于珊，張妙坤，馬旅雁

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

·醫(yī)學(xué)生物技術(shù)·

乳酸鋅和氟化亞錫對(duì)銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和變異鏈球菌生物被膜的抑制作用

于珊1，張妙坤2，馬旅雁1

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

乳酸鋅(Zn lactate·3H2O)和氟化亞錫(SnF2)常作為牙膏中的活性物質(zhì)添加劑用來(lái)預(yù)防齲齒及口腔生物被膜的形成。文中評(píng)估了Zn lactate·3H2O和SnF2對(duì)銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和變異鏈球菌生物被膜的作用。對(duì)銅綠假單胞菌PAO1生物被膜的抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)乳酸鋅和氟化亞錫都具有抑制其生物被膜的功能，聯(lián)用效果尤佳。乳酸鋅通過(guò)干擾胞外多糖基質(zhì)網(wǎng)的形成起作用，而氟化亞錫則可以明顯降低生物被膜的生物量。更為重要的是，工作濃度的兩種化合物聯(lián)用幾乎可以完全抑制3種實(shí)驗(yàn)菌株生物被膜的形成。

銅綠假單胞菌，乳酸鋅，氟化亞錫，生物被膜，鮑曼不動(dòng)桿菌，變異鏈球菌

生物被膜(Biofilm)是指單細(xì)胞微生物通過(guò)粘附于介質(zhì)表面，分泌胞外多聚基質(zhì)(胞外多糖、蛋白、DNA等)，將其自身包繞其中而成的膜樣微生物細(xì)胞聚集物[1]。銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌都是易形成生物被膜的條件致病菌[2-3]，其造成的感染通常與形成生物被膜后大幅升高的抗生素抗性相關(guān)[4-5]，因而被作為研究生物被膜的模式菌株。牙菌斑是生物被膜的一種，是一個(gè)以細(xì)菌為主定殖于牙面的微生態(tài)壞境，是細(xì)菌在牙面上生存、代謝、致病的具體環(huán)境[6]。在一定條件下，細(xì)菌及其產(chǎn)物會(huì)對(duì)牙體和牙周組織產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致口腔感染性疾病[7]。牙齒硬組織長(zhǎng)期暴露在如鏈球菌屬、乳酸菌屬或放線菌屬等致齲細(xì)菌產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物下就會(huì)造成齲齒的發(fā)生[7-9]。變異鏈球菌既產(chǎn)酸又耐酸，定殖在牙齒上后會(huì)引起琺瑯質(zhì)的去礦化作用[10]。尤其是，變異鏈球菌還具有較強(qiáng)的生物被膜的形成能力，因此，被認(rèn)為是造成齲齒的主要病因之一[11]。有效地抑制這些病原菌的生長(zhǎng)及生物被膜的產(chǎn)生是防治和治療齲齒的關(guān)鍵手段[12]。

鋅鹽可以置換磷酸鈣中的鈣，抑制牙垢的生成，對(duì)口腔粘膜和牙周組織具有收斂作用[13]，鋅離子還具有出色的抗菌能力，不僅可以抑制牙菌斑細(xì)菌的產(chǎn)酸，還可以預(yù)防口臭的產(chǎn)生[13-14]；亞錫可通過(guò)降低牙釉質(zhì)在酸中的溶解度和增強(qiáng)釉質(zhì)再礦化預(yù)防齲齒發(fā)生[15-18]。有關(guān)的原位研究表明，鋅離子與氟聯(lián)用，可以增加礦物質(zhì)在牙齒的沉淀，顯著降低牙齒的去礦化作用，而這種效果在僅僅應(yīng)用氟的實(shí)驗(yàn)組中并未觀察到[19]。因而鋅離子、亞錫離子與氟經(jīng)常作為活性物質(zhì)加入到牙膏中。由于鋅離子、亞錫離子與氟這些活性物質(zhì)對(duì)生物被膜的影響及其相應(yīng)作用機(jī)理尚不明確，本研究檢測(cè)了乳酸鋅(Zn lactate·3H2O)和氟化亞錫(SnF2)對(duì)最常用于生物被膜研究的模式菌株銅綠假單胞菌、條件致病菌鮑曼不動(dòng)桿菌和引起齲齒的主要細(xì)菌變異鏈球菌生物被膜形成能力的影響，發(fā)現(xiàn)兩種化合物對(duì)生物被膜的形成均具有明顯的抑制作用，且兩種化合物聯(lián)用可以使生物被膜幾乎不能形成。該研究結(jié)果揭示了乳酸鋅和氟化亞錫的作用機(jī)理，并暗示了這些化合物用于抑制生物被膜形成的可能應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

