位光山 張嘉煒 李明聰 高崢，2

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安271000）

黃河入海口水體細(xì)菌群落多樣性及分布特征

位光山1張嘉煒1李明聰1高崢1，2

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安271000）

黃河入海口地處黃河、渤海灣與萊州灣交匯處，地理位置獨(dú)特，微生物資源豐富，但關(guān)于該地區(qū)水體細(xì)菌群落的研究非常有限。以環(huán)境獨(dú)特的黃河口為切入點(diǎn)，運(yùn)用16S rDNA克隆文庫法，旨在研究黃河口水體細(xì)菌群落多樣性及分布特征。結(jié)果顯示，從4個(gè)不同樣點(diǎn)共得到11個(gè)門、18個(gè)綱、39個(gè)科、53個(gè)屬的細(xì)菌。優(yōu)勢(shì)類群為變形菌門（α-、β-和γ-變形菌綱）、放線菌門、擬桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門。功能注釋顯示黃河口水體細(xì)菌主要參與碳、氮、硫等元素循環(huán)?；谖锓N組成或群落功能的聚類分析均可根據(jù)采樣點(diǎn)聚為明顯的兩個(gè)分支——A、B和C、D。斯皮爾曼相關(guān)性分析（Spearman correlation analysis）及冗余分析（Redundancy analysis）表明環(huán)境因子（溶解氧、鹽度及氮營養(yǎng)鹽）對(duì)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能有顯著影響。研究表明，黃河入?？谒w細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受黃河及環(huán)境因子影響呈現(xiàn)出不同的空間分布特征。本研究期望為初步掌握黃河河口及其鄰近海域水體細(xì)菌多樣性狀況提供一定的參考，對(duì)進(jìn)一步改善該區(qū)域河流和海洋環(huán)境提供數(shù)據(jù)支持，以及有助于該區(qū)域微生物資源的開發(fā)及水體生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)。

黃河入海口；細(xì)菌多樣性；群落功能；16S rDNA；克隆文庫

微生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，蘊(yùn)藏著巨大的生物量，在碳、氮、硫及磷等元素的全球生物地球化學(xué)循環(huán)，凈化海洋環(huán)境及維持海洋生態(tài)系統(tǒng)多樣性與穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用［1-3］。雖然海洋微生物在生態(tài)系統(tǒng)中具有如此重要的作用，但目前人們對(duì)其了解仍相對(duì)缺乏。對(duì)海洋微生物多樣性和分布特征的研究將有助于更深入地認(rèn)識(shí)海洋微生物在整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)中的功能與作用，對(duì)開展海洋生態(tài)環(huán)境研究具有重要意義。

早期微生物生態(tài)研究是通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)獲得菌株后才能對(duì)其特性進(jìn)行描述［4］。但由于培養(yǎng)條件與自然條件的差異，實(shí)際培養(yǎng)所得到的只是自然環(huán)境中的少部分（0.001%-15%）微生物［5］。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使直接檢測(cè)環(huán)境樣品中的未培養(yǎng)微生物群落成為可能。這些技術(shù)包括：構(gòu)建16S rDNA克隆文庫、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、高通量測(cè)序技術(shù)［6］等。目前，應(yīng)用最廣泛的是克隆文庫法和高通量測(cè)序技術(shù)，兩者各有優(yōu)劣，前者不受序列長(zhǎng)度限制，缺陷是通量較低、花費(fèi)較高；后者通量高、價(jià)格相對(duì)便宜，但測(cè)序長(zhǎng)度受限［6］。

