劉春妍，郭松，艾力·吐熱克，張俊威，張力群

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理系，北京 100193

·農(nóng)業(yè)生物技術(shù)·

不動(dòng)桿菌屬中aidE基因編碼高絲氨酸內(nèi)酯酶

劉春妍*，郭松*，艾力·吐熱克，張俊威，張力群

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理系，北京 100193

群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)是細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中形成的依賴于群體密度的細(xì)菌間交流方式。許多革蘭氏陰性細(xì)菌以N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)為信號(hào)分子，感應(yīng)自身群體密度并調(diào)控致病基因表達(dá)。因此，淬滅AHLs信號(hào)分子可防治此類細(xì)菌引起的植物病害。本實(shí)驗(yàn)室前期已篩選得到了一株具有AHLs信號(hào)降解能力的不動(dòng)桿菌菌株Acinetobactersp.77，本研究通過(guò)基因組文庫(kù)篩選，自菌株77中克隆得到具有AHLs降解活性的基因aidE。該基因編碼268個(gè)氨基酸。序列一致性比較發(fā)現(xiàn)aidE的氨基酸序列與吉倫伯不動(dòng)桿菌Acinetobacter gyllenbergiiCIP110306中β-內(nèi)酰胺酶一致性高達(dá)95%，但與已知的AHLs降解酶序列一致性較低，最高為緩黃分支桿菌Mycobacterium lentiflavum中AHL內(nèi)酯酶AttM/AiiB家族蛋白(CQD23908.1)，一致性僅為33%。通過(guò)高壓液相色譜(HPLC)分析AidE蛋白處理N-己酰基高絲氨酸內(nèi)酯(C6-HSL)的反應(yīng)產(chǎn)物，證明aidE為AHL內(nèi)酯酶。序列比對(duì)研究發(fā)現(xiàn)，aidE基因在不動(dòng)桿菌屬中并不保守，其在菌株77基因組中的上下游的基因排列存在菌株水平的特異性，且aidE基因下游存在疑似 IS 插入序列，上述證據(jù)表明aidE基因有可能是通過(guò)水平轉(zhuǎn)移進(jìn)入Acinetobactersp.77基因組中，或其在基因組中的位置發(fā)生過(guò)重排。表達(dá)aidE的軟腐果膠桿菌Z3-3中完全檢測(cè)不到AHLs信號(hào)產(chǎn)生，且致病力明顯降低。綜上所述，aidE為新發(fā)現(xiàn)的AHL內(nèi)酯酶。在防治依賴QS系統(tǒng)表達(dá)致病性的細(xì)菌病害中具有應(yīng)用潛力。

群體感應(yīng)，?；呓z氨酸內(nèi)酯，不動(dòng)桿菌，aidE

群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)是細(xì)菌間典型的群體密度依賴型交流方式。具有QS系統(tǒng)的細(xì)菌能夠合成并向胞外分泌小分子信號(hào)。信號(hào)分子在胞外環(huán)境中積累并被細(xì)菌識(shí)別，用來(lái)檢測(cè)自身群體密度。當(dāng)細(xì)菌的群體密度達(dá)到一定閾值時(shí)，信號(hào)分子和相應(yīng)受體蛋白結(jié)合，啟動(dòng)下游相關(guān)基因的表達(dá)[1]。

QS系統(tǒng)在革蘭氏陰性細(xì)菌中廣泛存在，植物病原細(xì)菌中絕大多數(shù)以N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)為信號(hào)分子，調(diào)控致病性的表達(dá)，如：胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum中植物細(xì)胞壁降解酶等毒力因子的表達(dá)[2]；根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens中Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移[3]；西瓜食酸菌Acidovorax citrulli的游動(dòng)性和在甜瓜植株及果實(shí)上的致病力[4]；丁香假單胞菌Pseudomonas syringaepv.syringae在宿主植物上的定殖及致病性[5]等。因此，淬滅 AHL信號(hào)分子以破壞細(xì)菌QS調(diào)控功能是防治此類病害的可行策略。