本研究所選用的菌株為銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa的模式菌株P(guān)AO1、鮑曼不動(dòng)桿菌桿菌Acinetobacter baumanniiATCC19606和變異鏈球菌Streptococcus mutansUA159；實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基配方如下：

LB培養(yǎng)基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g；

Jensen’s培養(yǎng)基(1 L)：NaCl5 g，K2HPO43.286 g，谷氨酸15.56 g，纈氨酸2.81 g，苯丙氨酸1.32 g；葡萄糖277.4 g，MgSO4·7H2O0.33 g，CaCl20.021 g，F(xiàn)eSO40.0011 g，ZnSO40.0024 g；

LBNS培養(yǎng)基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g；

BHI培養(yǎng)基(1 L)：腦心浸液37 g，蔗糖10 g。

銅綠假單胞菌的菌液于37℃培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，生物被膜于30℃靜置培養(yǎng)于LB或Jensen’s培養(yǎng)基；鮑曼不動(dòng)桿菌于37℃培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基；變異鏈球菌于37℃培養(yǎng)于BHI培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

Zn lactate·3H2O與SnF2由寶潔公司提供；菌細(xì)胞用DNA染料SYTO9購(gòu)自Invitrogen公司，Psl多糖染料TRITC-HHA購(gòu)自EY LABORATORIES公司。

1.3 96孔板中生物被膜的形成能力檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)參照 Ma等的方法[20]進(jìn)行，具體實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)述如下：將菌株的過(guò)夜培養(yǎng)液以1%體積接種于96孔微量滴定板中(Falcon3911)，于30℃或37℃靜置培養(yǎng)24 h，用生理鹽水將游離及松散吸附的菌細(xì)胞洗脫，隨即用0.1%的結(jié)晶紫對(duì)小孔內(nèi)牢固吸附的菌細(xì)胞染色30min，最后30%乙酸溶解并用分光光度計(jì)讀取A560值。

1.4 生物被膜的抑制及瓦解實(shí)驗(yàn)

在生物被膜抑制實(shí)驗(yàn)中，Zn lactate·3H2O與SnF2在接種時(shí)即添加入培養(yǎng)基中；在生物被膜瓦解實(shí)驗(yàn)中，生物被膜于培養(yǎng)基中長(zhǎng)成后，將培養(yǎng)基更換為含有Zn lactate·3H2O與SnF2的新鮮培養(yǎng)基再處理一段時(shí)間，Zn lactate·3H2O與SnF2的工作濃度分別為2mmol/L和2.5mmol/L。生物被膜在96孔板、24孔板及4孔玻璃小室中的培養(yǎng)時(shí)間均為24 h。

1.5 銅綠假單胞菌氣液交界面形成菌膜的圖像獲取與分析

氣液交界面形成的菌膜參照Wang等的方法[21]于24孔板及1 cm×1 cm×4 cm大小的4孔玻璃小室(Chambered #1.5 German Coverglass System,Nunc Inc.)中經(jīng)24 h靜置培養(yǎng)而成。24孔板中形成的菌膜分別由相機(jī) Nikon COOLPIX P500及體視顯微鏡 Nikon MODEL C-DSS230觀察拍攝。

