張曉冬，尹彥超，周姍，馬永生，胡婷，高智強，劉穎

北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100102

光果甘草查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及序列分析

張曉冬，尹彥超，周姍，馬永生，胡婷，高智強，劉穎

北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100102

目的：對光果甘草黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶查爾酮異構(gòu)酶（CHI）進行基因克隆和序列分析。方法：取新鮮光果甘草主根，立即投入液氮，作為提取RNA的植物材料；用植物RNA提取試劑盒提取光果甘草總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對其逆轉(zhuǎn)錄得cDNA；根據(jù)文獻報道的烏拉爾甘草CHI序列設(shè)計特異性引物，擴增光果甘草CHI基因并測序；用生物信息學(xué)軟件對所得序列進行分析。結(jié)果：擴增得到22條光果甘草CHI基因cDNA序列，其編碼區(qū)全長為690bp，編碼229個氨基酸殘基。DNAMAN比對表明22條光果甘草cDNA序列間存在16個變異位點，一致性為99.67％，可分為7種單倍型，其中單倍型1為主流單倍型，所占比重為45.5％；氨基酸序列間存在10個變異位點，一致性為99.38％。生物信息學(xué)分析表明光果甘草CHI基因編碼蛋白為穩(wěn)定性親水蛋白，相對分子質(zhì)量為24 000，等電點為5.56～6.76，不含信號肽，無跨膜區(qū)，保守結(jié)構(gòu)域包含一個查爾酮超家族結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)卷曲為主。MEGA 5.0同源性分析顯示光果甘草7種CHI單倍型間親緣關(guān)系良好且與同屬植物烏拉爾甘草的進化關(guān)系最近，與蕨類植物香鱗毛蕨的進化關(guān)系最遠。結(jié)論：克隆了光果甘草CHI基因并對其進行了序列分析，為進一步探究CHI基因?qū)Ω什蒈丈锖铣傻姆肿诱{(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

光果甘草；查爾酮異構(gòu)酶；甘草苷；克??；生物信息學(xué)分析

甘草是我國最常用的大宗藥材之一，素有“國老”、“十方九草”之稱，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調(diào)和諸藥等作用[1]。光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）為《中國藥典》規(guī)定的甘草藥材三基原之一[1]。本課題組前期對全國四大藥材市場中的甘草藥材進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)光果甘草占有30％左右的市場份額[2]，因此光果甘草的質(zhì)量優(yōu)劣對于保證甘草藥材的藥效及安全用藥具有重要意義。

2015版《中國藥典》明確規(guī)定栽培甘草的檢測指標(biāo)為甘草酸含量不低于2.0％、甘草苷含量不低于0.5％[1]。大量藥理學(xué)研究表明，甘草苷具有抗癌[3]、抗糖尿病[4]、抗病毒[5]、抗抑郁[6]等多種藥理活性，是一種極具開發(fā)潛力的黃酮類化合物。但本課題組前期研究顯示栽培甘草中甘草苷的含量普遍偏低[7]。因此，對甘草苷生物合成途徑開展相關(guān)研究，對于揭示甘草苷生物合成的分子機制，提高栽培甘草的甘草苷含量具有重要意義。

在甘草苷的生物合成途徑中，查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI，EC5.5.1.6）是最先被認識的類黃酮物質(zhì)合成相關(guān)酶[8]，其催化分子內(nèi)的環(huán)化反應(yīng)，使雙環(huán)的查爾酮轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)活性的三環(huán)（2S）-黃烷酮[9]，再進一步反應(yīng)生成甘草苷，是甘草苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。1987年，研究者利用抗體技術(shù)首次從法國豌豆（Pisum sativum L.）中分離得到 CHI基因[10]，隨后陸續(xù)從矮牽牛（Petunia hybrida Vilmorin.）[11]、菜豆（Phaseolus vulgaris L.）[12]、玉米（Zea mays）[13]等植物中克隆得到該基因。到目前為止，GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊1164條植物CHI DNA序列及278條cDNA序列。但尚未見光果甘草CHI基因的相關(guān)研究報道。本論文是首次對光果甘草CHI基因進行克隆及生物信息學(xué)分析的研究報道。這將為進一步探究CHI對甘草苷生物合成的分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)，并為篩選優(yōu)良基因以及高品質(zhì)甘草的分子育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