黃河是世界上含沙量最高的河流，平均含沙量為22 g/L［7］。黃河入海口，位于黃河與渤海灣交匯處，黃河攜帶的大量泥沙、污染物，以及豐富的營養(yǎng)物質(zhì)在此匯入海洋。雖然前人對(duì)黃河入?？诘貐^(qū)微生物多樣性已有少量研究，但對(duì)該獨(dú)特的入?？谏鷳B(tài)系統(tǒng)的研究還不充分。Li等［8］研究了黃河口表層水體中反硝化細(xì)菌功能基因的豐度及多樣性分布?；趎irK基因的研究顯示，淡水環(huán)境中反硝化細(xì)菌群落多樣性高于海水環(huán)境，同時(shí)反硝化群落組成與多種環(huán)境因素有關(guān)。Yan等［9］研究了黃河入?？诔练e物中亞硝酸鹽依賴型厭氧甲烷氧化細(xì)菌（n-damo）的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，黃河口n-damo細(xì)菌多樣性相對(duì)高于其他生境。Wei等［10］對(duì)比研究了黃河入海口沉積物及水體中細(xì)菌和古菌群落的豐度、多樣性及其分布模式。研究表明，黃河口沉積物和上覆水中細(xì)菌和古菌的分布模式不同。本研究旨在運(yùn)用16S rDNA克隆文庫技術(shù)探索黃河入?？诓煌乘w細(xì)菌群落多樣性及空間分布特征。研究結(jié)果將對(duì)該地區(qū)微生物資源的開發(fā)、黃河水資源利用及生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)具有一定的理論和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣點(diǎn)及樣品采集 2010年10月下旬，于黃河入?？诓煌乩砦恢眠M(jìn)行樣品采集，其中兩采樣點(diǎn)（A、B）位于正對(duì)河口的河海交匯處，另兩樣點(diǎn)（C、D）為離河口相對(duì)較遠(yuǎn)的近岸處（圖1）。用水樣采集器（Wildco，美國）采集表層水樣，裝于無菌采樣瓶中，水溫、鹽度、pH、溶解氧等理化指標(biāo)，用便攜式儀器（雷磁，上海）現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定。

圖1 黃河入?？诩安蓸狱c(diǎn)地理位置分布圖

1.1.2 主要酶及試劑 10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、Taq DNA Polymerase（TaKaRa，大連）；Hae III、Msp I限制性內(nèi)切酶及pMD18-T載體（TaKaRa）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（天根，北京）；DNA提取試劑盒E.N.Z.A.TMWater DNA Kit（Omega，美國）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Solarbio，北京）；瓊脂糖（BIOWEST，西班牙）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 樣品用冰盒低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，分別將各樣點(diǎn)的部分水樣，分裝凍存（-20℃），并盡快參照國標(biāo)方法對(duì)總氮、硝態(tài)氮、總磷、化學(xué)需氧量（COD）等理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。另一部分水樣分別抽濾至孔徑為0.22 μm的無菌濾膜上，保存于-80℃超低溫冰箱，以備DNA提取。

1.2.2 16S rDNA克隆文庫的構(gòu)建

1.2.2.1 DNA提取及檢測(cè) 參照說明書，用E.N.Z.A.TMWater DNA Kit試劑盒分別對(duì)不同樣點(diǎn)的DNA進(jìn)行提取，所得DNA樣品經(jīng)1%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.2 16S rDNA目的片段擴(kuò)增 用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R對(duì)各點(diǎn)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及條件參照Wei等［11］文獻(xiàn)報(bào)道。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段純化用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒參照說明書進(jìn)行。

1.2.2.3 16S rDNA文庫構(gòu)建 將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。培養(yǎng)2 h后，取100 μL菌液涂布至含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取單克隆，在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)期，用載體引物（RV-M和M13-47）通過菌液直接為模板的PCR篩選陽性克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.2.2.4 RFLP分析及測(cè)序 將陽性克隆PCR產(chǎn)物，參照說明書分別用限制性核酸內(nèi)切酶Hae III和Msp I進(jìn)行酶切。酶切結(jié)束后用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。兩種酶切帶型均一致的克隆被認(rèn)為是同一物種。挑選酶切帶型不同的陽性克隆，分別用載體引物進(jìn)行雙端測(cè)序，拼接得到16S rDNA近全長(zhǎng)序列。

