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·基礎醫(yī)學論著/研究·

三葉片對實驗性高脂小鼠血清載脂蛋白A5的影響

路美娟1，2，王保和2，徐強2，莊建國1

目的通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法，觀察三葉片(又名三葉糖脂清)對實驗性高脂小鼠血清載脂蛋白A5(ApoA5)的影響。方法采用高脂飼料喂養(yǎng)建立高脂小鼠模型，用三葉片、非諾貝特、血脂康連續(xù)灌藥30 d后，取血、分離血清，通過ELISA方法檢測血清ApoA5含量。結果與模型組比較，正常對照組、血脂康組、非諾貝特組、三葉片低劑量組(0.864 g/kg)ApoA5含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；非諾貝特組與血脂康組、三葉片高劑量組、三葉片低劑量組ApoA5比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；三葉片高、低劑量組之間ApoA5比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論三葉片降脂作用很有可能是通過影響ApoA5而實現(xiàn)的；三葉片的降脂作用不呈劑量依賴性。

高脂血癥；三葉片；載脂蛋白A5；血脂；痰濁

高脂血癥作為心腦血管疾病的危險因素[1-2]，發(fā)病率逐年上升。降脂治療成為防治心腦血管疾病重要基石，相關研究始終是國內外學者的研究重點。載脂蛋白作為脂質代謝過程中的重要因素，逐漸被大家重視，血清載脂蛋白A5(ApoA5)作為最新的載脂蛋白家族成員，于2001年由Pennacchio 和 vander Vliet 等[3-4]所發(fā)現(xiàn)。目前，多項研究證明ApoA5 是一個關鍵性的血漿三酰甘油(TG)調節(jié)因子。

多項研究證明，三葉片(又名三葉糖脂清)具有明確的改善脂質代謝紊亂作用，本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)制作高脂小鼠模型，觀察三葉片對比陽性對照藥調脂作用，并通過ELISA法檢測各組ApoA5含量，探討三葉片調脂作用與ApoA5的關聯(lián)性，為三葉片調脂作用的機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 三葉片，山東步長神州制藥有限公司提供(CFDA批件號2010L00278)；血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司生產(批號：20160602)；非諾貝特片，RECIPHARM FONTAINE生產(批號：23923)。實驗前用0.5%檸檬酸(CMC)配成25 g/L的藥液。

1.2 動物 健康雄性C57BL/6J小鼠90只，體質量(20.52±0.08)g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，SPF級，合格證編號：11400700124871，許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所，溫度 19 ℃～24 ℃，相對濕度為40%～70%，符合《中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物環(huán)境設施標準》。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 試劑 三酰甘油測定試劑盒GPO-PAP法(生產批號：160871，中生北控生物科技股份有限公司提供)；總膽固醇(TC)測定試劑盒CHOD-PAP法(生產批號：161441，中生北控生物科技股份有限公司提供)；葡萄糖測定試劑盒葡萄糖氧化酶法(生產批號：160741，中生北控生物科技股份有限公司提供)；ELISA方法檢測小鼠ApoA5試劑盒(生產批號：20160523，天津市萊博科技有限公司提供)。

1.3.2 飼料 高糖脂飼料12492，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.3.3 儀器 全自動生化分析儀(Hitachi 7020型，日立公司)；離心機 (Legend Micro17，Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 高脂模型制作 選取C57BL/6J小鼠90只，適應性飼養(yǎng)1周后，按體質量隨機區(qū)組法分為空白組和模型組，其中空白組12只，模型組78只。空白組喂普通飼料，模型組喂高脂飼料，連續(xù)8周。8周后，禁食(不禁水)24 h，檢測空腹血脂，以血清TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量顯著升高的小鼠為成功模型，納入實驗。

1.4.2 分組方法 保留空白組小鼠12只，選擇符合標準的模型組小鼠60只，采用隨機區(qū)組法分為模型組、非諾貝特組、血脂康組及三葉片高、低劑量組，每組12只。

1.4.3 給藥方法 非諾貝特組給予非諾貝特0.1 g/(kg·d)；血脂康組給予血脂康0.25 g/(kg·d)；三葉片高、低劑量組給予三葉片4.320 g/(kg·d)、0.864 g/(kg·d)。各治療組均灌胃給藥，給藥體積為1 mL/30 g，空白組和模型組給予等體積的0.5%CMC，每周稱質量1次，根據(jù)體質量調整用藥劑量，連續(xù)灌胃給藥30 d。用藥期間空白組喂普通飼料，模型組和各給藥組仍給予高脂飼料，自由飲水。

1.4.4 標本采集 灌胃給藥30 d 后，禁食(不禁水)10 h，末次灌胃給藥1 h后，3.5%水合氯醛280 mg/kg，腹腔注射麻醉小鼠，眼球后取血。將全血注入1.5 mL EP離心管中靜置，3 500 r/min，離心10 min，分離血清，分裝于1.5 mL 凍存管中，-80 ℃冰箱冷貯待檢。

1.4.5 檢測方法 應用全自動生化分析儀(購買相應試劑盒)，采用終點法檢測TC、TG、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。采用ELISA 方法檢測小鼠ApoA5的含量。按照ApoA5 試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1 三葉片對高脂模型小鼠TG、TC的影響(見表1)

表1 三葉片對高脂模型小鼠TG、TC的影響(±s)

2.2 三葉片對高脂模型小鼠LDL-C、HDL-C的影響(見表2)

表2 三葉片對高脂模型小鼠LDL-C、HDL-C的影響(±s)

2.3 三葉片對高脂模型小鼠ApoA5濃度的影響(見表3)