目前已發(fā)現(xiàn)的AHLs信號(hào)降解酶包括內(nèi)酯酶(AHL-lactonase)、?；D(zhuǎn)移酶(AHL-acylase)和氧化還原酶(Oxidoreductases)三大類[6-8]。AHL內(nèi)酯酶通過(guò)水解 AHLs的內(nèi)酯鍵產(chǎn)生脂酰高絲氨酸，破壞信號(hào)分子結(jié)構(gòu)。已報(bào)道的AHL內(nèi)酯酶根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)及金屬離子依賴性的差異可分為不同類群，包括以蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus240B1中AiiA240B1為代表的金屬-β-內(nèi)酰胺類降解酶[9]，蒼白桿菌Ochrobactriumsp.T63中 AidH[10]所屬的α/β-水解酶家族降解酶，紅串紅球菌Rhodococcus erythropolis中磷酸三脂酶家族的QsdA[11]，根瘤菌Rhizobiumsp.strain NGR234中雙烯內(nèi)酯水解酶家族的DhlR[8]等。近年來(lái)利用宏基因組學(xué)方法的研究增加了AHLs降解酶的多樣性。2008年Riaz等從宏基因組文庫(kù)中篩選到編碼AHL-內(nèi)酯酶活性的qlcA基因。2009年Schipper等通過(guò)宏基因組學(xué)篩選到4個(gè)AHL-內(nèi)酯酶：BpiB01、BpiB04、BpiB07和BpiB05，其中BpiB07與已知的內(nèi)酯酶具有一致性，為雙烯內(nèi)酯水解酶家族蛋白，BpiB04為糖基水解酶家族蛋白，而BpiB01和BpiB05則與已報(bào)道的AHL-內(nèi)酯酶沒(méi)有明顯的同源性[12-13]。表達(dá)aiiA基因的軟腐果膠桿菌P.carotovorumAHLs產(chǎn)量明顯減少，在馬鈴薯、白菜、茄子、胡蘿卜和芹菜上造成的軟腐癥狀明顯減弱[9]。表達(dá)AiiA內(nèi)酯酶的轉(zhuǎn)基因植物馬鈴薯、煙草、擬南芥等提高了對(duì)軟腐病菌的侵染抗性，植物不發(fā)病或發(fā)病時(shí)間延后[14-17]。

本實(shí)驗(yàn)室在新疆阿瓦提縣植物根圍土壤中篩選到了一株具有 AHLs信號(hào)分子降解能力的菌株77，經(jīng)16S rRNA基因序列分析鑒定為不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter細(xì)菌。本文通過(guò)基因組文庫(kù)篩選和亞克隆分析，得到具有AHL信號(hào)降解功能的基因aidE，明確了AidE降解AHL信號(hào)的機(jī)制，并初步研究了其生物學(xué)及生物防治功能，為植物病害生防提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株、質(zhì)粒及生長(zhǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)中所用菌株和質(zhì)粒分別列于表1。不動(dòng)桿菌77、熒光假單胞菌2P24和軟腐果膠桿菌Z3-3在LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl5 g/L)中28℃培養(yǎng)；大腸桿菌DH5α、BL21及其衍生菌株在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)；土壤桿菌 NTL4(pZLR4)在ABM 基本培養(yǎng)基(每100mL中含20×鹽溶液5mL、20×緩沖液5mL、10%甘露醇2mL和無(wú)菌水88mL。其中20×鹽溶液：NH4Cl20 g/L、KCl3 g/L、MgSO4·7H2O6 g/L、CaCl2·2H2O0.2 g/L、FeSO4·7H2O0.06 g/L，調(diào)節(jié) pH 為7.2；20×緩沖液：NaH2PO423 g/L、K2HPO460 g/L，調(diào)節(jié) pH為7.0；儲(chǔ)存液分別高壓滅菌保存)中28℃培養(yǎng)?？股厥褂媒K濃度分別為：氨芐青霉素(Ap)50μg/mL，卡那霉素(Km)50μg/mL，氯霉素(Cm)20μg/mL，慶大霉素(Gm)30μg/mL。5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)使用終濃度40μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 DNA試驗(yàn)操作