1.2.3 16S rDNA克隆文庫數(shù)據(jù)分析 對(duì)所得16S rDNA序列先去除載體序列、統(tǒng)一序列方向，剔除序列長(zhǎng)度較短、引物序列缺失及存在模糊堿基的序列。用mothur（www.mothur.org）去除嵌合體序列，以97%序列相似性為閾值進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Unit）劃分。挑選OTU中豐度最高的序列為代表OTU序列，以SILVA數(shù)據(jù)庫（www.arb-silva.de）為參考對(duì)代表序列進(jìn)行物種分類，置信閾值為0.8。結(jié)合RFLP結(jié)果，整理各樣點(diǎn)不同分類水平物種分類表。不同分類水平群落相似性聚類樹及多樣性指數(shù)計(jì)算用PAST軟件（http://folk.uio.no/ohammer/past/）進(jìn)行，分別用Shannon指數(shù)、Evenness指數(shù)和Chao 1指數(shù)來表示多樣性、均勻度和豐富度估測(cè)。維恩圖用在線工具Venny 2.1完成（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）。選取優(yōu)勢(shì)OTU代表序列（序列數(shù)相對(duì)豐度＞1%）及其在NCBI及EZ BioCloud（http://www.ezbiocloud.net/）中的近緣序列用MEGA軟件（http://www.megasoftware.net/）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。根據(jù)物種分類結(jié)果，用FAPROTAX數(shù)據(jù)庫（http://www.zoology.ubc.ca/louca/FAPROTAX/lib/php/index.php?section=Home）在QIIME中參照網(wǎng)站說明對(duì)細(xì)菌群落功能進(jìn)行注釋。環(huán)境因子與優(yōu)勢(shì)類群及群落功能間Spearman相關(guān)性分析用SPSS軟件（IBM，美國）完成。環(huán)境因子與群落組成及功能輪廓間的冗余分析（RDA）用CANOCO軟件（http://www.canoco5.com/）進(jìn)行。

表1 黃河入?？诓煌瑯狱c(diǎn)水樣理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 采樣點(diǎn)及樣品理化指標(biāo)

由理化指標(biāo)可知，正對(duì)河口處A、B兩點(diǎn)，鹽度較低、溶氧量較高；離河口相對(duì)較遠(yuǎn)處C、D兩點(diǎn)，鹽度較高，溶氧量較低。此外，A、B兩點(diǎn)的pH、總氮及硝態(tài)氮含量均高于C、D兩點(diǎn)，COD（化學(xué)需氧量）明顯低于C、D兩點(diǎn)，總磷含量相近（表1）。因此，根據(jù)地理位置和理化指標(biāo)，可將采樣點(diǎn)生境明顯分為受黃河水影響較大的河海交匯低鹽區(qū)（A、B）和受河水影響較小的海水高鹽區(qū)（C、D）兩類。

2.2 黃河入?？谒w細(xì)菌多樣性分析

針對(duì)不同的采樣點(diǎn)共構(gòu)建了4個(gè)不同的16S rDNA克隆文庫，每個(gè)文庫隨機(jī)挑取了120個(gè)單菌落，其中陽性克隆數(shù)平均100個(gè)左右，陽性克隆率約85%。經(jīng)過RFLP及克隆文庫測(cè)序，共獲得408條序列，按照97%序列相似性可劃分為178個(gè)OTU。由表2可知，各點(diǎn)覆蓋率（Coverage）為0.60-0.68，表明所建文庫能較準(zhǔn)確地反映各樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，但尚有大量稀有種未被檢測(cè)到。河海交匯處樣點(diǎn)B的細(xì)菌均勻度（Evenness）、Chao 1及Shannon指數(shù)均最高，表明B點(diǎn)細(xì)菌多樣性最高。海水養(yǎng)殖區(qū)C點(diǎn)的均勻度指數(shù)最低，表明其細(xì)菌群落組成不均勻，存在優(yōu)勢(shì)度較高的細(xì)菌類群。比較不同點(diǎn)的Shannon多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)河海交匯處低鹽區(qū)（A、B）細(xì)菌多樣性整體高于高鹽區(qū)（C、D）。

表2 黃河入?？诓煌瑯狱c(diǎn)的水體細(xì)菌16S rDNA克隆文庫分析

2.3 黃河入?？谒w細(xì)菌群落組成及功能分布特征

通過16S rDNA克隆文庫法，在黃河入?？谒w中共檢測(cè)到分類地位明確的11個(gè)門、18個(gè)綱、39個(gè)科、53個(gè)屬的細(xì)菌。通過門到屬水平的細(xì)菌群落組成相似性聚類，發(fā)現(xiàn)黃河口水體細(xì)菌群落在各分類水平上均可聚為明顯的兩個(gè)分支——A、B和C、D（圖 2）。