進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察前，生物被膜中的菌細(xì)胞用DNA染料SYTO9標(biāo)記；Psl多糖用100μg/mL熒光標(biāo)記凝集素TRITC-HHA染色[22]，熒光圖片由激光共聚焦顯微鏡FV1000(Olympus,Japan)攝取，并應(yīng)用 COMSTAT軟件對(duì)生物被膜的生物量和厚度進(jìn)行定量計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鋅(Zn lactate·3H2O)和氟化亞錫(SnF2)對(duì)銅綠假單胞菌96孔板中生物被膜形成的抑制

本研究將Zn lactate·3H2O和SnF2兩種化合物分別或共同加入到LBNS培養(yǎng)基中，以未添加化合物的培養(yǎng)基為對(duì)照，檢測(cè)其對(duì)銅綠假單胞菌PAO1在96孔板中于4 h、8 h及24 h時(shí)所形成生物被膜生物量的影響。結(jié)果如圖1所示，兩種化合物在實(shí)驗(yàn)所測(cè)時(shí)間均對(duì)PAO1的生物被膜形成具有明顯的抑制作用，單一添加入培養(yǎng)基中時(shí)兩種化合物的抑制能力相當(dāng)。同時(shí)添加兩種化合物的實(shí)驗(yàn)組對(duì) PAO1生物被膜的抑制最強(qiáng)，幾乎不隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，24 h的生物量與對(duì)照組和單一化合物實(shí)驗(yàn)組相比呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。

圖1 Zn lactate·3H2O 與 SnF2對(duì)銅綠假單胞菌PAO1在96孔板中4 h、8 h及24 h形成生物被膜的抑制(*P<0.05; **P<0.01)Fig.1 Zn lactate·3H2O and SnF2reduced4 h,8 h and24 h biofilm formation of PAO1 in96-well Micro-titer Dish(*P<0.05; **P<0.01).

2.2 Zn lactate·3H2O 與 SnF2對(duì) PAO1在24孔板中形成的菌膜的抑制

銅綠假單胞菌在靜置培養(yǎng)時(shí)，在氣液交界面形成的一種生物被膜稱(chēng)為“菌膜(Pellicle)”。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了兩種化合物對(duì)銅綠假單胞菌PAO1在24孔板中形成的菌膜的抑制效果，肉眼直接觀察及體視顯微鏡的觀察結(jié)果如圖2所示。單獨(dú)添加Zn lactate·3H2O或SnF2即可明顯抑制氣液交界面生物被膜的形成，呈現(xiàn)為具有更高透光性的更薄的菌膜，且易在處理時(shí)破碎。而加入兩種化合物的LBNS培養(yǎng)基中幾乎不能形成菌膜，提示Zn lactate·3H2O與SnF2的聯(lián)用可以清除PAO1菌膜的形成。

圖2 Zn lactate·3H2O 與 SnF2對(duì) PAO1在24孔板中形成的菌膜的抑制Fig.2 Zn lactate·3H2O and SnF2reduced pellicle formation of PAO1 in24-well plate.Left: camera image of pellicles; right: stereomicroscope image of pellicles.

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察乳酸鋅與氟化亞錫對(duì)PAO1生物被膜的影響

通過(guò)綠色熒光標(biāo)記銅綠假單胞菌菌細(xì)胞的方法，研究進(jìn)一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察了 Zn lactate·3H2O與 SnF2對(duì) PAO1形成的24 h菌膜生物量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。培養(yǎng)基中添加2.5mmol/L的Zn lactate·3H2O所形成的菌膜結(jié)構(gòu)松散，熒光強(qiáng)度較弱，但對(duì)熒光信號(hào)的計(jì)算結(jié)果并未顯示出菌膜生物量的下降；而添加了2mmol/L SnF2的LBNS培養(yǎng)基中的菌膜生物量顯著降低，僅為對(duì)照組的1/4左右；在添加了兩種化合物的實(shí)驗(yàn)組中則幾乎不能觀察到菌膜細(xì)胞，與之前的結(jié)果相一致——Zn lactate·3H2O與SnF2聯(lián)用可完全抑制PAO1的生物被膜的形成。