細(xì)菌染色體及質(zhì)粒DNA的提取、限制性內(nèi)切酶酶切分析和PCR 參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)。核苷酸測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。核苷酸及其編碼的氨基酸序列通過(guò)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的軟件分析。

1.2.2 aidE基因的篩選與克隆

Acinetobactersp.77基因組文庫(kù)的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[22]。隨機(jī)挑取菌株77基因組文庫(kù)轉(zhuǎn)化子，接種到180 μL液體LB培養(yǎng)基中，于28℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；隨后加入15 μL(10 μmol/L)N-3-氧代辛?；呓z氨酸內(nèi)酯(C8-oxo-HSL)信號(hào)分子，混勻后置于搖床上140 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)6 h，分別用信號(hào)純品及純水作對(duì)照；取3 μL培養(yǎng)液滴于預(yù)先制備的報(bào)告菌平板上(見(jiàn)1.2.5)，選取陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切分析后確定目的片段，將其連接至質(zhì)粒pMD18并測(cè)序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.2.3 aidE基因缺失突變體構(gòu)建及AHL信號(hào)降解功能檢測(cè)

根據(jù)aidE基因及側(cè)翼序列的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物77-a、77-b和77-c和77-d(表2)，分別以pQ30為模板，PCR擴(kuò)增得到aidE基因上下兩段側(cè)翼序列。PCR擴(kuò)增條件為：94℃變性5min；94℃變性40，55℃復(fù)性40，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)為35；72℃充分延伸10min。兩條 PCR產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切后連接同一載體pSR47s，得到重組自殺載體pSR47ΔaidE(圖1)。將 pSR47ΔaidE轉(zhuǎn)化 DH5α(λ-pir)，

利用三親交配將pSR47ΔaidE轉(zhuǎn)入Acinetobactersp.77，篩選二次重組突變體，并用檢測(cè)引物AidE-F、AidE-R(表2)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，最終得到aidE基因缺失菌株。為檢測(cè)相關(guān)菌株AHL信號(hào)降解功能，利用Agrobacterium tumefaciensNTL4(pZLR4)信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，在野生型Acinetobactersp.77和aidE基因缺失突變體Acinetobactersp.77 ΔaidE發(fā)酵液中分別加入4μL100μmol/L的C8-oxo-HSL信號(hào)分子純品共培養(yǎng)4 h，設(shè)置dd H2O處理的信號(hào)純品作對(duì)照。

表1 菌株和質(zhì)粒Table1 Strains and plasmids

表2 引物序列Table2 Primer sequences

圖1 質(zhì)粒pQ30(ORF2為aidE)功能片段的物理圖譜及aidE基因的缺失結(jié)構(gòu)Fig.1 Physical map of the functional fragment in pQ30(the ORF2 represents foraidE)and the structure ofaidEgene deletion mutant.

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

軟腐果膠桿菌Z3-3及其相應(yīng)衍生菌接種于5mL的LB培養(yǎng)液中，28℃、140 r/min 水浴搖培至穩(wěn)定生長(zhǎng)期；按1∶1000(V∶V)的比例接于50mL的LB培養(yǎng)液中，28℃，130 r/min氣浴搖培培養(yǎng)；培養(yǎng)8 h后開始取樣，測(cè)定其在600 nm處的吸光值(OD600)，每3 h取樣1次，重復(fù)3次。

1.2.5 AHLs信號(hào)檢測(cè)

AHL信號(hào)檢測(cè)平板的制備：將報(bào)告菌根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciensNTL4(pZLR4)接種于含有30μg/mL慶大霉素(Gm)的液體ABM培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)16–24 h后待用；100mL的ABM基本培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，加入5mLA.tumefaciensNTL4培養(yǎng)液、終濃度為30μg/mL的Gm 和40μg/mL的X-Gal，混勻后制備報(bào)告菌平板[18]。

