廖石榴，尹維，廖曉蘭*，張亞*

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莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑制及機理研究

廖石榴1,2，尹維1,2，廖曉蘭1,2*，張亞1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，湖南長沙410128; 2.植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙410128)

通過測定莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑菌活性、菌液的600nm值、電導率、蛋白質含量、保護酶和呼吸代謝途徑酶活性，探索莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑菌機理。結果表明：莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的室內(nèi)平板抑菌圈直徑在15 mm以上，最低抑菌質量濃度為3.68 mg/mL；莧菜乙酸乙酯提取物不僅延遲了病原菌進入對數(shù)生長期的時間，而且使其電導率增加了15%；莧菜乙酸乙酯提取物對過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、琥珀酸脫氫酶(SDH) 和蘋果酸脫氫酶(MDH)的酶活力的抑制率分別為78.43%、68.63 %、63.14%、68.00%。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，莧菜乙酸乙酯提取物使柑橘潰瘍病菌的菌體細胞膜遭受損傷，菌體發(fā)生裂解；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，莧菜乙酸乙酯提取物使柑橘潰瘍病菌的細胞壁和細胞膜結構受損，胞內(nèi)空白面積增大，細胞質外泄，菌體裂解。

莧菜；乙酸乙酯提取物；柑橘潰瘍病菌；抑菌機理

有關莧菜活性物對食品病原菌的抑菌活性的研究較多，如莧菜的水提物對面包中產(chǎn)生的羅克福爾青霉菌()有較好的抑制效果，莧菜的醇提物對食品中的多種細菌均有抑制效果[1–3]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在莧菜凝集素作用的過程中產(chǎn)生了4種新型的抗菌肽成分，這些抗菌肽成分在淀粉類食品加工時能長時間有效延長食品的貯藏壽命[4–6]。筆者測定莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑菌活性，測定經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物處理的柑橘潰瘍病菌的生長、含糖量、蛋白質含量和POD、CAT、SDH和MDH的酶活力[7–8]，通過掃描電鏡和透射電鏡觀察柑橘潰瘍病菌細胞膜結構的變化，以期為開發(fā)莧菜資源作為新型植物源殺菌劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

供試莧菜(L，種質庫編號Ⅱ9C0044，由湖南省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所保存)，由湖南農(nóng)業(yè)大學瀏陽科研基地提供。選取生長旺盛期的圓葉紅莧菜健康葉片，洗凈，自然光照下晾干后經(jīng)高速粉碎機粉碎，過孔徑0.25 mm篩，干燥陰涼處密封儲存，備用。柑橘潰瘍病菌(pv)由湖南農(nóng)業(yè)大學植物病理學實驗室提供。

1.2　方法

1.2.1莧菜乙酸乙酯提取物的制備

取莧菜葉干粉40 g，加入800 mL乙酸乙酯，常溫振蕩24 h后，靜置，舍棄殘渣，收集上清液，重復1次，合并2次所得上清液，以3 000 r/min離心，舍棄殘渣，將獲得的上清液40 ℃旋轉濃縮至膏狀物，用16.67%乙醇溶液溶解，得到莧菜乙酸乙酯提取物[9–11]。

1.2.2莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑菌活性的測定

1) 抑菌圈測定。將濃度為3′108cfu/mL的柑橘潰瘍病菌菌懸液20 μL，均勻涂布于蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基上，在平板中央對稱兩側用打孔器打孔，并在其注入250 μL莧菜乙酸乙酯提取物，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，測量其抑菌圈直徑。

2) 最低抑菌質量濃度()的測定。莧菜乙酸乙酯提取物母液，其質量濃度為58.88 mg/mL，用二倍稀釋法將母液稀釋成6個濃度梯度，測量7種濃度莧菜乙酸乙酯提取物帶藥平板上的抑菌圈直徑，以能產(chǎn)生抑菌圈的最低濃度為莧菜乙酸乙酯提取物的[12–16]

3) 莧菜乙酸乙酯提取物離體防效測定。將新鮮柑橘葉片用無菌水清洗干凈，用70%乙醇擦拭葉片正反兩面，晾干。①將葉片放入莧菜乙酸乙酯提取物中浸泡30 s后取出晾干，2 h后用柑橘潰瘍病菌的菌懸液針刺接種葉片，放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃保濕培養(yǎng)，每皿2片葉，設3次重復。觀察莧菜乙酸乙酯提取物的預防作用。②將柑橘葉片放入莧菜乙酸乙酯提取物中浸泡30 s后取出晾干，置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃保濕培養(yǎng)24 h后取出，用柑橘潰瘍病菌的菌懸液針刺接種葉片，放入培養(yǎng)皿中28 ℃保濕培養(yǎng)，每皿2片葉，設3次重復。觀察莧菜乙酸乙酯提取物的保護作用。③用柑橘潰瘍病菌的菌懸液針刺接種葉片，放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃保濕培養(yǎng)，每皿2片葉，共設3次重復。待葉片開始顯癥時，將其放入莧菜乙酸乙酯提取物中浸泡30 s后取出晾干，放入培養(yǎng)皿中28 ℃保濕培養(yǎng)。觀察各處理葉片的發(fā)病情況，以接種菌懸液、接種無菌水的葉片為對照。觀察莧菜乙酸乙酯提取物的治療作用[17–18]。

