陳徉 宋天順 周國玲 謝婧婧

（1. 常州市生物技術(shù)發(fā)展中心，常州 213131；2. 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816）

一株抗鋅菌的分離鑒定及其對(duì)印度芥菜修復(fù)鋅污染土壤的影響

陳徉1宋天順2周國玲1謝婧婧2

（1. 常州市生物技術(shù)發(fā)展中心，常州 213131；2. 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816）

從受重金屬污染土壤中篩選得到1株對(duì)鋅有較高抗性的微生物，經(jīng)鑒定該菌株為芽孢桿菌屬。在不同實(shí)驗(yàn)條件下考察該菌株去除Zn2+的性能，結(jié)果表明：在Zn2+初始濃度為300 mg/L，溫度為37℃，接種量為5%的情況下，去除Zn2+的效果最好，12 h去除率可達(dá)到94%；進(jìn)一步利用盆栽試驗(yàn)，研究了添加不同濃度菌株對(duì)印度薺菜富集土壤中鋅的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加量為40 mL菌液下（1×109CFU/mL），印度芥菜地上部分和地下部分鋅含量，相較對(duì)照組分別提高56.1%和24.3%，這說明菌株可以提高鋅弱酸提取態(tài)的含量。

抗鋅菌株；菌株篩選；Zn2+去除率；印度芥菜

生物修復(fù)是利用生物（主要是微生物、植物和動(dòng)物）的新陳代謝作用吸收去除土壤中的重金屬或使重金屬形態(tài)轉(zhuǎn)化，降低毒性、凈化土壤［8-12］。重金屬在土壤中的長期存在，使得某些微生物為了適應(yīng)這種生存環(huán)境而形成了一些特殊的屬性，使其在那些被重金屬污染的土壤治理方面具有特別的作用。該方法主要利用微生物體內(nèi)存在的酶去絡(luò)合重金屬及重金屬化合物，將污染物降解或轉(zhuǎn)化成相對(duì)毒性較小的形式［13］。這是一種運(yùn)用生物技術(shù)治理污染土壤的新方法，且因效果好、易于操作、對(duì)環(huán)境沒有額外的副作用，日益受到人們的重視。目前，微生物多被用于單獨(dú)進(jìn)行土壤生物改造或改良［14-15］，或者和植物進(jìn)行聯(lián)合修復(fù)［16-18］。為了拓展重金屬污染的治理技術(shù)，需要有效的抗重金屬的微生物資源。本研究從受鉛鋅污染農(nóng)田土壤中分離篩選到耐鋅微生物，研究其對(duì)于水中鋅的去除情況，并進(jìn)一步利用改菌株與印度芥菜聯(lián)合進(jìn)行鋅污染土壤修復(fù)盆栽實(shí)驗(yàn)，以期為微生物-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬土壤實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤 分離抗鋅重金屬的土壤來自于江西省宜春市受鉛鋅污染農(nóng)田。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：5 g/L酵母膏，10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化鈉，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2 方法

1.2.1 抗鋅菌株的富集 取1 g土壤加到10 mL的液體LB培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 37℃ 180r/min，培養(yǎng)24 h；取1 mL富集培養(yǎng)液分別接種于含100 mg/L Zn2+離子的新鮮液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min 培養(yǎng)；待液體培養(yǎng)基混濁后，從中取1 mL培養(yǎng)液接種于含100 mg/L Zn2+離子的液體培養(yǎng)基中，然后逐級(jí)提高Zn2+濃度（200 mg/L、300 mg/L和400 mg/L）。

1.2.2 抗鋅菌株的篩選和復(fù)篩 用接種環(huán)取最高耐受濃度培養(yǎng)液劃線接種于含400 mg/L Zn2+的固體平板上，37℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)平板菌落形態(tài)分別挑取單菌落再接種至400 mg/L Zn2+選擇培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證，循環(huán)3次，以獲得金屬耐受能力較好的純菌株。

1.2.2.1 溫度對(duì)于菌株去除Zn2+的影響 在Zn2+濃度為100 mg/L，接種量為1%（體積比）的水溶液、pH7，分別在20℃、30℃、37℃，40℃，180 r/min振蕩吸附12 h，然后12 000 r/min離心2 min，取上清液測(cè)定Zn2+的濃度。