取2年生新鮮光果甘草主根，迅速置于液氮中凍存?zhèn)溆?。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pMD-19T載體、ESPY spin植物RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、DL2000核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、M-MLV（Rnase H-）等購于北京博邁德生物技術(shù)有限公司；LA-Taq DNA聚合酶、oligo（dT）等購于TaKaRa公司。1-13000型離心機（Sigma公司）；TC-3000 PCR擴增儀（Techne公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；BG-gdsAUTO510型凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）；酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司）。

1.2 光果甘草RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

取光果甘草主根，液氮中充分研磨后，采用ESPY spin植物快速提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用酶標(biāo)儀測定RNA濃度，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以oligo（dT）為引物對所提總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.3 光果甘草CHI擴增及測序

根據(jù)文獻報道的烏拉爾甘草CHI基因序列[14]，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計上游引物GF（5′-ATGGCGGGAGCAGCACCAGTA-3′）、下游引物 GR（5′-TCAGTTTCCGTTTCCAAT-3′）。 50μL PCR擴增體系包括2.0μL模板 cDNA、2.0μL正向引物（5μmol/L）、2.0μL 反向引物（5μmol/L）、5.0μL 10×緩沖液、5.0μL dNTP（2.5mmol/L）、1.0μL LA-Taq DNA 聚合酶、33.0μL無 RNase的水。PCR 擴增程序：95℃ 2min；95℃ 20s，58℃30s，72℃ 45s（35個循環(huán)）；72℃ 5min，4℃保存。1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果，采用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行膠回收純化。將膠回收產(chǎn)物與pMD-19T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂于含50 mg/L氨芐西林（Amp）的LB培養(yǎng)基平板上，于37℃倒置培養(yǎng)12h；隨機挑取單克隆，接種于含50 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min條件下培養(yǎng)12h；對菌液進行PCR擴增，1.0％瓊脂糖凝膠電泳驗證，將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 光果甘草CHI生物信息學(xué)分析

用DNAMAN對所得序列進行比對分析；用Editseq將其翻譯成氨基酸序列；用在線工具Prot?Param分析氨基酸序列的理化性質(zhì)；用DNASTAR 7.0及SOPMA構(gòu)建及分析其二級結(jié)構(gòu)；用Swiss-Model構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)；用NCBI CDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域；用SiganalP 4.1 Server預(yù)測信號肽；用TMHMM Server 2.0預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；用MEGA5.0將所得光果甘草CHI與從NCBI數(shù)據(jù)庫查找的其他物種CHI進行同源比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 光果甘草CHI的克隆及序列分析

PCR擴增結(jié)果如圖1，得到長度約690bp的序列，與目標(biāo)條帶長度一致，條帶清晰明亮，可用于后續(xù)實驗。

共獲得22條光果甘草CHI基因cDNA序列，測序結(jié)果顯示編碼區(qū)全長690bp。DNAMAN比對分析結(jié)果顯示22條cDNA序列中存在16個變異位點，可分為7種單倍型，其一致性為99.67％（表1）。其中單倍型1的序列數(shù)量最多，為10條，在全部單倍型數(shù)量中占比45.5％，為主流單倍型，其他各單倍型均為2條，占比9.1％。cDNA序列編碼229個氨基酸殘基，氨基酸序列一致性為99.38％，存在10個變異位點（表2）。在GenBank對所得序列進行注冊，序列登錄號列于表3中。