為進(jìn)一步闡釋Zn lactate·3H2O與SnF2兩種化合物對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1生物被膜的抑制機(jī)理，本研究用綠色熒光標(biāo)記菌細(xì)胞，紅色熒光標(biāo)記胞外多糖Psl，在激光共聚焦顯微鏡下觀察兩種化合物對(duì)胞外多糖基質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖4所示。乳酸鋅的添加使PAO1的Psl多糖基質(zhì)網(wǎng)更為疏松，且顯示為較弱的紅色熒光信號(hào)，雖然乳酸鋅的添加并不能減少生物被膜的生物量(圖3)，但通過(guò)對(duì)圖4熒光信號(hào)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在Zn lactate·3H2O的作用下，每細(xì)胞所產(chǎn)生的Psl多糖的產(chǎn)量減少至對(duì)照組的1/15；氟化亞錫除了能明顯抑制生物被膜的形成外(圖3)，還明顯改變了Psl多糖基質(zhì)網(wǎng)的空間結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組相比，菌株喪失了形成典型3D蜘蛛網(wǎng)狀Psl多糖網(wǎng)的能力，結(jié)構(gòu)松散且不規(guī)則(圖4)；而兩種化合物聯(lián)用則在鏡下完全觀察不到Psl多糖信號(hào)和菌細(xì)胞的存在。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)PAO1生物被膜形成的影響(綠色熒光信號(hào)為DNA染料SYTO9標(biāo)記的銅綠假單胞菌細(xì)胞)Fig.3 Zn lactate·3H2O and SnF2biofilm inhibition effect of PAO1 observed by CLSM.Green fluorescent signal:Pseudomonas aeruginosacells stained by DNA dye SYTO9.

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì) PAO1菌膜中Psl多糖基質(zhì)網(wǎng)的影響(綠色熒光信號(hào)為DNA染料SYTO9標(biāo)記的銅綠假單胞菌細(xì)胞；紅色熒光信號(hào)為熒光標(biāo)記凝集素TRITC-HHA染色Psl多糖基質(zhì)網(wǎng))Fig.4 Zn lactate·3H2O and SnF2effect on Psl matrix observed by CLSM.Green fluorescent signal:Pseudomonas aeruginosacells stained by DNA dye SYTO9.Red fluorescent signal: Psl matrix stained by TRITC-HHA.

2.4 Zn lactate·3H2O 與 SnF2對(duì) PAO196 孔板中形成生物被膜的瓦解能力

Zn lactate·3H2O與SnF2兩種化合物都對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1的生物被膜形成有明顯的抑制作用，那么其是否對(duì)已經(jīng)形成的生物被膜具有瓦解作用呢？本研究于96孔板Jensen’s培養(yǎng)基中長(zhǎng)成的生物被膜中，將培養(yǎng)基更換為添加了兩種化合物的新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)作用一段時(shí)間后，觀察其對(duì)生物被膜生物量的影響。結(jié)果如圖5所示，除了開(kāi)始0.5 h內(nèi)，2mmol/L的SnF2可使已形成的生物被膜的生物量稍稍降低一點(diǎn)以外，在長(zhǎng)達(dá)24 h的作用期間，未觀察到兩種化合物對(duì)PAO1的生物被膜具有瓦解作用。

圖5 Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)PAO1生物被膜的瓦解作用(*P<0.05)Fig.5 Zn lactate·3H2O and SnF2biofilm dispersion effect of PAO1(*P<0.05).