1.2.2.2 初始濃度對(duì)菌株去除Zn2+的影響 接入搖瓶的菌為1%，pH7，Zn2+濃度分別為100 mg/L、200mg/L、300 mg/L、400 mg/L 和 500 mg/L，37℃、180 r/min振蕩吸附12 h，然后12 000 r/min離心2 min，取上清液測(cè)定Zn2+的濃度。

1.2.2.3 接種量對(duì)菌株去除Zn2+的影響 在Zn2+濃度為300 mg/L、pH7，分別按 1%、5%以及10%的接種量加入菌懸液，37℃、180 r/min 振蕩吸附10 h，然后12 000 r/min離心2 min，取上清液測(cè)定Zn2+的濃度。

1.2.3 菌株對(duì)印度芥菜生長及富集鋅的影響 向供試土壤中加入ZnCl2水溶液，攪拌均勻、風(fēng)干，制備成800 mg/kg的鋅污染土壤。取500 mL塑料花盆，每盆裝土600 g，同時(shí)每盆加入0.4 g尿素以及0.6 g磷酸二氫鉀作為肥料，并加入水一起進(jìn)行攪拌，保持濕潤，平衡7 d后，將印度芥菜種子播種于土壤中，生長12 h后，每盆保留3株苗，在印度芥菜生長25 d后，分別取活菌量為（1×109CFU/mL）的菌原液10 mL、40 mL和80 mL，加入無菌水稀釋到100 mL，然后用注射器將其加入到植物根系土壤附近，植物在溫室下生長，并定期澆水，60 d后收獲。其中I組為添加10 mL菌液，II組為添加40 mL菌液，III組為添加80 mL菌液，并以不加菌液的無菌水的作為對(duì)照組CK。

1.3 樣品采集與分析

生長60 d后，先測(cè)定印度芥菜地上部高度，然后收割植物地上部分和地下部分，并將地上部和地下部自來水沖洗凈，再放入烘干箱105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，磨碎后放入自封袋中備用，土壤樣品自然風(fēng)干、研磨后過100目篩子備用。土壤中鋅的有效態(tài)，按土壤BCR方法［19］進(jìn)行分級(jí)提取，植物和土壤中鋅含量用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（ICP-AES）測(cè)定。

采用TaKaRa細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA并進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增的DNA 進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過TaKaRa純化試劑盒純化后由南京金斯瑞有限公司完成測(cè)序和序列分析。測(cè)序所獲序列信息通過Blast程序與GenBank的核酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行聯(lián)配，用測(cè)出的16S rDNA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，搜索相關(guān)性序列同所測(cè)序列用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選

將耐受Zn2+濃度達(dá)到400 mg/L的菌液涂布培養(yǎng)，待長出菌落后，再將其接種至新的平板上培養(yǎng)觀察，并用顯微鏡對(duì)菌落特征進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示。該菌在平板培養(yǎng)基上所形成的菌落形態(tài)為菌落邊緣粗糙，不透明，黏稠，呈向外擴(kuò)展?fàn)?。該株菌?jīng)過革蘭氏染色后的結(jié)果顯微為藍(lán)紫色，說明該菌屬呈革蘭氏陽性，形態(tài)為長桿狀。

圖1 分離出的一株耐鋅微生物的菌落特征

進(jìn)一步對(duì)鋅抗性菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)得到 1 465 bp大小的擴(kuò)增片段，擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)過純化測(cè)序，并在GenBank中與相似性較高的菌株進(jìn)行比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，鋅抗性菌株與芽孢桿菌屬的相似性最高。

圖2 抗鋅菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 溫度對(duì)Zn2+去除的影響

如圖3所示，在20℃的條件下，菌株生長緩慢，12 h后OD600值可達(dá)到0.33，而隨著溫度增加到30℃后，菌株生長速率加快，12 h后OD600值可達(dá)到0.41。當(dāng)溫度增加到37℃后，6 h后OD600值就達(dá)到了0.38，最終在12 h后OD600值可達(dá)到0.44，當(dāng)溫度增加到40℃時(shí)，其OD600相對(duì)于37℃增長變慢。