2.2 光果甘草CHI編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)分析

圖1 光果甘草CHI擴增結(jié)果

表1 光果甘草CHI基因cDNA序列變異位點統(tǒng)計表

表2 光果甘草CHI氨基酸序列變異位點統(tǒng)計表

用在線工具ProtParam對7種光果甘草CHI基因單倍型編碼氨基酸序列進行分析，結(jié)果見表3。7種單倍型編碼氨基酸序列長度均為229個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為24 000；理論等電點為5.56～6.76，單倍型5等電點最大為6.76；半衰期均為30h；不穩(wěn)定系數(shù)為31.91～34.55，均小于40，說明光果甘草CHI為穩(wěn)定性蛋白，尤以單倍型5的不穩(wěn)定系數(shù)最小，為31.91；總平均親水性為-0.112～-0.047，均為負值且介于-2.0～2.0，說明光果甘草CHI為親水性蛋白。

2.3 光果甘草CHI的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)表3中的統(tǒng)計結(jié)果，7種光果甘草CHI基因單倍型編碼氨基酸序列的性質(zhì)較為接近，因此選取主流單倍型1及變異位點最多的單倍型5為目標(biāo)序列，用軟件DNASTAR7.0和ExPASy對其二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如圖2。單倍型1編碼氨基酸序列中α螺旋占34.06％，β轉(zhuǎn)角占11.79％，延長鏈占21.40％，無規(guī)卷曲占32.75％；單倍型5中α螺旋占32.75％，β轉(zhuǎn)角占12.23％，延長鏈占21.40％，無規(guī)卷曲占33.62％。說明光果甘草CHI二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)卷曲為主。用在線軟件Swiss-Model構(gòu)建光果甘草CHI蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型如圖3，單倍型1與單倍型5的三級結(jié)構(gòu)相同，說明不同單倍型光果甘草CHI三級結(jié)構(gòu)無明顯差異。

2.4 光果甘草CHI信號肽、保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

圖2、3結(jié)果顯示光果甘草中不同CHI單倍型編碼氨基酸序列在二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)上均差異較小，因此在后續(xù)的信號肽、保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測中僅對主流單倍型，即單倍型1進行相關(guān)分析。用在線預(yù)測軟件SignalP 4.1 Server進行信號肽預(yù)測，結(jié)果如圖4，S值較低，說明光果甘草CHI結(jié)構(gòu)中不含信號肽。用NCBI CDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖5，顯示光果甘草CHI包含一個查爾酮超家族結(jié)構(gòu)域。用TMHMM Server 2.0進行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果如圖6，顯示該蛋白存在于膜外且無跨膜區(qū)。

表3 光果甘草CHI基因編碼氨基酸理化性質(zhì)分析表

圖2 光果甘草CHI二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖3 光果甘草CHI三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 CHI同源性分析

光果甘草為豆科甘草屬植物。按照親緣關(guān)系遠近，分別從NCBI數(shù)據(jù)庫中挑選出21個物種的23條CHI序列，用MEGA 5.0將這23條序列與本研究擴增獲得的7條光果甘草CHI序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖7。所有30條CHI序列聚為3大支，其中蕨類植物香鱗毛蕨（Dryopteris fragrans）單獨聚為一支，與光果甘草進化距離最遠；豆科植物，包括豌豆、綠豆（Vigna radiata）、菜豆、大豆（Glycine max）及烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis），與本研究擴增獲得的7條光果甘草CHI序列聚為一支，且烏拉爾甘草與光果甘草進化距離最近；其余植物聚為一大支，并依分類地位的不同，同科植物聚為相同的小支。

3 討論

甘草素有“國老”之譽，國內(nèi)外均有需求，由于過度采挖，野生資源日益匱乏，國務(wù)院已明令禁止采挖野生甘草，因此栽培甘草成為商品甘草的主流產(chǎn)品。栽培甘草中甘草苷含量差異十分顯著[8]，而功能基因的多態(tài)性對于調(diào)控產(chǎn)物的合成具有明確的影響。黃酮類化合物是廣泛存在于藥用植物中的一大類化合物，大多與糖類結(jié)合成苷存在。查爾酮異構(gòu)酶是黃酮類化合物甘草苷代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，催化分子內(nèi)的內(nèi)環(huán)反應(yīng)[15]。因此，對光果甘草黃酮代謝途徑中查爾酮異構(gòu)酶基因多態(tài)性的探究，對甘草苷生物合成分子機制的闡明及篩選高品質(zhì)甘草意義重大。