2.5 Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)96孔板中鮑曼不動(dòng)桿菌和變異鏈球菌形成生物被膜的抑制

為了解乳酸鋅和氟化亞錫是可形成生被膜的革蘭氏陰性細(xì)菌鮑曼不動(dòng)桿菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌變異鏈球菌生物被膜的作用，分別在96孔板中進(jìn)行了對(duì)這兩種細(xì)菌24 h生物被膜的抑制與降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果圖6所示，兩種化合物對(duì)其生物被膜的形成均有明顯的抑制作用(圖6)，而不具瓦解其生物被膜能力。

圖6 Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)96孔板中鮑曼不動(dòng)桿菌(A)和變異鏈球菌(B)形成生物被膜的抑制與瓦解作用(Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)96孔板中鮑曼不動(dòng)桿菌(A)和變異鏈球菌形(B)成生物被膜的抑制作用；Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)96孔板中鮑曼不動(dòng)桿菌(C)和變異鏈球菌(D)形成生物被膜0.5 h和24 h的瓦解作用(*P<0.05; **P<0.01))Fig.6 Zn lactate·3H2O and SnF2biofilm inhibition and dispersal effect onAcinetobacter baumanniiandStreptococcusmutans.Zn lactate·3H2O and SnF2biofilm inhibition effect onAcinetobacter baumannii(A)andStreptococcus mutans(B); Zn lactate·3H2O and SnF2biofilm dispersal effect onAcinetobacter baumannii(C)andStreptococcus mutans(D)at0.5 h or24 h(*P<0.05; **P<0.01).

2.6 Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和變異鏈球菌生長(zhǎng)的抑制

為進(jìn)一步探求工作濃度的乳酸鋅和氟化亞錫對(duì)銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和變異鏈球菌生物被膜形成的抑制作用是否是因?yàn)橥瑫r(shí)抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)所造成的，研究檢測(cè)了在培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)3種細(xì)菌的OD600值。結(jié)果如圖7所示，實(shí)驗(yàn)所采取的兩種化合物的工作濃度添加入培養(yǎng)基后，對(duì)3種細(xì)菌的生長(zhǎng)均起到了明顯的抑制作用，其中兩種物質(zhì)聯(lián)用對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響是其抑制生物被膜形成的主要因素。

圖7 Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)液體振蕩培養(yǎng)的銅綠假單胞菌(A)鮑曼不動(dòng)桿菌(B)和變異鏈球菌形(C)24 h時(shí)的生長(zhǎng)抑制作用(**P<0.01)Fig.7 24 h growth inhibition effect onPseudomonas aeruginosa(A),Acinetobacter baumannii(B)andStreptococcus mutans(C)by Zn lactate·3H2O and SnF2(**P<0.01).

3 討論

通過(guò)近年來(lái)對(duì)牙菌斑生物被膜的大量深入研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到牙菌斑生物被膜是存在于牙面或牙周袋內(nèi)的一個(gè)細(xì)菌生態(tài)環(huán)境，是造成人類(lèi)兩大口腔疾病齲齒和牙周病的始動(dòng)因子[23]。氟化物與牙齒接觸后，可使牙齒組織中易被酸溶解的氫氧磷灰石形成不易溶的氟磷灰石，從而提高了牙齒的抗腐蝕能力，除了預(yù)防齲齒的功效外，還有較好的控制牙齦炎、減輕牙本質(zhì)敏感的功能。此外，鋅離子可以置換磷酸鈣里的鈣，抑制牙垢晶體的生長(zhǎng)，從而防治牙垢的產(chǎn)生，因此常常在抗齲防敏牙膏中添加鋅鹽和亞錫離子。

本研究過(guò)對(duì)兩種化合物Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和變異鏈球菌生物被膜形成能力的影響檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，單一添加2.5mmol/L的Zn lactate·3H2O或2mmol/L的SnF2即對(duì)生物被膜的形成具有明顯的抑制作用，而同時(shí)添加兩種化合物即可完全消除生物被膜的產(chǎn)生，提示這兩種化合物具有較大的清除生物被膜的應(yīng)用潛力。

