章曉燕 李彥玲 吳艷麗 吳云霞

華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院中藥系，武漢 430030

10.3969/j.issn.1674-4616.2017.03.005

·實驗研究·

*國家自然科學基金資助項目(No.81373873)

△通信作者，Corresponding author，E-mail：wuyunxia@hust.edu.cn

#共同為第一作者

DS-1-47促著床的靶點分子篩選研究*

章曉燕#李彥玲#吳艷麗 吳云霞△

華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院中藥系，武漢 430030

目的研究篩選DS-1-47促著床的分子靶點。方法采用皮下注射吲哚美辛的方法建立胚泡著床障礙動物模型，動物隨機分為正常組(N)、模型組(M)和中藥組(Z)，運用蛋白組學激光捕獲顯微切割技術(shù)-二維電泳-質(zhì)譜(LCM-DE-MS)的技術(shù)路線研究分析DS-1-47作用前后子宮組織中蛋白分子的變化，篩選得到DS-1-47促進著床的關(guān)鍵分子，從而深入闡明其發(fā)揮作用的分子機制。結(jié)果Z組能使11種蛋白質(zhì)的表達發(fā)生明顯改變，其中3種蛋白質(zhì)的表達M組較N組明顯下調(diào)，Z組較M組明顯上調(diào)，這3種蛋白質(zhì)經(jīng)鑒定分別為肝羧酸酯酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑、載脂蛋白A-Ⅰ；另外8種蛋白質(zhì)的表達M組較N組明顯上調(diào)，Z組較M組明顯下調(diào)，蛋白質(zhì)分別為血液結(jié)合素、激肽原-1、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3K、α-1-抗胰蛋白酶1-3、結(jié)合珠蛋白、延伸因子-1-Δ、膜聯(lián)蛋白A5、血清淀粉樣蛋白P成分。結(jié)論血液結(jié)合素、結(jié)合珠蛋白、載脂蛋白A-Ⅰ、膜聯(lián)蛋白A5、激肽原-1、延伸因子-1-Δ、絲氨酸蛋白酶抑制劑等可能是復(fù)方DS-1-47促進著床的重要靶點。

DS-1-47；著床；蛋白質(zhì)組學；激光捕獲顯微切割技術(shù)-二維電泳-質(zhì)譜

DS-1-47是從臨床促孕復(fù)方中篩選得到的具有促進胚胎著床作用的中藥復(fù)方有效組分[1]，復(fù)方由黃芪、黃芩、白術(shù)和續(xù)斷組成，這四味中藥是臨床常用的妊娠安全用藥。黃芪、白術(shù)、續(xù)斷三藥君臣相配，使胎元穩(wěn)固，胎有所系，胎有所長，還可安胎、抑制宮縮，從母體與胚胎雙方面保證妊娠順利進行。黃芩涼血安胎，既可佐助白術(shù)，降低自然流產(chǎn)小鼠蛻膜的凋亡反應(yīng)，具有一定保胎作用[2]；亦可反佐白術(shù)之溫，調(diào)和藥性，與白術(shù)相反相成。4味中藥，寒溫并用，補瀉兼顧，充分協(xié)調(diào)臟腑功能，使機體處于最佳受孕狀態(tài)。

蛋白質(zhì)組學是對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的大規(guī)模研究，包括蛋白質(zhì)的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白的相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細胞代謝等過程的整體而全面的認識。蛋白質(zhì)組學已成為生物、臨床和藥學研究不可或缺的重要組成部分。蛋白組學激光捕獲顯微切割技術(shù)-二維電泳-質(zhì)譜(LCM-DE-MS)是由馬克·威爾金斯提出的一條經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學研究的技術(shù)路線[3]。質(zhì)譜在解決重要生物學問題中是必不可少的[4]。將質(zhì)譜應(yīng)用于深入分析蛋白質(zhì)組學、生物分子復(fù)合物以及翻譯后修飾的識別與定位等，有助于發(fā)現(xiàn)藥物療效相關(guān)分子。目前，此技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)針灸經(jīng)絡(luò)的作用基礎(chǔ)研究、中醫(yī)療效評價、中藥鑒定等領(lǐng)域，是當前中醫(yī)領(lǐng)域中的研究熱點[5]。