圖4 顯示出不同溫度對(duì)Zn2+去除的影響。由結(jié)果可看出，在20℃的條件下，第1小時(shí)Zn2+的去除率為15.6%，之后去除率不斷的增加，在第6小時(shí)去除率達(dá)到了55.4%，隨后去除率開始增加緩慢，在第12 小時(shí)其去除率為67%。當(dāng)溫度增加到30℃時(shí)，在1 h的去除率就達(dá)到20.3%，6 h的去除率達(dá)到了70.2%，最終第12小時(shí)的去除率為78%，均高于20℃的去除率。當(dāng)反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，Zn2+的去除速率最快，在1 h的去除率就達(dá)到24.3%，最終第12 小時(shí)的去除率為83.2%，反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，其12 h的去除率只有77%。由結(jié)果可看出，溫度為20℃時(shí)，由于反應(yīng)溫度較低，菌株增加緩慢，導(dǎo)致其去除效果一般。而隨著反應(yīng)溫度的不斷提升，菌株自我擴(kuò)增速率增加，Zn2+的去除速率也不斷增加，在反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，去除率達(dá)到最高，進(jìn)一步提升溫度可能會(huì)影響到微生物生長，使得去除率下降。

圖3 不同溫度下菌株的OD600變化

圖4 不同溫度對(duì)于Zn2+去除的影響

2.3 初始鋅濃度對(duì)Zn2+去除的影響

鋅的初始濃度可能會(huì)對(duì)菌樣的生長產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用，因此配置了一系列鋅濃度分別為100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L和 500 mg/L，研究濃度對(duì)菌株生長和鋅去除的影響。如圖5所示，在Zn2+濃度為100 mg/L時(shí)，菌株生長緩慢，12 h后的OD600值可達(dá)到0.44。而隨著Zn2+的濃度增加到200 mg/L時(shí)，菌株生長速率加快，12 h后的OD600值可達(dá)到1.09。隨著Zn2+的濃度不斷提高，對(duì)于菌株的生長速率影響不大，300 mg/L，400 mg/L，500 mg/L最終的OD600值分別達(dá)到了1.12、1.14和1.09。說明Zn2+濃度的增加，在一定程度上會(huì)對(duì)菌株的生長有促進(jìn)作用。

圖5 不同鋅初始濃度菌株的OD600變化

圖6 顯示出鋅初始濃度對(duì)于Zn2+去除的影響。在Zn2+濃度為100 mg/L的情況下，最終去除率為83.2%，隨著初始濃度的進(jìn)一步增加，在Zn2+濃度為200 mg/L時(shí)，最終去除率達(dá)到了90.1%。Zn2+濃度300 mg/L時(shí)去除率最高，達(dá)到91.7%。之后隨著Zn2+濃度進(jìn)一步增加，鋅的去除率開始下降，在Zn2+濃度為400 mg/L和500 mg/L時(shí)，去除率分別為89.8%和86.3%，因此Zn2+最佳的初始濃度為300 mg/L。

圖6不同鋅初始濃度對(duì)于Zn2+去除的影響

2.4 接種量對(duì)于去除的影響

如圖7所示，隨著接種量從1%增加到5%后，Zn2+的去除效率增快，在3 h達(dá)到了70.1%，最終12 h后的去除率為93%。再將接種量從5%增加到10%后，3 h后的去除率增加到75%，但最終12 h的去除率為94%，與接種量5%最終差不多。這可能是因?yàn)?%接種量，已經(jīng)滿足菌株自身擴(kuò)增的需要，進(jìn)一步加大接種量對(duì)于菌株增加已經(jīng)不是很顯著，因此，綜合考慮選擇最佳的接種量為5%。

圖7 不同接種量對(duì)于Zn2+去除的影響

2.5 菌株對(duì)印度芥菜生長的影響

由圖8可看出，對(duì)照組的株高為12.7 cm，鮮重為20 g，接入菌液后的印度芥菜株高和鮮重均大于對(duì)照組的，其中添加40 mL菌液的III組是生長最好的一組，其株高為28 cm，鮮重為25.6 g。