Psl多糖對(duì)于銅綠假單胞菌菌體的初始吸附、生物被膜結(jié)構(gòu)的維持以及提供細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與介質(zhì)表面的相互作用至關(guān)重要[20,24-25]，研究通過(guò)分別對(duì)生物被膜中的菌細(xì)胞和胞外多糖Psl進(jìn)行熒光標(biāo)記并用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)兩種化合物可能存在對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的不同抑制機(jī)理：?jiǎn)我籞n lactate·3H2O作用的菌膜其胞外基質(zhì)網(wǎng)中觀測(cè)到單個(gè)細(xì)胞的Psl多糖合成量大大降低，幾乎降至未處理組的1/45，提示Zn lactate·3H2O可能通過(guò)抑制胞外多糖合成或基質(zhì)網(wǎng)的形成干擾生物被膜的發(fā)生；而SnF2作用的菌膜的生物量大幅降低為對(duì)照組的1/5，且胞外 Psl多糖基質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的松散型改變。以上結(jié)果解釋了兩種化合物聯(lián)用即可達(dá)到完全清除 PAO1生物被膜形成的機(jī)制——SnF2明顯減少生物被膜的生物量且形成形態(tài)疏松的Psl網(wǎng)絡(luò)，而Zn lactate·3H2O大大減少了每個(gè)菌細(xì)胞的Psl的合成量，因此兩者共用可起到雙重作用，因而產(chǎn)生顯著的清除效果。進(jìn)一步的檢測(cè)顯示，這兩種化合物對(duì)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)也有抑制作用，且兩種化合物聯(lián)用時(shí)的抑制作用最為顯著。因此，Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的影響可能是通過(guò)改變多糖基質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)及對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用的共同結(jié)果。

變異鏈球菌是口腔主要的致齲齒菌之一，常見(jiàn)于牙菌斑中，可通過(guò)代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)導(dǎo)致齲齒的發(fā)生。鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染的重要病原菌。近年來(lái)的感染在增多，且其耐藥性日益嚴(yán)重，已引起臨床和微生物學(xué)者的嚴(yán)重關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)添加Zn lactate·3H2O與SnF2對(duì)這兩種細(xì)菌形成的生物被膜也有明顯的抑制作用。但同銅綠假單胞菌一樣，兩種化合物對(duì)其已經(jīng)形成的生物被膜的瓦解作用并不顯著，可能由于外源添加較高濃度的乳酸鋅和氟化亞錫的不利環(huán)境使菌細(xì)胞更傾向于停留在生物被膜內(nèi)受到保護(hù)，而并非游離出來(lái)。只有0.5 h內(nèi)2mmol/L的SnF2作用下可使銅綠假單胞菌PAO1已形成的生物被膜的生物量略有下降，而牙膏在口腔內(nèi)的作用時(shí)間通常較短，并伴以劇烈的物理刷洗過(guò)程，因此SnF2也可能具備一定的清除口腔生物被膜的潛質(zhì)。鋅離子和錫離子均有報(bào)道認(rèn)為其有潛在的抗菌活性[26]，而氟離子則是通過(guò)使牙齒礦化堅(jiān)硬而起到抗敏和預(yù)防齲齒的作用[27]，因此實(shí)驗(yàn)中兩種化合物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和生物被膜的抑制應(yīng)是鋅錫兩種離子的應(yīng)用效果。本研究認(rèn)為，在牙膏中外源添加 Zn lactate·3H2O 與 SnF2具有對(duì)抗牙菌斑生物被膜造成的口腔疾病的潛在應(yīng)用價(jià)值，且工作濃度的乳酸鋅和氟化亞錫的應(yīng)用亦可在臨床生物被膜防治中發(fā)揮作用。

[1]Karatan E, Watnick P.Signals, regulatory networks,and materials that build and break bacterial biofilms.Microbiol Mol Biol Rev,2009,73(2):310–347.

[2]Donlan RM.Biofilms: microbial life on surfaces.Emerg Infect Dis,2002,8(9):881–890.

[3]Gurung J, Khyriem AB, Banik A, et al.Association of biofilm production with multidrug resistance among clinical isolates ofAcinetobacter baumanniiandPseudomonas aeruginosafrom intensive care unit.Indian J Crit Care Med,2013,17(4):214–218.