1.2.3莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑菌作用的測定

在150 mL牛肉膏培養(yǎng)液中加入300 μL濃度為3′108cfu/mL的柑橘潰瘍菌懸液，加入質量濃度為30 mg/mL的莧菜乙酸乙酯提取物20 μL，135 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取樣，共取5次樣，觀察柑橘潰瘍病菌的生長狀況。

將牛肉膏液體與柑橘潰瘍菌菌液混合后，加入質量濃度為30 mg/mL莧菜乙酸乙酯提取物，每4 h取樣，共取5個樣，加入等量的40%三氯乙酸均勻混合，3 000 r/min離心12 min，取上清進行蒽酮比色，測定各菌液在620 nm下的吸光度值，以牛肉膏培養(yǎng)液作對照，測定柑橘潰瘍病菌的糖含量。

取300 μL質量濃度為 30 mg/mL的莧菜乙酸乙酯提取物，加入150 mL正值生長對數(shù)期的菌液中，每隔3 h取樣，共取樣5次，3 000 r/min離心12 min，取上清，用無菌水將其稀釋5倍，在10 mL試管中各加入0.1 mL混合液，再加入考馬斯亮藍G–250試劑，以不加莧菜乙酸乙酯提取物的菌液作對照。以加入的試劑為空白對照，測定柑橘潰瘍病菌的蛋白質含量[20]。

取質量濃度分別為20、12、10、7、5 mg/mL的莧菜乙酸乙酯提取物各200 μL，加入150 mL柑橘潰瘍病菌菌液中，135 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，以不加莧菜乙酸乙酯提取物的菌液為對照。各取10 mL處理液在低溫環(huán)境下超聲破碎，每次破碎5 s，處理2 min，5 000 r/min低溫離心12 min。吸取1 mL上清液，測定過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)酶活，每處理重復3次。

分別取質量濃度為20、12、10、7、5 mg/mL的莧菜乙酸乙酯提取物200 μL，加入150 mL菌液中，135 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h，以不加莧菜乙酸乙酯提取物的菌液作對照。每處理各取2 mL于3 000 r/min離心15 min。將收集得到的菌體用0.1 mol/LpH值7.4的Tris–HCl緩沖液洗滌3次。將等體積的溶菌酶(2 g/L)加入菌體中，38 ℃靜置15 min，待菌體發(fā)粘時立即取出冰??；加入Tris–SDS緩沖液后5 000 r/min低溫離心12 min，取出上清液作為樣本，測定琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)酶活力[21–24]，每處理重復3次。

取5 mL菌液于具塞試管中，加入200 μL莧菜乙酸乙酯提取物后迅速測定初始電導率值；測定完畢后將試管置于搖床中振蕩，分別在5、10、20 min和1、2、3 h后取樣，測定電導率。

在振蕩培養(yǎng)24 h的柑橘潰瘍病菌菌液中加入400 μL莧菜乙酸乙酯提取物，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，取出后2 500 r/min離心12 min，棄上清液，收集沉淀的菌體；用pH值為7.2的4 ℃磷酸緩沖液洗滌3~5次，倒入2.50%戊二醛固定；用磷酸緩沖液沖洗3次，然后將樣品分別置于30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中逐級置換脫水，每次10~12 min，3 000 r/min離心；將脫水后的樣品進行CO2臨界點干燥后，在高真空蒸發(fā)器中噴金鍍膜。將制備的樣品在掃描電鏡和透射電鏡下觀察莧菜乙酸乙酯提取物對菌體形態(tài)結構的影響[25]。

1.2.4數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS6.55軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2　結果與分析

2.1　莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑菌活性

柑橘潰瘍病菌涂布平皿并打孔，注入莧菜乙酸乙酯提取物，28 ℃培養(yǎng)48 h后，抑菌圈平均直徑大于15 mm(圖1)。

A孔　莧菜乙酸乙酯提取物；B孔　乙酸乙酯對照。

7種濃度梯度的莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌抑菌試驗結果顯示，莧菜乙酸乙酯提取物能有效地抑制柑橘潰瘍病菌的生長，抑制作用與莧菜乙酸乙酯提取物濃度呈正相關，莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的為3.68 mg/mL。