圖8 不同處理印度芥菜的生長情況

2.6 菌株對(duì)印度芥菜富集鋅的影響

不同菌株添加量下對(duì)于印度芥菜富集鋅的影響如圖9所示。由結(jié)果可看出，當(dāng)添加10 mL的菌液后，I組的地上部分和地下部分鋅含量分別為1 210 mg/kg和1 102 mg/kg，相比對(duì)照組分別提高了6.2%和9.8%，增幅不大。而隨著菌液提高到40 mL，II組的地上部分和地下部分鋅含量分別為1 779 mg/kg和1 247 mg/kg，相比對(duì)照組分別提高了56.1%和24.3%，說明添加菌株可有效提高印度芥菜對(duì)于土壤中鋅的吸附能力，并且對(duì)于印度芥菜地上部分吸收鋅的能力提升更顯著。當(dāng)菌液的添加量增加到80mL，III組的地上部分和地下部分鋅含量分別為1 670 mg/kg和1 217 mg/kg，相比對(duì)照組分別提高了46.6%和21.3%，但其提高比例小于添加40 mL菌液的II組，進(jìn)一步增大菌株的添加量時(shí)反而會(huì)出現(xiàn)鋅含量的下降的現(xiàn)象，對(duì)于印度芥菜的幫助不大。

圖9 印度芥菜地上部分和地下部分鋅含量

由表1可知，收獲時(shí)，I、II和III組印度薺菜地上生物富集系數(shù)分別為1.86、2.61和2.24，與對(duì)照組相比提高了6.2%、49.1%和28%；I、II和III組印度薺菜地下生物富集系數(shù)分別為1.70、1.83和1.64，與對(duì)照組相比提高了10.3%、18.8%和6.4%。

表1 不同處理下印度薺菜的生物富集系數(shù)與轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)

由圖10可看出，未添加菌株的對(duì)照組，其土壤中鋅弱酸提取態(tài)占27.3%，當(dāng)添加10 mL的菌液后，I組的鋅弱酸提取態(tài)為28.6%，較CK組增加了4.7%。隨著菌液的進(jìn)一步增加，II組和III組的鋅弱酸提取態(tài)較CK組分別提高了26.3%和23.8%，殘?jiān)鼞B(tài)較CK組降低了28.9%和25.7%，而還原態(tài)和可氧化態(tài)的鋅變化不明顯。

圖10 不同條件下土壤中鋅的分級(jí)形態(tài)

3 討論

本研究從受重金屬污染土壤中篩選得到一株對(duì)鋅有較高抗性的微生物，經(jīng)鑒定該菌株為芽孢桿菌屬。進(jìn)一步考察溫度、初始鋅濃度以及接種量對(duì)菌株去除鋅的影響，結(jié)果在最優(yōu)條件下（Zn2+初始濃度300 mg/L，溫度37℃，接種量5%）下，菌株去除Zn2+的效果最好。利用盆栽試驗(yàn)研究添加不同濃度菌株對(duì)印度薺菜富集土壤中鋅的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加10 mL菌液的I組，其株高和鮮重分別比對(duì)照組提高了5%和11.8%。隨著菌液的量增加到40 mL，相對(duì)應(yīng)的印度芥菜株高和鮮重，相比對(duì)照組提高最大（40%和101.5%）；將菌液量提高到80 mL時(shí)，印度芥菜的株高和鮮重沒有再提高，這說明添加適宜濃度的菌株可有效提高印度芥菜的生長。

印度薺菜對(duì)鋅有很好的吸收與耐受能力，是一種富集性植物［20］，并且其鋅富集系數(shù)地上部分高于地下部分，使得印度芥菜適用于土壤中鋅的提取。印度薺菜生物富集系數(shù)（地上，地下）是用印度薺菜（地上，地下）部分對(duì)重金屬的吸收量與土壤中重金屬含量的比值［21］。轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)是地上部重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)與地下部重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)之比，用來評(píng)價(jià)植物將重金屬從地下部向地上部的運(yùn)輸和富集能力［22］。由表1可看出，不同處理下印度薺菜的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均＞1，說明印度薺菜可以很好地將重金屬鋅轉(zhuǎn)移到地上，并且添加菌液會(huì)提高印度薺菜的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，其中添加40 mL菌液的生物富集系數(shù)最高，其相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)移系數(shù)也最大，說明在此條件下印度薺菜對(duì)于土壤中重金屬鋅的吸收能力最強(qiáng)。而對(duì)于土壤中鋅的價(jià)態(tài)中，弱酸提取態(tài)是指鋅在土壤中容易遷移的價(jià)態(tài)，其容易被植物吸收而進(jìn)入到植物體內(nèi)。從圖10可看出，少量的添加菌液，對(duì)于土壤中弱酸提取態(tài)鋅含量的提升較小，從而導(dǎo)致 10 mL菌液的添加對(duì)印度芥菜吸收鋅的幫助不大。而當(dāng)菌液提高到40 mL時(shí)，其在印度芥菜根系附近可以更好的增長，并且會(huì)通過自身的或者是刺激根系附近微生物的代謝來直接或間接活化土壤中的鋅，使得鋅價(jià)態(tài)從殘?jiān)鼞B(tài)向弱酸提取態(tài)轉(zhuǎn)變，從而有利于印度芥菜對(duì)于土壤中鋅的吸收，并在一定程度上促進(jìn)了植物的生長。而將菌液提高到80 mL時(shí)，對(duì)自身或者是刺激根系附近微生物的代謝活動(dòng)提高不大，反而可能會(huì)在一定程度上抑制其他根系微生物的生長。

