組5′-uucuccgaacgugucacgutt-3′。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

使用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)ACHN細(xì)胞，將細(xì)胞置于37 ℃, 含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究將細(xì)胞分為3組，即空白對照組、陰性對照轉(zhuǎn)染組(加入非特異性轉(zhuǎn)染試劑及siRNA)、觀察組(加入特異性轉(zhuǎn)染試劑及siRNA)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，使用胰酶消化后將細(xì)胞接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞密度生長致70%左右時，參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后換液，并收集細(xì)胞。

1.4 EGFR Western Blot檢測結(jié)果

使用RNA干擾72 h后，使用磷酸鹽緩沖溶液漂洗細(xì)胞2遍，后收集細(xì)胞使用RIPA裂解液處理細(xì)胞，置于冰上振搖30 min, 后使用Thermo離心機以12 000 r/min離心10 min, 收集上清，使用二喹啉甲酸測定總蛋白后，調(diào)整蛋白濃度至等體積，后加入等體積的上樣緩沖液(2×)沸水浴5 min。后使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用280 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h, 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉2 h, 使用TBST清洗3次，加入EGFR抗體, 4 ℃孵育過夜，使用TBST清洗3次，加入二抗室溫孵育1 h, 使用TBST細(xì)胞曝光顯色。

1.5 生長曲線檢測方法

依照分組對細(xì)胞進(jìn)行處理并接種于24孔板中，每組3復(fù)孔。放入37 ℃, 含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h取3復(fù)孔，進(jìn)行計數(shù)并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 細(xì)胞增殖檢測方法

將細(xì)胞依照分組處理，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/L接種于96孔板中，每孔200 mL, 每組6個復(fù)孔。使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、48 h、72 h及96 h，每孔加入10 μL MTT溶液(5 μg/L), 急性培養(yǎng)4 h, 后加入10 μL二甲基亞砜震蕩10 min, 后再572 nm波長下檢測各孔吸光度值(A), 并計算細(xì)胞增殖抑制率(IR)。

IR(%)=[A對照組-A實驗組]/A對照組×100%。

1.7 遷移能力檢測

將細(xì)胞依照分組處理并接種于24孔板中，培養(yǎng)24后使用10 μL槍頭在細(xì)胞皿中劃1道橫線，每12 h觀察并拍照1次，后使用NIS-ELEMENTS軟件分析各組細(xì)胞遷移差異。

1.8 Transwell實驗檢測

由金斯瑞公司構(gòu)建H2 BmCherry穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，使用無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞10 h, 并使用無血清1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠(1∶8), 每小室鋪膠60 μL, 后將細(xì)胞以5×104/μL的濃度置于小室中，上室加入無血清培養(yǎng)基，下室加入1 mL含血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h, 后取出Transwell小室并使用棉棒擦凈上室細(xì)胞，使用顯微鏡去5個視野，計算視野中穿膜的細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究中使用SPSS 19.0存儲并處理原始數(shù)據(jù)，使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示計量資料，并行方差分析組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western Blot檢測結(jié)果

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)siRNA處理72 h后，觀察組細(xì)胞EGFR表達(dá)水平明顯低于陰性對照轉(zhuǎn)染組和對照組，見圖1。

1：對照組；2：陰性對照轉(zhuǎn)染組；3：觀察組圖1 RNAi72h后不同組EGFR表達(dá)水平

2.2 生長曲線

本研究結(jié)果顯示，觀察組細(xì)胞生長活躍能力顯著低于對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組，且在處理48 h后RNAi組細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，見圖2。

圖2 生長曲線

2.3 MTT檢測結(jié)果

較空白組和陰性對照轉(zhuǎn)染組，觀察組細(xì)胞生長受到顯著抑制(P<0.01), 且隨著作用時間增長，抑制作用也逐漸增加，見表1。

表1 細(xì)胞生長抑制率 %

與觀察組相比, **P<0.01。

2.4 細(xì)胞遷移能力檢測結(jié)果

12、24 h時，觀察組細(xì)胞劃痕距離顯著高于對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組(P<0.05), 但對照組與陰性對照轉(zhuǎn)染組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表2。

表2 細(xì)胞遷移能力檢測結(jié)果 μm

與觀察組相比, *P<0.05, **P<0.01。

2.5 細(xì)胞侵襲能力檢測結(jié)果

本研究結(jié)果顯示, 12 h時對照組、陰性對照轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(322.5±20.0)個和(300.0±16.5)個，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)為(154.5±13.0)個，顯著低于對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。