中藥的化學成分復(fù)雜，而臨床上又多以復(fù)方為主，致使其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制的研究非常困難。這嚴重阻礙了中醫(yī)藥走向世界的步伐。因此，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，借助現(xiàn)代生物醫(yī)學的研究方法，通過多視角切入、多技術(shù)聯(lián)合輔助、多學科滲透交叉，對中藥進行系統(tǒng)全面的研究勢在必行。中醫(yī)藥的發(fā)展要取得突破性進展必須依靠系統(tǒng)生物學技術(shù)[6]，蛋白質(zhì)組學作為系統(tǒng)生物學的組成部分，與中藥的多成分、多靶點作用、多代謝途徑的特點相契合，是研究中醫(yī)藥作用機制的強有力工具[7]。

本實驗采用皮下注射吲哚美辛的方法建立胚胎著床障礙小鼠，吲哚美辛是一種前列腺素抑制劑，前列腺素在胚胎著床以及子宮蛻膜化過程中發(fā)揮重要作用[8-9]，既往已有研究[10]發(fā)現(xiàn)前列腺素抑制劑吲哚美辛的抗著床作用，并且其抑制子宮血管滲透性和子宮內(nèi)膜的蛻膜化有關(guān)。本研究運用LCM-DE-MS技術(shù)路線，分析DS-1-47作用前后子宮組織細胞中蛋白質(zhì)表達差異的變化，以期篩選得到DS-1-47促進胚泡著床的關(guān)鍵作用分子，從而為深入闡明其藥效作用的分子調(diào)控機制和作用靶點打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康清潔級昆明小鼠，雌鼠未交配，雄性證明有生育能力，體重(25.0±3.0) g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心提供。飼養(yǎng)于室溫20～22 ℃，相對濕度40%～60%的動物房內(nèi)，自由攝食、飲水，光照12 h，黑暗12 h。

1.2 藥材及藥物制備

黃芪、人參、白術(shù)、續(xù)斷四味藥材均購置于安徽亳州，由華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學系汪建平博士鑒定。上述藥材按比例混合，用60%的乙醇加熱回流提取2次，每次2 h。40 ℃真空濃縮獲得粗提物。然后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，40 ℃真空濃縮乙酸乙酯部分，得到的粗提物進行硅膠柱層析，用二氯甲烷和甲醇進行梯度洗脫(CH2Cl2：MeOH 40：1→1：1)。收集合并40：1，38：1，36：1，28：1，16：1，12：1，2：1餾份，濃縮至25 mg/ml，即促孕有效活性成分DS-1-47。

1.3 儀器與試劑

冷凍離心機(湘儀H5050R)，超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，JY96-Ⅱn)，等電聚焦儀(GE ETTAN IPGphor3)，掃描儀(MICROTEK Scan Maker i800)，真空干燥儀，水浴鍋，質(zhì)譜儀(美國ABI4700 MALDI TOF)。

吲哚美辛、去離子水、胎牛血清、甲醇、丙酮、乙醇、冰醋酸、甲醛、硝酸銀、Na2EDTA?H2O、硫代硫酸鈉、無水乙酸鈉、磷酸、鹽酸，以上化學試劑皆為分析純試劑，購自廣州化學試劑廠，溴酚藍(Bio Basic Inc)，Tris-base(Amresco)，丙烯酰胺(Amresco)，N，N’-methylenebisacrylamide(Sigma)，胰酶(Promega V5280)，胰酶重溶液(Promega V530)，碳酸氫銨(Sigma A6141)，ZipTipC-18微量層析柱(Millipore ZTC18 M096)，三氟乙酸(GE Health Care)。