接種柑橘潰瘍病菌菌懸液的5組處理在24 h后都開始顯示癥狀，針刺處出現(xiàn)明顯的感染病斑。6 d后，經(jīng)預防、保護作用和治療作用處理的葉片(圖2–a,2–b,2–c)僅在針刺處出現(xiàn)黃綠色斑點，且經(jīng)預防作用處理的葉片發(fā)病程度比保護作用處理的要輕，治療作用處理的葉片的發(fā)病程度最輕，病斑最??；僅接種菌懸液的葉片上出現(xiàn)黃綠色不規(guī)則斑點和灰褐色塊狀病斑(圖2–d)。

a　預防作用；b　保護作用；c　治療作用；d　接菌對照。

2.2　莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑菌機理

2.2.1對病原菌生長的影響

圖3顯示，柑橘潰瘍病菌液的生長曲線和經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物處理后的菌液的生長曲線有較大的差異。在600 nm的吸光度值處，柑橘潰瘍病菌液吸光度要遠大于經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物處理后的吸光度，莧菜乙酸乙酯提取物處理的菌液進入對數(shù)期的時間相對延遲，表明莧菜乙酸乙酯提取物處理抑制了柑橘潰瘍病菌的生長。

圖3　不同取樣次數(shù)的柑橘潰瘍病菌懸液的吸光度

2.2.2對病原菌含糖量的影響

經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物處理后的菌液相對含糖量大幅度增加，在處理20 h后，與柑橘潰瘍病菌液的含糖量的差異趨于平穩(wěn)。說明經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物處理后，柑橘潰瘍病菌利用糖的能力有明顯降低的趨勢，莧菜乙酸乙酯提取物能有效抑制病原菌對糖的利用能力。

圖4　柑橘潰瘍病菌不同取樣時間的含糖量

2.2.3對病原菌蛋白含量的影響

加入莧菜乙酸乙酯提取物的菌液，在2 h和4 h分別取樣，蛋白含量都降低；6 h取樣測定，經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物處理后蛋白含量663 μg/mL，明顯高于柑橘潰瘍病菌液的。

表1　莧菜乙酸乙酯提取物不同處理時間的柑橘潰瘍病菌的蛋白含量

同列不同小寫字母示差異顯著(＜0.05)。

2.2.4對病原菌保護酶和呼吸代謝酶的影響

對菌液酶活力測定結果(表2)表明，當莧菜乙酸乙酯提取物的質量濃度為20 mg/mL時，POD的活性與對照組相比降低了78.4%；當莧菜乙酸乙酯提取物質量濃度達到20 mg/mL時，CAT的活性與對照組相比降低了68.6%。莧菜乙酸乙酯提取物不僅降低柑橘潰瘍病菌POD、CAT的酶活力，且莧菜乙酸乙酯提取物濃度與酶活力成反比。

表2　莧菜乙酸乙醇提取物處理柑橘潰瘍病菌的酶活力

當莧菜乙酸乙酯提取物的質量濃度為20 mg/mL時，SDH的活性與對照組相比降低了63.1%，MDH的活性與對照組相比降低了68%。推測莧菜乙酸乙酯提取物可能主要通過抑制TCA方式來發(fā)揮對病原菌呼吸代謝的抑制作用。

2.2.5對病原菌細胞膜通透性的影響

經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物處理后，菌液電導率值先急劇增加，其后電導率值增幅變小，慢慢趨于穩(wěn)定(表3)。在此期間，經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物處理菌液的電導率比對照組增加了15 %。

表3　莧菜乙酸乙酯提取物處理的柑橘潰瘍病菌的電導率

同列不同小寫字母示差異顯著(＜0.05)。

2.2.6對病原菌細胞形態(tài)的影響

掃描電鏡下觀察，菌體如圖5–A所示；經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物作用后的菌體，形狀有不規(guī)則皺縮和較大變形，菌體發(fā)生裂解且內(nèi)容物多處外泄(圖5–B)。推測莧菜乙酸乙酯提取物使得菌體的細胞膜和細胞壁結構遭受損壞，導致細胞內(nèi)物質發(fā)生滲漏，部分菌體發(fā)生嚴重裂解。