3 討 論

有大量研究[4-5]指出，在多種腫瘤組織中EGFR常處于高表達(dá)狀態(tài)，如腎癌、直腸癌、肺癌、卵巢癌等，其中在腎癌中50%以上為EGFR高表達(dá)。有學(xué)者研究[6]指出，腎癌細(xì)胞膜中EGFR是重要生物標(biāo)志物，其異常高表達(dá)可作為患者預(yù)后不良的重要評價指標(biāo)。此外，EGFR的高表達(dá)也使其可作為重要的指標(biāo)靶點，進(jìn)行靶向治療[7]。RNA干擾具有高效性、特異性、穩(wěn)定性等諸多優(yōu)點，且目前RNA干擾技術(shù)在卵巢癌、肺癌等諸多腫瘤中的應(yīng)用十分廣泛[8]。采用siRNA技術(shù)干預(yù)腫瘤細(xì)胞后，可有效敲減細(xì)胞EGFR表達(dá)水平改善化療藥物的不敏感效應(yīng)。

免疫治療是現(xiàn)階段臨床中的研究熱點，但腎癌患者采用免疫療法進(jìn)行治療時其臨床有效率偏低，因而其仍無法成為臨床中治療腎癌的有效手段[9]。此外，采用傳統(tǒng)的放療及化療手段進(jìn)行治療，仍存在明顯的敏感性低等現(xiàn)象[10]。有研究[11-12]指出，若腎癌患者不進(jìn)行及時干預(yù)，則有可能向腦部及肺部轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致患者完全喪失最佳的治療時機。目前靶向治療仍是治療晚期腎癌的首選方案，因而尋求有效的靶點也是現(xiàn)階段臨床研究的熱點所在。有研究[13]指出，采用siRNA可有效沉默腎癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)，并可顯著降低腎癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

EGFR通路與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、血管生長因子(VEGF)等通路密切相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在腫瘤細(xì)胞中EGFR常異常高表達(dá)，使EGFR持續(xù)活化，進(jìn)而增強下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，打破正常細(xì)胞的地生理平衡，增強細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[14-16]。此外，其還可以增強VEGF、血管形成素-1(Ang-1)等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)水平，增強腫瘤組織的血管新生能力[17-18]。

本研究結(jié)果顯示，采用siRNA沉默EGFR蛋白后，可有效降低ACHN細(xì)胞的EGFR蛋白水平。MMT和生長曲線結(jié)果顯示，特異性沉默EGFR蛋白后，可有效降低ACHN的細(xì)胞活力。通過遷移和侵襲實驗證明, siRNA沉默EGFR蛋白后可有效降低腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。分析[19-20]認(rèn)為，采用siRNA特異性沉默ACHN細(xì)胞的EGFR蛋白后，可有效抑制EGFR相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，降低腫瘤細(xì)胞的VEGF、TGF、Ang-1的表達(dá)水平，進(jìn)而顯著改善ACHN細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究通過劃痕、侵襲等實驗發(fā)現(xiàn)，采用siRNA沉默EGFR蛋白后，可有效改善腎癌細(xì)胞的增殖、生長、遷移及侵襲等生物學(xué)活性。

[1] Noga Kozer, Dipak Barua, Christine Henderson, et al. Recruitment of the Adaptor Protein Grb2 to EGFR Tetramers[J]. Biochemistry, 2014, 53(16): 2594-2604.

[2] 謝勉, 何朝生, 魏慎海, 等. Notch信號通路體外介導(dǎo)肺癌細(xì)胞表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑獲得性耐藥的分子機制研究[J]. 腫瘤研究與臨床, 2015, 27(5): 298-304.

[3] Azzouz M, Ramsing J, Thomsen H S, et al. Fluctuations in eGFR in relation to unenhanced and enhanced MRI and CT outpatients[J]. European Journal of Radiology, 2014, 83(6): 886-892.

[4] Tingting Zhang, Long Zhang, Tao Zhang, et al. Metformin Sensitizes Prostate Cancer Cells to Radiation Through EGFR/p-DNA-PK_(CS) In Vitro and In Vivo[J]. Radiation Research: Official Organ of the Radiation Research Society, 2014, 181(6): 641-649.

[5] 李建成, 邱子丹, 潘丁龍, 等. siRNA干擾EGFR表達(dá)對食管鱗癌和腺癌細(xì)胞放射敏感性影響[J]. 中華放射腫瘤學(xué)雜志, 2016, 25(1): 76-80.

[6] Gerber N K, Yamada Y, Rimner A, et al. Erlotinib versus radiation therapy for brain metastases in patients with EGFR-mutant lung adenocarcinoma[J]. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics, 2014, 89(2): 322-329.

[7] Wang Y, Zhou J, Qiu L, et al. Cisplatin-alginate conjugate liposomes for targeted delivery to EGFR-positive ovarian cancer cells[J]. Biomaterials, 2014, 35(14): 4297-4309.