1.4 實驗方法

1.4.1 建立小鼠胚泡著床障礙模型 將體重(40.0±2.0) g的雌鼠按照雌雄1：1比例合籠，次日晨8：00檢查雌鼠陰道，發(fā)現(xiàn)陰栓的小鼠為造模成功小鼠，計為妊娠第1天。將明確有陰栓的小鼠隨機分為正常組(N)、模型組(M)和中藥組(Z)。M組和Z組分別在妊娠第3天和第4天的晨9：00和16：00于頸背部皮下注射吲哚美辛溶液，N組在相同時間注射麻油，3組均連續(xù)給藥至第5天。于妊娠第5天頸椎脫臼處死小鼠，剖腹，取出小鼠子宮，置于液氮中保存。

1.4.2 雙向凝膠電泳(2-DE)實驗

1.4.2.1 蛋白質(zhì)的提取和純化 取小鼠子宮組織0.05～0.10 g，加入裂解液1.0 ml(40.0 mmol/L Tris、8.0 mol/L尿素、2.0 mol/L硫脲、3.0 mmol/L EDTA、50.0 mmol/L DTT、1.0 mmol/L PMSF和5.0 mg/ml亮肽酶素)，超聲波提取，充分懸浮，12 000 r/min離心20 min，去除沉淀，收集蛋白質(zhì)上清液。以牛血清蛋白為標準，用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。

1.4.2.2 雙向凝膠電泳 吸取適量樣品溶液，加入水化液(7.0 mol/L尿素、2.0 mol/L硫脲、2% CHAPS、50.0 mmol/L DTT和0.4% IPG緩沖液)，放入標準型膠條槽中，為確保樣品充分進入膠條，不要加過量的水化液。等電聚焦程序為4個階段，第1階段：500 V 1 h，第2階段：1 000 V 1 h，第3階段：10 000 V 3 h，第四階段：10 000 V 4 h，整個聚焦過程所用總電壓約60 kV/h。等電聚焦后，將膠條放入平衡A液[6.0 mol/L尿素、29.3%甘油、2% SDS、75.0 mmol/L Tris-HCl(pH=8.8)，2%(w/v)DTT]中平衡15 min，再將膠條放入平衡B液[6.0 mol/L尿素、29.3%甘油、2% SDS、75.0 mmol/L Tris-HCl(pH=8.8)，2.5%碘乙酰胺]。將IPG膠條轉(zhuǎn)移至12%的SDS-PAGE凝膠上進行二維電泳。第二向電泳的程序為2個階段，第1階段：2 W/gel，60 min，第2階段：17 W/gel直到溴酚藍跑到底，約4.5 h。取出膠條進行考染，用Image Master 2D Platinum 5.0(GE)軟件對染色的凝膠進行掃描和分析。

1.4.2.3 膠條酶解和質(zhì)譜分析 選取圖像分析得到的差異蛋白質(zhì)點，從膠條上取下這些點，轉(zhuǎn)入離心管中反復(fù)漂洗，加入脫色液進行脫色，顏色脫去后加水沖洗停止反應(yīng)，再加入50%乙腈脫水，而后在蛋白質(zhì)樣品中加入胰酶37 ℃消化過夜。以2.5%三氟乙酸溶解肽段，用50%乙腈-0.5%三氟乙酸濃縮除鹽，用等體積飽和基質(zhì)混勻，在點靶儀上點樣，風干后進行質(zhì)譜分析。利用ABI4700 MALDI TOF質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。UV波長為355 nm，重復(fù)速率為200 Hz，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500 Da，掃描質(zhì)量范圍為700～3 200 Da，收集信號。胰酶自切峰為內(nèi)標校正質(zhì)譜儀。所有實驗樣品的質(zhì)譜圖均用默認模式獲得。