在門水平上，相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)門有變形菌門（Proteobacteria，56%-79%）、放線菌門（Actinobacteria，8%-30%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，4%-11%）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria，1%-3%）、浮霉菌門（Planctomycetes，1%-3%）等11個(gè)。其中A、B樣點(diǎn)放線菌門相對(duì)豐度明顯高于C、D樣點(diǎn)，但變形菌門及擬桿菌門的相對(duì)豐度則低于C、D樣點(diǎn)（圖2-A）。綱水平上，優(yōu)勢(shì)綱有β-變形菌綱（Betaproteobacteria，33%-43%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，14%-27%）、放線菌綱（Actinobacteria，5%-30%）、γ-變 形 菌 綱（Gammaproteobacteria，4%-17%）及黃桿菌綱（Flavobacteria，1%-10%）等18個(gè)。其中A、B樣點(diǎn)中放線菌綱的相對(duì)豐度高于C、D樣點(diǎn)，α-變形菌綱和黃桿菌綱相對(duì)豐度則低于C、D樣點(diǎn)（圖2-B）?？扑缴希瑑?yōu)勢(shì)科為從毛單胞菌科（Comamonadaceae，14%-39%）、魚孢菌科（Sporichthyaceae，1%-22%）、Pelagibacteraceae科（6%-16%）、酸微菌科（Acidimicrobiaceae，4%-16%）和紅桿菌科（Rhodobacteraceae，2%-16%）等39個(gè)。其中A、B樣點(diǎn)中魚孢菌科和酸微菌科的相對(duì)豐度明顯高于C、D樣點(diǎn)，從毛單胞菌科和紅桿菌科相對(duì)豐度則低于C、D樣點(diǎn)（圖2-C）。在屬水平上，優(yōu)勢(shì)屬有BAL58 marine group（0%-31%）、hgcI clade（0%-21%）、CL500-29 marine group（4%-15%）、紅育菌屬（Rhodoferax，4%-11%）及LD28（0%-9%）等53個(gè)。A、B樣點(diǎn)中除BAL58 marine group外，其余優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度均高于C、D樣點(diǎn)（圖2-D）。

為進(jìn)一步揭示OTU水平的細(xì)菌群落分布特征，繪制了OTU水平的韋恩圖。結(jié)果（圖3）表明，不同樣點(diǎn)以獨(dú)有OTU為主，A、B、C、D各點(diǎn)獨(dú)有OTU數(shù)目分別為39、35、38、43個(gè)。相似環(huán)境的共有OTU數(shù)目更多，同為河口處低鹽區(qū)的A、B樣點(diǎn)共有15個(gè)OTU，高鹽區(qū)的C、D樣點(diǎn)共有7個(gè)OTU。但A與C、A與D、B與C、B與D之間共有OTU數(shù)目分別僅為2、1、3、1個(gè)。有2個(gè)OTU在A、B、C樣點(diǎn)中均有分布；僅有1個(gè)OTU在A、B、D樣點(diǎn)中均有分布，未檢測(cè)到OTU在所有樣點(diǎn)中均存在。

根據(jù)物種分類結(jié)果，對(duì)黃河入?？谒w細(xì)菌群落用FAPROTAX數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋（圖4）。與細(xì)菌群落組成類似，從功能類群層面，黃河口細(xì)菌群落也可聚為明顯的兩個(gè)分支——A、B和C、D。黃河口水體最優(yōu)勢(shì)的功能類群為好氧化能異養(yǎng)菌（7%-23%）、其次為光能異養(yǎng)菌（0%-7%）、甲基營養(yǎng)型（0%-7%）、硝酸鹽還原菌（0%-7%）等，硫元素、重金屬、芳香烴類難降解有機(jī)物代謝及人或哺乳動(dòng)物腸道菌群等也占有一定比例。其中A、B樣點(diǎn)的光能異養(yǎng)和甲基營養(yǎng)型菌的比例高于C、D樣點(diǎn)；而好氧化能異養(yǎng)和硝酸還原類群低于C、D樣點(diǎn)。

圖2 黃河入海口水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖

圖3 黃河入?？诩?xì)菌群落OTU水平分布維恩圖

圖4 黃河入海口水體細(xì)菌功能注釋熱圖

2.4 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌OTU系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖5 根據(jù)優(yōu)勢(shì)OTU的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