[4]Hota S, Hirji Z, Stockton K, et al.Outbreak of multidrug-resistantPseudomonasaeruginosacolonization and infection secondary to imperfect intensive care unit room design.Infect Control Hosp Epidemiol,2009,30(1):25–33.

[5]La Forgia C, Franke J, Hacek DM, et al.Management of a multidrug-resistantAcinetobacter baumanniioutbreak in an intensive care unit using novel environmental disinfection: a38-month report.Am J Infect Control,2010,38(4):259–263.

[6]Kensche A, Holder C, Basche S, et al.Efficacy of a mouthrinse based on hydroxyapatite to reduce initial bacterial colonisationin situ.Arch Oral Biol,2017,80:18–26.

[7]Selwitz RH, Ismail AI, Pitts NB.Dental caries.Lancet,2007,369(9555):51–59.

[8]Bowden GH, Ekstrand J, McNaughton B, et al.The association of selected bacteria with the lesions of root surface caries.Oral Microbiol Immunol,1990,5(6):346–351.

[9]Gross EL, Beall CJ, Kutsch SR, et al.BeyondStreptococcus mutans: dental caries onset linked to multiple species by,16S rRNA community analysis.PLoS ONE,2012,7(10): e47722.

[10]Marsh PD.Dental plaque as a biofilm and a microbial community-implications for health and disease.BMC Oral Health,2006,6 Suppl1: S14.

[11]Ho CSF, Ming Y, Foong KWC, et al.Streptococcus mutansforms xylitol-resistant biofilm on excess adhesive flash in novelex-vivoorthodontic bracket model.Am J Orthod Dentofacial Orthop,2017,151(4):669–677.

[12]Wang YF, Fan YY, Zhou ZL, et al.De novosynthetic short antimicrobial peptides against cariogenic bacteria.Arch Oral Biol,2017,80:41–50.

[13]Navada R, Kumari H, Le S, et al.Oral malodor reduction from a zinc-containing toothpaste.J Clin Dent,2008,19(2):69–73.

[14]Fatima T, Rahim ZBHA, Lin CW, et al.Zinc: a precious trace element for oral health care? J Pak Med Assoc,2016,66(8):1019–1023.

[15]Ganss C, Lussi A, Grunau O, et al.Conventional and anti-erosion fluoride toothpastes: effect on enamel erosion and erosion-abrasion.Caries Res,2011,45(6):581–589.

[16]Huysmans MCDNJM, Jager DHJ, Ruben JL, et al.Reduction of erosive wearin situby stannous fluoride-containing toothpaste.Caries Res,2011,45(6):518–523.

[17]Young A, Thrane PS, Saxegaard E, et al.Effect of stannous fluoride toothpaste on erosion-like lesions: anin vivostudy.Eur J Oral Sci,2006,114(3):180–183.

[18]Faller RV, Eversole SL, Tzeghai GE.Enamel protection: a comparison of marketed dentifrice performance against dental erosion.Am J Dent,2011,24(4):205–210.

[19]ten Cate JM.The caries preventive effect of a fluoride dentifrice containing Triclosan and zinc citrate, a compilation ofin vitroandin situstudies.Int Dent J,1993,43(4 Suppl1):407–413.

[20]Ma LY, Jackson KD, Landry RM, et al.Analysis ofPseudomonas aeruginosaconditionalpslvariants reveals roles for thepslpolysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment.J Bacteriol,2006,188(23):8213–8221.

[21]Wang SW, Parsek MR, Wozniak DJ, et al.A spiderweb strategy of type IV pili-mediated migration to build a fibre-like Psl polysaccharide matrix inPseudomonas aeruginosabiofilms.Environ Microbiol,2013,15(8):2238–2253.

[22]Ma LY, Conover M, Lu HP, et al.Assembly and development of thePseudomonas aeruginosabiofilm matrix.PLoS Pathog,2009,5(3): e1000354.