1.4.2.4 蛋白質(zhì)鑒定及數(shù)據(jù)庫查詢 利用Matrix Science公司的Mascot軟件搜索IPI-mouse數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，查詢其功能，明確鑒定蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。參數(shù)設(shè)置如下：物種來源選擇為小家鼠；肽質(zhì)量控制在800～4 000 Da；肽片段分子量最大容許誤差為±50 ppm；酶解片段不完全選擇為1～2個；固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化，可變修飾為蛋氨酸氧化。

2 結(jié)果

2.1 3組的二維凝膠電泳

用分析軟件Image Master 2D Platinum 5.0進行差異表達分析，得到相關(guān)數(shù)據(jù)。對比3組的分析數(shù)據(jù)，N組與M組比較，M組有29種蛋白質(zhì)的含量降低，有31種蛋白質(zhì)的含量升高；M組與Z組比較，Z組有30種蛋白質(zhì)的含量升高，標記為A1～A30，有25種蛋白質(zhì)的含量降低，標記為B1～B25。綜合分析N組、M組和Z組的數(shù)據(jù)，有15種蛋白質(zhì)是3組共有，其中12種蛋白質(zhì)Z組含量比M組低，剩下3種蛋白質(zhì)Z組的含量比M組高，這15種蛋白質(zhì)很可能就是DS-1-47促進小鼠胚泡著床的作用靶點。見圖1～2。

N：正常組；M：模型組；Z：中藥組圖1 二維凝膠電泳圖

2.2 3組的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

用質(zhì)譜分析鑒定被胰酶消化后的蛋白質(zhì)點，其中B21所對應(yīng)的蛋白質(zhì)點沒有檢測出。通過序列相似性，M組上調(diào)但Z組下調(diào)的蛋白質(zhì)被鑒定為血液結(jié)合素、激肽原-1(2個點重復(fù))、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3K(3個點重復(fù))、α-1-抗胰蛋白酶1-3、結(jié)合珠蛋白、延伸因子-1-Δ(2個點重復(fù))、膜聯(lián)蛋白A5、血清淀粉樣蛋白P成分；M組下調(diào)但Z組上調(diào)的蛋白質(zhì)被鑒定為肝羧酸酯酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑、載脂蛋白A-Ⅰ。見表1。

N：正常組；M：模型組；Z：中藥組 注：標記為A類和B類的點是3組樣本共有的含量改變的15種蛋白質(zhì)，A類為Z組上調(diào)蛋白質(zhì)，B類為Z組下調(diào)蛋白質(zhì)。圖2 3組中差異表達的蛋白質(zhì)點

編號蛋白質(zhì)名稱分子量PI等電點序列覆蓋率(%)肽匹配數(shù)匹配分數(shù)A3肝羧酸酯酶N614185.101610259A6絲氨酸蛋白酶抑制劑A3K470215.054116369A28載脂蛋白A-Ⅰ305695.64277170B2血液結(jié)合素520497.923313238B3激肽原-1741406.05116140B4激肽原-1741406.051310176B5絲氨酸蛋白酶抑制劑A3K470215.053816347B8絲氨酸蛋白酶抑制劑A3K468595.592713216B9α-1-抗胰蛋白酶1-3459665.25198154B12結(jié)合珠蛋白392415.88197110B14延伸因子-1-Δ313884.9127694B15延伸因子-1-Δ313884.914130B16膜聯(lián)蛋白A5357874.8318685B17血清淀粉樣蛋白P成分264015.98266257

注：將蛋白的分子量、PI等電點、序列覆蓋率、肽匹配數(shù)以及匹配分數(shù)5個指標與IPI-mouse數(shù)據(jù)庫相比較，尋找出匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，鑒定出差異表達蛋白的種類。

3 討論

在前期研究[11]中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DS-1-47具有良好的促胚胎著床效果，本研究運用LCM-DE-MS技術(shù)路線對差異表達的蛋白進行篩選，以期找到其作用的分子靶點。