挑選相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)OTU進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以確定其分類地位、可培養(yǎng)狀況及近緣序列環(huán)境來源（圖5）。通過與EZ BioCloud數(shù)據(jù)庫比對(duì)，可 知 OTU1、2、3、4、5、9、12、13、14和 18已有序列相似性＞97%的可培養(yǎng)株，OTU6、7、8和15相似性最高的序列為來自環(huán)境的未培養(yǎng)細(xì)菌，表明即使是優(yōu)勢(shì)OTU水平，黃河口水體中仍有一定比例的未培養(yǎng)細(xì)菌新種。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，OTU1、3、5、13和14的近緣序列菌株來源為海水環(huán)境，上述OTU全部來自C、D兩個(gè)海水樣點(diǎn)。OTU2、6、7、9、15與18的近緣序列菌株來源為淡水環(huán)境，它們大部分來自A、B兩個(gè)低鹽樣點(diǎn)。其中A點(diǎn)所占比例最大的OTU2為α-變形菌綱的細(xì)菌，在NCBI中其相似度最高的序列來自巴拿馬的加通湖表面溫水層。B點(diǎn)所占比例最大的OTU6為一種不可培養(yǎng)的細(xì)菌，其相似度最高的序列也來自巴拿馬的加通湖表面溫水層。在C、D兩點(diǎn)所占比例均最大的OTU1為β-變形菌綱的細(xì)菌，其相似度最高的序列來自美國紐波特港水環(huán)境，該地鹽度與C、D兩點(diǎn)相近。

2.5 黃河入?？谒w優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落與環(huán)境因子關(guān)系

優(yōu)勢(shì)屬及功能類群與理化指標(biāo)間的斯皮爾曼相關(guān)性分析顯示，僅有部分優(yōu)勢(shì)屬（玫瑰桿菌屬、紅育菌屬、Caenimonas屬等）與鹽度、溶氧量、總氮及COD等理化因子顯著相關(guān)（表3），而絕大部分優(yōu)勢(shì)功能類群（甲醇氧化型細(xì)菌、甲基營養(yǎng)菌、好氧光能異養(yǎng)菌等）與鹽度、溶氧量、總氮、硝態(tài)氮等理化因子顯著相關(guān)（表4）。

表3 黃河口水體優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與理化因子相關(guān)性分析結(jié)果

表4 黃河口水體優(yōu)勢(shì)細(xì)菌功能類群與理化因子相關(guān)性分析

分別以黃河入?？谒w細(xì)菌屬水平群落組成、群落功能組成和所檢測(cè)的理化因子進(jìn)行冗余分析（RDA），研究環(huán)境因子與整體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能之間的關(guān)系。結(jié)果（圖6）顯示，屬水平及功能角度分析結(jié)果一致，即A、B樣點(diǎn)均有聚集現(xiàn)象，其群落及功能分布均與溶氧量及總氮正相關(guān)，與鹽度負(fù)相關(guān)，而C、D樣點(diǎn)的細(xì)菌群落及功能分布則與上述理化因子的關(guān)系正好相反。

3 討論

通過對(duì)黃河河口及其鄰近海域水體的16S rDNA克隆文庫的構(gòu)建及多樣性分析，我們對(duì)該地區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能輪廓有了更完善的了解。其中河海交匯處低鹽區(qū)的水體細(xì)菌多樣性相對(duì)高鹽區(qū)海水的細(xì)菌多樣性高。推測(cè)河海交匯處細(xì)菌多樣性高的原因有兩個(gè)：一是匯集作用，即沿水流方向，細(xì)菌的豐度及多樣性增加［11］。該區(qū)域是淡水和海水的交匯處，淡水和海水來源的細(xì)菌在此匯集，因而使得河海交匯處細(xì)菌多樣性較高。二是鹽度等環(huán)境因子影響。前人研究表明，鹽度是影響入?？谒w細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的關(guān)鍵因子［12-13］。Campbell等［13］通過對(duì)沿入?？邴}度梯度的水體細(xì)菌群落研究，發(fā)現(xiàn)低鹽度（＜5‰）和高鹽度（＞30‰）水體細(xì)菌多樣性明顯高于中等鹽度（5‰-30‰）水體，這與本文的研究結(jié)果一致。此外，前人研究還指出溶解氧、pH、鹽度及與營養(yǎng)相關(guān)的變量（硝酸鹽和磷酸鹽）是驅(qū)動(dòng)沿海水體細(xì)菌群落多樣性的關(guān)鍵因素［14］。在本研究中，鹽度、pH、溶解氧、硝酸鹽和氨濃度也與黃河入?？诟∮渭?xì)菌群落密切相關(guān)。