A　柑橘潰瘍病菌；B　莧菜乙酸乙酯提取物作用后的菌體。

透射電鏡觀察，柑橘潰瘍病菌菌體如圖6–A所示。經(jīng)莧菜乙酸乙酯提取物處理后，菌體細胞嚴重皺縮且有明顯的變形，表面不再光滑，細胞壁等結構被破壞，胞質凝結成塊，分布極其不均勻，菌體出現(xiàn)大面積的裂解現(xiàn)象。相對于正常的菌體而言，視野中清晰可見的菌體明顯減少，且在菌體周邊出現(xiàn)許多深色陰影部分，推測可能是菌體在莧菜乙酸乙酯提取物的作用下，細胞壁結構受損致使其內(nèi)容物泄漏(圖6–B)。結果顯示，莧菜乙酸乙酯提取物在一定程度上破壞了菌體的細胞膜和細胞壁結構，使得細胞質外泄，菌體裂解。

A柑橘潰瘍病菌；B莧菜乙酸乙酯提取物作用后的菌體。

圖6柑橘潰瘍病菌的透射電鏡觀察(30 000×)

Fig.6TEM observation ofpv.(30 000×)

3　結論與討論

研究結果表明，莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌有較好的抑菌效果，值為3.68 mg/mL，對比山茱萸粗提物對柑橘潰瘍病菌的抑菌效果，值為62.5 mg/mL[26]有明顯的優(yōu)勢。一般來說，植物提取液對病原菌的直接作用，包括抑制游動孢子的產(chǎn)生、破壞細胞壁和細胞膜的完整性、抑制蛋白和核酸等的合成和其他多種途徑來實現(xiàn)。經(jīng)過莧菜乙酸乙酯提取物處理后，柑橘潰瘍病菌菌液的電導率明顯增大，導致生物體內(nèi)一些物質的外漏，說明莧菜乙酸乙酯提取物可以破壞菌體細胞膜的結構。隨著莧菜乙酸乙酯提取物的進一步作用，供試菌對糖的氧化代謝被抑制，使得生物體的生長和繁殖受到阻礙。SDH和MDH是三羧酸循環(huán)中的關鍵酶類，它們的酶活數(shù)值變化可以直接反映出細胞的能量代謝情況，莧菜乙酸乙酯提取物對這2種酶有明顯的抑制作用。在掃描電鏡和透射電鏡下觀察，莧菜乙酸乙酯提取物使得柑橘潰瘍病菌菌體皺縮，嚴重變形，菌體的保護結構遭到破壞，致使細胞質中蛋白質等物質有外泄的現(xiàn)象，致菌體生長和繁殖能力嚴重受損。

柑橘潰瘍病菌是黃單胞桿菌屬，由于同屬細菌之間可能存在某些生理共性[27–28]，可以利用這種生理共性開展莧菜乙酸乙酯提取物對黃單胞桿菌屬的其他植物病原菌的抑菌試驗，探索莧菜乙酸乙酯提取物對于植物病害防治的廣譜性。

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責任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維

Inhibition ofpvby ethyl acetate extract ofL. and its mechanism

LIAO Shiliu1,2, YIN Wei1,2, LIAO Xiaolan1,2*, ZHANG Ya1,2*

(1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Hunan Key Lab.Biol & Ctrl of Plant Dis & Pests , Changsha 410128 , China )

To deduce the antibacterial mechanism of ethyl acetate extract ofL. againstpv, the antibacterial activity of ethyl acetate extract ofL. againstpv.was determined and the effects of ethyl acetate extract ofL. on600nm, conductivity, protein content and respiratory metabolism enzyme activity ofpv.strain liquid were investigated. The results show that the inhibition zone diameter onpv.with ethyl acetate extract ofL. was above 15 mm, with3.68 mg/mL. With ethyl acetate extract ofL., the growth ofpv.was delayed, and the conductivity ofpv.was increased by 15% and enzyme activities of POD, CAT, SDH and MDH were inhibited by 78.43%, 68.63%, 63.14%, 68%, respectively. Scanning electron microscopy showed that cell membrane ofpv.was damaged, the bacteria was lysed, and the cell was cracked with ethyl acetate extract ofL.. Transmission electron microscopy showed that ethyl acetate extract ofL. caused the damage of cell wall and cell membrane structure ofpv., and caused the increase of intracellular blank area, the leak of cytoplasm, and the lysis of bacteria.

L.; ethyl acetate extract;pv; inhibitory mechanism

S436.661.1

A

1007-1032(2017)05-0544-07

2017–06–08

2017–08–20

湖南省教育廳重點項目(16A095)

廖石榴(1993—)，女，湖南臨湘人，碩士研究生，主要從事農(nóng)藥學研究，liaoshiliu@aliyun.com；*通信作者，廖曉蘭，博士，教授，主要從事農(nóng)藥學研究，liaoxl88@126.com；通信作者，張亞，博士，副教授，主要從事農(nóng)藥學研究，zhangya230@126.com

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