胚泡的植入過程是妊娠的關(guān)鍵步驟，這是一個非常復(fù)雜的過程，其調(diào)控機制既復(fù)雜又微妙，涉及多種基因、生物分子、細胞因子和信號通路。成功的著床依賴于胚胎和子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育、識別和容受，亦與子宮內(nèi)膜微環(huán)境、激素水平及免疫反應(yīng)相關(guān)，這一過程與蛋白質(zhì)的表達密切相關(guān)。已有研究[12]發(fā)現(xiàn)，胚胎正常發(fā)育和非正常發(fā)育時，子宮內(nèi)膜中蛋白質(zhì)表達有很大差異。

結(jié)合珠蛋白主要存在于血漿中，在腎臟、肺和其他器官中也有存在，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和血管生成作用。妊娠涉及免疫耐受和血管生成，而這正好與結(jié)合珠蛋白的作用相關(guān)。Herrler等[13]測定圍胚胎植入期結(jié)合珠蛋白表達的變化，結(jié)果表明，受精后第5～6天，結(jié)合珠蛋白在子宮內(nèi)表達量升高并且達峰值；研究[14]也表明懷孕婦女血清的結(jié)合珠蛋白水平明顯高于未懷孕婦女，故結(jié)合珠蛋白被認為是預(yù)測著床成敗的潛在標志。但本實驗中N組和Z組結(jié)合珠蛋白的表達并未升高，而M組的結(jié)合珠蛋白表達很高，這種現(xiàn)象說明吲哚美辛使結(jié)合珠蛋白的表達升高，但DS-1-47降低了結(jié)合珠蛋白的表達。前期研究[11]中發(fā)現(xiàn)促孕復(fù)方是通過抑制NF-κB誘導(dǎo)免疫耐受，這可能是NF-κB在誘導(dǎo)免疫耐受占更主導(dǎo)地位，結(jié)合珠蛋白的作用被抵消。

膜聯(lián)蛋白是一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)，涉及多種細胞及細胞生長、膜融合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。膜聯(lián)蛋白A5是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，是磷脂酶A2和蛋白激酶C內(nèi)源性抑制物，抑制鈣離子通道的活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控炎癥及細胞的生長和分化。活化的磷脂酶A2水解甘油磷脂，產(chǎn)生花生四烯酸，具有促進細胞增殖的作用，也可活化蛋白激酶，導(dǎo)致細胞增殖。Karube等[15]發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，子宮內(nèi)膜的膜聯(lián)蛋白A5的表達受到抑制。更重要的是，膜聯(lián)蛋白A5和磷脂酰絲氨酸結(jié)合可能妨礙吞噬細胞對凋亡細胞的識別和結(jié)合，從而抑制細胞的凋亡[16]。胚胎著床包括定位、黏附和植入，本研究中，Z組膜聯(lián)蛋白A5呈低表達，它在一定程度上促進了細胞的凋亡。從而有利于胚胎的黏附和著床，為胚胎著床提供了適宜的內(nèi)部環(huán)境。

載脂蛋白在肝臟中合成。它是血漿脂蛋白的重要組成部分。載脂蛋白A-Ⅰ的主要作用是促進脂質(zhì)運輸，穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)酶的活性，并使血漿脂蛋白與細胞表面受體結(jié)合。研究[17]發(fā)現(xiàn)，懷孕期間載脂蛋白A-Ⅰ水平升高。從本研究中也可看到Z組的載脂蛋白A-Ⅰ的表達高于M組，表明DS-1-47可以上調(diào)載脂蛋白A-Ⅰ的表達從而為胚胎著床及發(fā)育提供足夠的物質(zhì)供應(yīng)。

血液結(jié)合素是一種糖蛋白，主要在肝臟中合成，是一種急性期反應(yīng)蛋白。此外，在免疫細胞、骨骼肌細胞、視網(wǎng)膜感光細胞和神經(jīng)節(jié)細胞也有少量的合成[18]。血紅素-血液結(jié)合素復(fù)合物誘導(dǎo)的淋巴細胞HO-1激活能抑制自身免疫反應(yīng)，限制T細胞活化[19]。此外，它還具有抗凋亡和器官保護功能[20]。然而，與M組相比，DS-1-47下調(diào)血液結(jié)合素的表達，這可能與M組中強烈的免疫反應(yīng)有關(guān)。