4 結(jié)論

從受農(nóng)田污染土壤中篩選得到一株對(duì)Zn2+有較高抗性的菌株，經(jīng)16S RNA鑒定其為芽孢桿菌屬?？疾炝司瓴煌瑮l件下對(duì)Zn2+去除能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Zn2+初始濃度為300 mg/L，溫度為37℃，接種量為5%的情況下，菌株對(duì)Zn2+的去除效果最好，12 h的去除率可達(dá)到94%。盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，篩選得到的抗鋅菌可提高印度薺菜對(duì)于鋅的吸收，其在添加40 mL的菌液下，相對(duì)于對(duì)照組，鋅弱酸提取態(tài)較可提高26.3%，從而使得印度薺菜地上和地下部分對(duì)于鋅的吸收分別提高56.1%和24.3%。

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Isolation and Identification of a Zinc-resistant Strain and Effect of Its Characteristics on the Remediation Efficiency of Brassica juncea in Zinc-polluted Soil

CHEN Yang1SONG Tian-shun2ZHOU Guo-ling1XIE Jing-jing2
（1. Changzhou Centre for Biotech Development，Changzhou 213131 ；2. College of Life Science and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816）

A zinc-resistant strain was isolated from heavy metal-polluted soil，and identified as Bacillus. Its performance of removing Zn2+under different experimental conditions was studied. The results showed that：the removal efficiency of Zn2+was the best，and the removal rate of Zn2+was 94% in 12 h when the initial concentration of Zn2+was 300 mg/L，the temperature was 37℃，inoculation amount was 5%.Subsequently，a pot experiment was conducted for investigating the influence of adding the different concentration of the strain on plant growth and Zn uptake by Brassica juncea. The results showed that the Zn content in ground and underground part of B. juncea increased by 56.1% and 24.3% respectively while adding 40 mL bacterial liquid（1×109CFU/mL），compared with the control group. This is mainly due to the strain improves the zinc content under weak acid extraction condition.

zinc-resistant strain；screening；Zn2+removal efficiency；Brassica juncea

10.13560/.cnki.biotech.bull.1985.2017-0587

隨著世界工業(yè)的迅速發(fā)展，地球上許多地區(qū)的土壤都不同程度受到重金屬的污染。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國遭受不同程度重金屬污染的耕地面積約占總耕地面積的1/5，每年因重金屬污染的糧食，合計(jì)經(jīng)濟(jì)損失至少200億元［1］。更為嚴(yán)重的是，土壤中的重金屬可通過被污染的作物進(jìn)入食物鏈、進(jìn)入到人體體內(nèi)，嚴(yán)重威脅人類的生命安全［2］。例如，高劑量的鋅（＞400 mg/kg）會(huì)抑制機(jī)體的免疫功能，明顯降低學(xué)習(xí)記憶能力［3］。因而重金屬污染土壤的治理工作已成為國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。傳統(tǒng)的土壤重金屬修復(fù)技術(shù)，采用物理、化學(xué)或物理化學(xué)的方法將重金屬從土壤中移除，如早期的淋洗法［4］、客土法［5］、電動(dòng)力修復(fù)［6］、氣相抽提［7］等。這類方法處理相對(duì)徹底，但處理費(fèi)用較高，設(shè)備相對(duì)復(fù)雜，還會(huì)帶來一定程度的二次污染。

2017-07-13

江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（15KJA530002）

陳徉，男，碩士，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：chenyang0920@163.com

宋天順，男，博士，研究方向：生態(tài)修復(fù)；E-mail：tshsong@njtech.edu.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）