表3 三葉片對高脂模型小鼠ApoA5濃度的影響(±s)

3 討 論

在我國高脂血癥，尤其是高三酰甘油血癥的發(fā)病率較歐美國家升高，這可能與我國人民的飲食結構以及遺傳基因有關。眾所周知，血脂異常是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要危險因素，與心腦血管病的發(fā)病率和病死率相關聯(lián)；因此，改善脂質代謝紊亂是防治心腦血管疾病的重要措施之一。

中醫(yī)藥在改善脂質代謝紊亂方面具有整體調節(jié)的優(yōu)點。中醫(yī)學沒有“高脂血癥”的病名，其應屬于中醫(yī)“痰濁”“血濁”等范疇。其病機屬本虛標實，其發(fā)生本源在脾，根本在腎，與肝、膽、心、肺密切相關。標實為痰瘀阻滯于脈[5-6]。三葉糖脂清(最新劑型為三葉片)湯劑是天津中醫(yī)藥大學張伯禮教授的臨床經(jīng)驗方，源自宋代《太平圣惠方》，為復方中藥，組方包括山楂、桑葉、荷葉、赤芍、丹參五味中藥組成。本方從痰瘀立論，以健脾除濕、 利水祛痰、活血逐瘀為原則，符合中醫(yī)對高脂血癥的認識。同時，三葉糖脂清(三葉片為其最新劑型)有良好的藥理毒理、動物實驗、臨床實驗等基礎研究[7-12]，證明有很好的改善脂代謝紊亂作用，但其作用機制尚需深入研究。vander Vliet等[4]通過研究證明，ApoA5 過表達伴腺病毒轉染的小鼠與野生型小鼠相比，其血漿TG水平降低了70%，且所降低的血漿TG依賴于極低密度脂蛋白(VLDL)降低的部分。而ApoA5基因敲除的小鼠則與此相反，其血漿TG水平較對照組增加4倍。以上結果表明，ApoA5與血漿TG水平間呈負相關，缺乏正常運作的 ApoA5是高TG血癥的危險因素之一?；谀壳皣鴥韧馊狈χ兴幫ㄟ^調節(jié)ApoA5蛋白改善脂代謝作用研究，因而中藥改善脂代謝紊亂的作用是否與ApoA5有關將成為進一步研究的重點，為中藥降脂作用機制研究拓展方向。

本項研究證實，與模型組相比，三葉片能夠不同程度地降低實驗性高脂小鼠TC、TG水平(P<0.01)。在降低TG方面，三葉片高、低劑量組與非諾貝特組及血脂康組比較差異無統(tǒng)計學意義，三葉片高、低劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。在降低TC方面，各治療組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，各治療組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明三葉片降低TC作用與非諾貝特、血脂康具有等效性。在LDL-C方面，各治療組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，從數(shù)值上看有下降趨勢，很可能與動物數(shù)少及灌藥時間短有關。在HDL-C方面，各治療組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，模型組較其他治療組高，表明各治療組無升高HDL-C作用。通過ELISA法檢測高脂小鼠血清中ApoA5的濃度，除三葉片高劑量組外，其余治療組均高于模型組，各治療組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。提示三葉片有降低TG、TC作用，降低TG不優(yōu)于非諾貝特及血脂康組；降低TC作用與非諾貝特及血脂康組具有等效性；三葉片高、低劑量組在降低TG、TC方面差異無統(tǒng)計學意義。并且TG、TC濃度與ApoA5含量呈負相關，由此推斷，三葉片調脂作用機制很可能是通過影響ApoA5實現(xiàn)的。以上實驗結論提示中藥降脂作用，很可能通過調控ApoA5基因，影響ApoA5蛋白進而改善脂質代謝紊亂，從而為中藥調脂作用機制研究提供依據(jù)，拓展思路。

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Effect of Sanye Tablets on Serum Apolipoprotein A5 in Mice with Hyperlipidemia

Lu Meijuan，Wang Baohe，Xu Qiang，Zhuang Jianguo

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；Second Affiliated Hospital，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China

Wang Baohe (Second Affiliated Hospital，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin，China)

Objective To observe the effect of Sanye tablets (SYT) on serum apolipoprotein A5 (ApoA5) in mice with hyperlipidemia.Methods The hyperlipidemia mice model were established by high fat diet.After giving SYT，enofibrate and Xuezhikang for 30 days，the serum ApoA5 level was detected by ELISA method.Results There was differences in the content of ApoA5 between model group and the normal control group，Xuezhikang group，fenofibrate group，SYT low dose group (P<0.05 or P<0.01).There was no difference in the content of ApoA5 between fenofibrate group and Xuezhikang group，SYT high dose group，SYT low dose group (P>0.05).There was no difference in the content of ApoA5 between SYT high dose group and SYT low dose group (P>0.05).Conclusion SYT has lipid-lowering effect，which is likely to be affected by ApoA5.The lipid lowering effect of SYT is not dose dependent.

hyperlipidemia；Sanye tablets；apolipoprotein A5；blood lipids；phlegm

國家自然科學基金(No.8117634)；天津市衛(wèi)生和計劃生育委員會中醫(yī)中西醫(yī)結合科研課題(No.2015117)

1.天津中醫(yī)藥大學(天津 300193)；2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院(天津 300150)

王保和，E-mail：lmj830127@163.com

信息：路美娟，王保和，徐強，等.三葉片對實驗性高脂小鼠血清載脂蛋白A5的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(19)：2390-2392.

R589.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.19.007

1672-1349(2017)19-2390-03

2017-02-19)

(本文編輯 郭懷印)