絲氨酸蛋白酶抑制劑是維持動物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的重要因素。一旦平衡失調(diào)，就會導(dǎo)致各種疾病。絲氨酸蛋白酶抑制劑還參與免疫反應(yīng)，對細胞遷移和分化、細胞基質(zhì)的重構(gòu)、激素生成和運輸及其他重要的生理生化功能具有重要影響[21]。另外，它還具有抗血管生成的作用。血管的生成發(fā)生在著床和胎盤形成的早期。子宮內(nèi)豐富的血管生成能為胚胎植入提供充足的血液供應(yīng)。一旦血管生成出現(xiàn)障礙，胚胎著床以及胎盤的發(fā)育都會受到影響，更有甚者造成妊娠終止[22]。

激肽原是一種多功能的單鏈糖蛋白，主要由肝臟合成，在其他組織中也有少量表達[23]，參與血液的凝血反應(yīng)。有研究[24]表明胎盤組織中激肽原的低表達有可能是子癇前期發(fā)生的重要原因。目前，還沒有研究證明其是否在胚泡著床過程中發(fā)揮作用。

此外，延伸因子-1-Δ、肝羧酸酯酶、血清淀粉樣蛋白P成分等因子在胚胎著床中的重要性有待進一步研究證明。

根據(jù)血液結(jié)合素、結(jié)合珠蛋白、載脂蛋白A-Ⅰ、膜聯(lián)蛋白A5、激肽原-1、延伸因子-1-Δ、絲氨酸蛋白酶抑制劑的功能，它們在妊娠期間發(fā)揮著重要作用，是妊娠過程中必不可少的蛋白質(zhì)，推測血液結(jié)合素、結(jié)合珠蛋白、載脂蛋白A-Ⅰ、膜聯(lián)蛋白A5、激肽原-1、延伸因子-1-Δ、絲氨酸蛋白酶抑制劑等可能是復(fù)方DS-1-47促進著床的重要分子靶點，后期需進一步研究。

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StudyandScreenoutPossibleMolecularTargetsofDS-1-47PromotingEmbryoImplantation*

ZHANG Xiaoyan#，LI Yanling#，WU Yanli，et al

DepartmentofTraditionaryChineseMedicine，SchoolofPharmacy，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo study and screen out possible molecular targets of DS-1-47 promoting embryo implantation.MethodsSubcutaneous injection of indomethacin was used to establish the model of embryo implantation dysfunction.Animals were randomly divided into normal group(N)，model group(M)，and traditional Chinese medicine group(Z)；Using the technique of proteomics laser capture microdissection-double dimension electrophoresis-mass spectum(LCM-DE-MS) to analyze the protein molecules that were regulated by DS-1-47 in uterine tissue，and to screen the key molecules in promoting implantation，so as to further clarify the molecular mechanism and function targets of the drug.ResultsTotally there were 11 proteins expression was regulated obviously，including 8 proteins which were up-regulated in M group but down-regulated in Z group and were identified as hemopexin，kallikrein-1，serine protease inhibitor A3K，α-1-antitrypsin1-3，haptoglobin，elongation factor-1-Δ，membrane associated protein A5，serum amyloid P-component；3 proteins which were down-regulated in M group but up-regulated in the Z group and were identified as liver acid esterase，serine protease inhibitor，and apolipoprotein A-Ⅰ.ConclusionHemopexin，haptoglobin，serine protease inhibitor，apolipoprotein A-Ⅰ，kallikrein-1，elongation factor-1-Δ，and membrane associated protein A5 may be important targets for DS-1-47 to promote implantation.

DS-1-47；implantation；proteomics；laser capture microdissection-double dimension electrophoresis-mass spectum(LCM-DE-MS)

2017-03-01)