[8] 寇哲文, 林水苗, 張興梅, 等. 靶向notch1的siRNA對U87-EGFRv Ⅲ膠質(zhì)瘤細(xì)胞株凋亡和放射敏感度的影響[J]. 腫瘤防治研究, 2016, 43(4): 245-248.

[9] Marya Ahmed, Kazuhiko Ishihara, Ravin Narain, et al. Calcium mediated formation of phosphorylcholinebased polyplexes for efficient knockdown of epidermal growth factor receptors (EGFR) in HeLa cells[J]. Chemical communications, 2014, 50(22): 2943-2946.

[10] D Fatehi, T N Baral, A Abulrob, et al. In Vivo Imaging of Brain Cancer Using Epidermal Growth Factor Single Domain Antibody Bioconjugated to Near-Infrared Quantum Dots[J]. Journal of nanoscience and nanotechnology, 2014, 14(7): 5355-5362.

[11] 胡洋, 張龍, 李旺, 等. TTA1-Tat-PEG-GS NPs結(jié)合siRNA-EGFR轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞抑制EGFR基因表達(dá)的研究[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2016, 13(6): 4-8.

[12] Nataly Kravchenko-Balasha, Jun Wang, Francoise Remacle, et al. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(17): 6521-6526.

[13] Gao L Y, Liu X Y, Chen C J, et al. Core-Shell type lipid/rPAA-Chol polymer hybrid nanoparticles for invivo siRNA delivery[J]. Biomaterials, 2014, 35(6): 2066-2078.

[14] 白璇, 唐慧, 郭強, 等. 大腸癌細(xì)胞FoxQ1與EGFR基因表達(dá)的相關(guān)性[J]. 腫瘤防治研究, 2016, 43(1): 20-24.

[15] Chandra A, Lan S, Zhu J, et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling promotes proliferation and survival in osteoprogenitors by increasing early growth response 2 (EGR2) expression[J]. The Journal of biological chemistry, 2013, 288(28): 20488-20498.

[16] 褚晗, 于德新, 張志強, 等. siRNA沉默腎癌細(xì)胞EGFR基因?qū)Ψ暖熋舾行杂绊懙难芯縖J]. 臨床泌尿外科雜志, 2013, 232(4): 246-250.

[17] 許洪禮, 胡萍, 張振, 等. siRNA干擾FLOT2基因表達(dá)對腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2015(23): 3376-3379.

[18] 印重任, 李遠(yuǎn)偉, 吳萬瑞, 等. 靶向siRNA干擾hIAP-2聯(lián)合姜黃素抑制腎癌GRC-1細(xì)胞增殖的實驗研究[J]. 腫瘤藥學(xué), 2017, 7(1): 33-37.

[19] 韓慶杰. siRNA沉默DAD1基因表達(dá)對腎癌細(xì)胞A498增殖與侵襲能力的影響[D]. 南華大學(xué), 2015.

[20] 陳俊明, 吳登爽, 王志向, 等. RNA干擾p38基因?qū)δI癌786-O細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及對舒尼替尼的增敏作用[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2016, 37(7): 799-804.

EffectofsiRNAsilencingepidermalgrowthfactorreceptorproteinexpressiononbiologicalbehaviorofrenalcellcarcinomacells

WANGFeng,ZHANGBinbin,GUOWei,GAOJixue,QIANGYayong,JIAJunqi

(AffiliatedHospitalofYan′anUniversity,Yan′an,Shaanxi, 716000)

ObjectiveTo explore the biological behavior of renal cell carcinoma cases after treatment with siRNA silencing epidermal growth factor receptor (EGFR) gene.MethodsRenal cell carcinoma cell line ACHN were divided into three groups, the control group without any intervention, negative control transfection group by adding the nonspecific transfection reagent and siRNA interference, and the observation group adding transfection reagent and siRNA interference. Cells with EGFR expression and proliferation activity, growth curve, migration and invasion activity were detected in three groups.ResultsAfter 72 h of siRNA treatment, the observation group had significantly lower EGFR expression levels, and cell growth activity ability, and cell number of RNAi group after 48 h than negative control transfection group and control group (P<0.05). Compared with the blank control group and negative control transfection group, the observation group was significantly inhibited (P<0.05), and cell scratch distance after 12 h and 24 h was significantly higher than that of the control group and negative control transfection group(P<0.05). The control group and negative control transfection group showed no significant difference in the cell membrane at 12 h (P>0.05). The observation group had significantly lower transmembrane cell number than the control group and negative control transfection group(P<0.05).ConclusionThe proliferation, growth, migration and invasion of renal carcinoma cells can be effectively improved by using siRNA EGFR protein.

siRNA; EGFR protein; renal cell carcinoma; biological behavior

R 736.6

A

1672-2353(2017)19-103-04

10.7619/jcmp.201719029

2017-05-19

賈軍琪