圖6 黃河入?？谒w細(xì)菌群落與理化因子冗余分析

本研究一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是，無論從物種組成層面還是功能角度，樣品均聚為差異明顯的兩個(gè)分支——A、B和C、D。正如前人研究所述，環(huán)境條件的差異對(duì)水環(huán)境中微生物群落的組成和功能產(chǎn)生影響［15-17］。本研究中，與采樣點(diǎn)位置差異引起的顯著理化差異密切相關(guān)。A、B兩點(diǎn)正對(duì)河口，位于河海交匯處，河水的擾動(dòng)使得溶解氧含量較高，稀釋作用使得鹽度較低，外加攜帶上游農(nóng)田的肥料而氮含量較高；C為海上養(yǎng)殖區(qū)，餌料投放、水產(chǎn)排便等使得改點(diǎn)COD含量較高；D位于海上油井旁，來自采油過程中的污染使得該點(diǎn)COD含量也較高；C、D兩點(diǎn)均離河口相對(duì)較遠(yuǎn)，因此受河水影響小，鹽度高。上述因素，使得A、B和C、D生境差異明顯，因而驅(qū)動(dòng)了其微生物群落組成及功能輪廓的顯著差異。系統(tǒng)進(jìn)化分析從物種潛在來源的角度進(jìn)一步闡明了不同位點(diǎn)的群落差異。A、B兩點(diǎn)優(yōu)勢(shì)OTU相似性最高的序列均來自湖泊等淡水環(huán)境，因此推測(cè)A、B優(yōu)勢(shì)群落可能來自黃河水。C、D點(diǎn)優(yōu)勢(shì)OTU的相似序列均來自海水環(huán)境，表明優(yōu)勢(shì)類群主要來自海洋環(huán)境。

水體細(xì)菌對(duì)維持黃河入海口生態(tài)系統(tǒng)平衡至關(guān)重要。本研究中優(yōu)勢(shì)類群主要參與黃河口碳、氮、硫等元素循環(huán)代謝。在屬水平上我們發(fā)現(xiàn)黃河口主要優(yōu)勢(shì)類群為hgcI clade、CL500-29 marine group和紅育菌屬。根據(jù)前人研究報(bào)道，CL500-29 marine group具有氨氧化及水解尿素的功能［18］，紅育菌屬細(xì)菌具有鐵還原作用［19］及固氮能力［20］，這些功能在基于FAPROTAX的功能注釋中均有體現(xiàn)。同時(shí)，功能注釋結(jié)果顯示，A、B、C、D點(diǎn)好氧化能異養(yǎng)菌豐度最高，尤其是C、D點(diǎn)，這可能與其COD含量高有關(guān)，高比例的化能異養(yǎng)菌有助于有機(jī)質(zhì)的降解，從而有效降低COD。甲基營養(yǎng)型細(xì)菌在各點(diǎn)均有較高比例，這類細(xì)菌可能在黃河口水體中含甲基有機(jī)物代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有趣的是，C、D點(diǎn)海水樣品中檢測(cè)到高比例的硝酸鹽還原類群但A、B低鹽樣點(diǎn)則未檢測(cè)到，表明細(xì)菌反硝化作用可能在黃河口海水硝酸鹽去除中發(fā)揮重要作用，低鹽環(huán)境下水體硝酸鹽去除可能主要通過其他途徑。A、B點(diǎn)還注釋到豐富的尿素水解類群（ureolysis），這與黃河水匯集農(nóng)田氮肥引起該區(qū)域高濃度氮素相關(guān)。此外，A、B樣點(diǎn)還注釋到了人及哺乳動(dòng)物腸道來源的菌群，C、D點(diǎn)注釋到了豐富的硫代謝相關(guān)菌群，這都與采樣點(diǎn)的特殊環(huán)境密切相關(guān)。此外，在分析環(huán)境因子與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，按照微生物功能劃分的功能類群相比按照16S rDNA序列相似性劃分的物種組成，對(duì)環(huán)境因子響應(yīng)更敏感。這與前人在全球尺度海洋環(huán)境［21］、模擬草原土壤風(fēng)蝕與沉積［22］、鳳梨科植物儲(chǔ)水器［23］等不同生境微生物群落與環(huán)境因子關(guān)系的研究中結(jié)果一致。河口、海洋、土壤、植物儲(chǔ)水器等多樣化生境下一致的結(jié)果表明，微生物功能類群相比物種分類對(duì)環(huán)境因子響應(yīng)更敏感的結(jié)論可能具有廣泛的普適性。