圖4 光果甘草CHI信號肽預(yù)測

圖5 光果甘草CHI的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

圖6 光果甘草CHI的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

大量研究表明，CHI基因調(diào)控黃酮類化合物的生物合成，其不表達或活性缺失會阻礙植物的黃酮合成途徑，而過表達則會使黃酮含量顯著提高[11]。Muir等[16]通過將矮牽牛的CHI基因轉(zhuǎn)入番茄，獲得了黃酮類化合物含量顯著升高的轉(zhuǎn)基因番茄；Kim等[17]發(fā)現(xiàn)，大麥和洋蔥的CHI基因缺失突變體的黃酮類化合物含量急劇下降。

在本研究中，我們克隆了22條光果甘草CHI，共獲得7種單倍型，其序列一致性較好，其中單倍型1為主流單倍型。對NCBI數(shù)據(jù)庫中豆科其他物種的CHI基因進行分析，發(fā)現(xiàn)已注冊的大豆CHI基因數(shù)量最多，有100余條，分別編碼114、130、137個氨基酸殘基。其中114個氨基酸殘基的17條CHI蛋白序列中有13條完全一致（AIE16873）；130個氨基酸殘基的17條CHI蛋白序列完全一致（AIE16905）；137個氨基酸殘基的17條CHI蛋白序列中有13條完全一致（AIE16810），一致序列為大豆的主流單倍型。已注冊的綠豆CHI基因有5條，分別編碼222、389個氨基酸殘基，2條222個氨基酸殘基的序列完全一致，為主流單倍型。因此，推測CHI基因在豆科植物的不同物種中均有多種單倍型，但存在數(shù)量占主導(dǎo)地位的主流單倍型，可能與黃酮代謝途徑關(guān)系更為密切。本研究為進一步探究CHI基因?qū)Ω什蒈丈锖铣傻姆肿诱{(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

圖7 CHI系統(tǒng)進化樹分析

[1] 中華人民共和國藥典I部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2015:86-87.

[2] 楊瑞,李文東,馬永生,等.不同基原甘草的分子鑒定及市售甘草藥材的質(zhì)量評價[J].藥學(xué)學(xué)報,2017,（2）:318-326.

[3] Zhou Y,Ho W S.Combination of liquiritin,isoliquiri?tin and isoliquirigenin induce apoptotic celldeath through upregulating p53 and p21 in the A549 nonsmall cell lung cancer cells[J].Oncol Rep,2014,31（1）:298-304.

[4] Zhang X,Song Y,Han X,et al.Liquiritin attenuates advanced glycation end products-induced endothelial dysfunction via RAGE/NF-κB pathway in human um?bilicalvein endothelialcells[J].MolCellBiochem,2013,374（1-2）:191-201.

[5] Computer-guided approach to access the anti-influen?za activity of licorice constituents[J].J Nat Prod,2014,77（3）:563-570.

[6] Zhao Z,Wang W,Guo H,et al.Antidepressant-like effect of liquiritin from Glycyrrhiza uralensis in chron?ic variable stress induced depression model rats[J].Be?hav Brain Res,2008,194（1）:108-113.

[7] 楊瑞,袁伯川,馬永生,等.3種不同基原甘草中4個主要黃酮類化合物的含量分析[J].藥物分析雜志,2016,36（10）:1729-1736.

[8] Boland M J,Wong E.Purification and kinetic properi?ties of chalcone-flavanone isomerase from soya bean[J].Eur J Biochem,1975,50（2）:383-389.

[9] 李琳玲,程華,許峰,等.植物查爾酮異構(gòu)酶研究進展[J].生物技術(shù)通訊,2008,19（6）:935-937.