[23]Takahashi N, Washio J, Mayanagi G.Metabolomics of supragingival plaque and oral bacteria.J Dent Res,2010,89(12):1383–1388.

[24]Yang L, Hu YF, Liu Y, et al.Distinct roles of extracellular polymeric substances inPseudomonas aeruginosabiofilm development.Environ Microbiol,2011,13(7):1705–1717.

[25]Ruer S, Stender S, Filloux A, et al.Assembly of fimbrial structures inPseudomonas aeruginosa:functionality and specificity of chaperone-usher machineries.J Bacteriol,2007,189(9):3547–3555.

[26]Soares LG, Jonski G, Tinoco EMB, et al.Short-term effect of strontium-and zinc-containing toothpastes and mouthrinses on volatile sulphur compounds in morning breath: a randomized,double-blind, cross-over clinical study.Eur J Oral Sci,2015,123(2):72–79.

[27]Orsini G, Procaccini M, Manzoli L, et al.A double-blind randomized-controlled trial comparing the desensitizing efficacy of a new dentifrice containing carbonate/hydroxyapatite nanocrystals and a sodium fluoride/potassium nitrate dentifrice.J Clin Periodontol,2010,37(6):510–517.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Anti-biofilm effects of Zn lactate·3H2O and SnF2onPseudomonas aeruginosa,Acinetobacter baumanniiandStreptococcus mutans

Shan Yu1, Miaokun Zhang2, and Luyan Ma1
1Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China
2University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China

Zn lactate and SnF2were used as active compounds in the dentifrice.Here, their anti-biofilm effects were evaluated onPseudomonas aeruginosa,Acinetobacter baumanniiandStreptococcus mutans.The biofilm prevention/dispersal assay ofP.aeruginosaPAO1 demonstrated that Zn lactate and SnF2can inhibit biofilm formation independently or by combined treatment.Zn lactate disrupted extracellular polysaccharides matrix formation and SnF2reduced the biomass of biofilm.Most importantly, the combination of Zn lactate and SnF2thoroughly abolished the biofilm formation of all three strains.

Pseudomonas aeruginosa, Zn lactate·3H2O, SnF2, biofilm,Acinetobacter baumannii,Streptococcus mutans

April5,2017;Accepted:June12,2017

Lüyan Ma.Tel: +86-10-64807437; Fax: +86-10-64806101; E-mail: luyanma27@im.ac.cn

于珊, 張妙坤, 馬旅雁.乳酸鋅和氟化亞錫對(duì)銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和變異鏈球菌生物被膜的抑制作用.生物工程學(xué)報(bào),2017,33(9):1478–1488.

Yu S, Zhang MK, Ma LY.Anti-biofilm effects of Zn lactate·3H2O and SnF2onPseudomonas aeruginosa,Acinetobacter baumanniiandStreptococcus mutans.Chin J Biotech,2017,33(9):1478–1488.

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2014CB846002), National Natural Science Foundation of China(No.31570126), Funding from Procter & Gamble Technology(Beijing)Co., Ltd.

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2014CB846002)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31570126)，北京寶潔技術(shù)有限公司資助。

馬旅雁 博士，研究員，博士生導(dǎo)師。1996年于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲理學(xué)博士學(xué)位；中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”入選者；中國(guó)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)會(huì)微生物生物技術(shù)分會(huì)理事；擔(dān)任Microbiol Open副主編，F(xiàn)ront Microbiol編委。主要致力于細(xì)菌生物被膜(Biofilm，亦稱(chēng)生物膜)的研究，旨在了解細(xì)菌的群體行為以及微生物間的信息交流，解析細(xì)菌生物被膜形成與瓦解的分子機(jī)理，為環(huán)境治理中有效發(fā)揮生物被膜的功能奠定理論基礎(chǔ)，為防治和控制生物被膜相關(guān)問(wèn)題提供理論依據(jù)及可能的解決辦法。