本文主要研究了黃河入?？谒w細(xì)菌群落多樣性及空間分布特征。為初步掌握黃河河口及其鄰近海域水體細(xì)菌多樣性狀況及功能輪廓提供了一定的參考，闡明了影響該區(qū)域內(nèi)細(xì)菌多樣性分布的環(huán)境因子（溶解氧、pH、氮營養(yǎng)鹽），對(duì)進(jìn)一步改善該區(qū)域河流和海洋環(huán)境提供了數(shù)據(jù)支持。本研究的主要優(yōu)勢(shì)在于使用克隆文庫法可得到16S rDNA的近全長(zhǎng)序列，細(xì)菌分類注釋結(jié)果更準(zhǔn)確。但尚有不足，如克隆文庫覆蓋率低，不能獲得稀有種信息，后續(xù)可結(jié)合高通量測(cè)序進(jìn)行分析；樣點(diǎn)相對(duì)較少，后續(xù)可開展針對(duì)該地區(qū)更為密集的采樣研究；缺少時(shí)序性，進(jìn)一步的研究中可增加不同季節(jié)的采樣。此外，本研究還揭示了該地區(qū)尚存在大量未培養(yǎng)的細(xì)菌資源，后續(xù)還要結(jié)合新技術(shù)（如宏基因組/宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序）加強(qiáng)對(duì)該地區(qū)功能微生物類群及細(xì)菌資源的開發(fā)。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)黃河入海口不同位點(diǎn)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能的研究，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群主要與碳、氮、硫等元素循環(huán)代謝相關(guān)，且優(yōu)勢(shì)類群中仍然存在大量未可培養(yǎng)的細(xì)菌。水體理化性質(zhì)差異是引起水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能組成差異的主要驅(qū)動(dòng)因素之一。細(xì)菌功能輪廓相比其群落結(jié)構(gòu)，對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)更為敏感。

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The Diversity and Distribution Pattern of Bacterial Community in the Water of Yellow River Estuary

WEI Guang-shan1ZHANG Jia-wei1LI Ming-cong1GAO Zheng1，2
（1.College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271000 ；2. State Key Laboratory of Crop Biology，Shandong Agricultural University，Tai’an 271000）

The Yellow River estuary，located in the confluence of Yellow River，Bohai Bay and Laizhou Bay，has unique geography and abundant microbial resources. However，the researches on bacterial community in this area were very limited. Here we used 16S rDNA clone libraries to explore the diversity and the characteristics of spatial distribution pattern of bacterial community in the unique estuarine ecosystem. The results demonstrated that different 16S rDNA clone libraries were constructed for 4 different water samples，and totally，we detected the bacteria in Yellow River estuary in 11 phyla，18 classes，39 families and 53 genera. The dominant bacteria were attributed in Proteobacteria （α-，β-，and γ-proteobacteria），Actinobacteria，Bacteroidetes and Cyanobacteria. Functional annotation results showed that aquatic bacteria played key roles in the cycling of carbon，nitrogen and sulfur elements. Species- or function-based cluster analyses indicated that samples could be divided into two different branches，A，B and C，D，respectively. Spearman correlation analysis and redundancy analysis （RDA） demonstrated that environmental factors （dissolved oxygen，salinity，and nitrogen nutrients） had significant effects on the structures and functions of aquatic bacterial community. The study shows that both the Yellow River and environmental factors drive the structure of bacterial community into varied spatial distribution patterns along the estuary. This study is a preliminary glimpse of bacterial diversity in the Yellow River estuary and adjacent seawater. It also provides data supports for further improvement in the rivers and marine environment of this area，and is beneficial to the microbial resource development and ecological protection of this water area.

Yellow River estuary；bacterial diversity； community function；16S rDNA；clone library

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0568

2017-07-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41306150），山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金（BS2012HZ011），山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J10LC09），國家海洋局海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（HY201205）

位光山，男，博士研究生，研究方向：微生物生態(tài)及原核sRNA調(diào)控；E-mail：weigsh3@mail2.sysu.edu.cn；張嘉煒為本文共同第一作者

高崢，男，博士，副教授，研究方向：微生物生態(tài)與環(huán)境微生物學(xué)；E-mail：gaozheng@sdau.edu.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）