[10]Mehdy M C,Lamb C J.Chalcone isomerase cDNA cloning and mRNA induction by fungal elicitor,wounding and infection[J].EMBO J,1988,86（1）:1527-1533.

[11]Van Tunen A J,Koes R E,Spelt C E,et al.Cloning of the two chalcone flavanone isomerase genes from Petunia hybrida:coordinate,light-regulated and differ?ential expression of flavonoid genes[J].EMBO J,1988,7（5）:1257-1263.

[12]Blyden E R,Doerner P W,Lamb C J,et al.Se?quence analysisofa chalcone isomerase cDNA of PhaseolusvulgarisL[J].PlantMolBiol,1991,16（1）:167-169.

[13]Grotwold E,Peterson T.Isolation and characterization of a maize gene encoding chalcone flavonone isomer?ase[J].Mol Gen Genet,1994,242（1）:1-8.

[14]李建華.烏拉爾甘草黃酮異戊烯基轉(zhuǎn)移酶研究[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2014.

[15]Jez J M,Bowman M E,Dixon R A,et al.Structure and mechanism of the evolutionarily unique plant en?zyme chalcone isomerase[J].Nat Struct Biol,2007,7（9）:786-791.

[16]Muir S R,Collins G J,Robinson S,et al.Overexpres?sion of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols[J].Nat Biotechnol,2001,19（5）:470-474.

[17]Kim S,Jones R,Yook S,et al.Gold color in onions（Allium cepa）:a naturalmutation ofthe chalcone isomerase gene resulting in a premature stop codon[J].Mol Genet Genomics,2004,272（4）:411-419.

Cloning and Sequence Analysis of Chalcone Isomerase Gene from Glycyrrhiza glabra L.

ZHANG Xiao-Dong,YIN Yan-Chao,ZHOU Shan,MA Yong-Sheng,HU Ting,GAO Zhi-Qiang,LIU Ying*
School of Life Science,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China
*Corresponding author,E-mail:liuyliwd@sina.com

Objective:To clone and analyze chalcone isomerase（CHI） gene from Glycyrrhiza glabra L.Methods:RNA was extracted from the fresh root of G.glabra,cDNA was reversely transcripted,and CHI gene was amplified by PCR using specific primers designed on the basis of CHI gene from G.uralensis.The obtained CHI cDNA se?quences were sequenced and analyzed by bioinformatics.Results:Twenty-two CHI cDNA sequences were ob?tained.The open reading frame is 690bp encoding 229 amino acid residues.DNAMAN analysis results showed that 16 variable sites were present in 22 G.glabra CHI cDNA sequences and 7 haplotypes were determined,the similarity of which was 99.67％.Haplotype 1 is the major haplotype（45.5％）.Ten variable sites were found in the G.glabra CHI amino acid sequences and the similarity of which was 99.38％.Bioinformatics analysis showed that CHI is a stably hydrophilic protein.Its molecular weight is 24 kDa and isoelectric point is between 5.56 and6.76.It contains no signal peptides or transmembrane domains and has a conversed domain of chalcone superfami?ly.Its secondary structure mainly constituted of α-helix and random coil.N-J tree indicated that it is closest to G.uralensis and farthest to Dryopteris fragrans.Conclusion:It is the first time to successfully clone CHI gene from G.glabra.We hope this work will contribute to explore the function of CHI and reveal the molecular regula?tion mechanisms of liquiritnin synthesis in G.glabra.

Glycyrrhiza glabra L.;chalcone isomerase;liquiritinin;clone;bioinformatics analysis

Q943.2

A

1009-0002（2017）04-0478-07

2017-01-12

北京中醫(yī)藥大學(xué)杰出青年人才項目（2016JYBXJQ002）

張曉冬（1994- ），女，碩士研究生，（E-mail）zhangxd1880@163.com

劉穎，（E-mail）liuyliwd@sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.014