AHL信號(hào)分子測(cè)定：取0.5mL軟腐果膠桿菌Z3-3及其衍生菌培養(yǎng)液，加入等體積的乙酸乙酯充分混勻萃取信號(hào)分子，12000 r/min離心15min，吸取上清液，萃取3次。循環(huán)水式真空泵真空抽干，加入100μL甲醇溶解；取2μL上述所得信號(hào)提取液，加入400μLA.tumefaciensNTL4(pZLR4)培養(yǎng)液(OD600=0.8)，28℃、130 r/min培養(yǎng)4 h；12000 r/min離心1min，棄上清，加100μL dd H2O懸浮細(xì)胞；檢測(cè)A.tumefaciensNTL4(pZLR4)中β-半乳糖苷酶活性[10]，以酶活強(qiáng)弱表示AHLs信號(hào)分子濃度高低。

1.2.6 致病性的檢測(cè)

將軟腐果膠桿菌Z3-3及其衍生菌接種于LB培養(yǎng)基，在28℃條件下130 r/min培養(yǎng)至OD600=1.0；蘿卜和馬鈴薯清水洗凈后晾干，用70%的酒精對(duì)表面進(jìn)行消毒處理后切成厚度一致的組織切塊。在培養(yǎng)皿中鋪一層滅菌吸水紙保濕，噴灑無(wú)菌水后將組織切塊置于中央，組織切塊中央針刺接種5μL細(xì)菌培養(yǎng)液，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；大白菜去掉外層葉片，將內(nèi)層大小一致的健康葉片置于塑料培養(yǎng)盒中(盒底部鋪兩層滅菌紗布)，表面消毒后針刺接種5μL細(xì)菌培養(yǎng)液于葉柄中央，盒子四角放置吸水棉球，28℃培養(yǎng)箱密封培養(yǎng)。方差分析應(yīng)用DPS分析軟件，95%置信區(qū)間。

1.2.7 AidE降解機(jī)制分析

通過(guò)Ni-NTA親和層析和AKTA-Purifier(GE Healthcare)層析系統(tǒng)得到精細(xì)純化的AidE蛋白。200μL精細(xì)純化的AidE蛋白溶液(0.3 mg/mL)與30μL(0.05 mol/L)信號(hào)分子C6-HSL在1mL反應(yīng)緩沖液(50mmol/L Tris-Cl，400mmol/L NaCl，pH7.0)中于37℃反應(yīng)2 h；200μL二甲基亞砜(DMSO)和200μL1 mol/L NaOH 混合，加入30μL(0.05 mol/L)信號(hào)分子C6-HSL，37℃反應(yīng)30min，利用NaOH溶液破壞AHLs信號(hào)分子的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)形成降解產(chǎn)物N-?；呓z氨酸，作為產(chǎn)物對(duì)照；設(shè)不加信號(hào)分子的蛋白溶液及未處理的C6-HSL信號(hào)純品作空白對(duì)照；上述反應(yīng)溶液分別用等體積的乙酸乙酯萃取3次，取上清，真空抽干后用100μL甲醇溶解；用高壓液相色譜(HPLC)分析反應(yīng)產(chǎn)物。HPLC 使用 C18反向色譜柱(4.6mm×150mm；Agilent TC-18)，掃描波長(zhǎng)210mm；進(jìn)樣體積5μL；流動(dòng)相為：甲醇∶水(V/V)=40∶60，0.1%磷酸；流量：0.25mL/min。

1.2.8 aidE基因序列在不動(dòng)桿菌中特異性分析

pQ30中aidE上下游基因位置關(guān)系與已知不動(dòng)桿菌中基因的排列均不相同。為檢測(cè)上述特異性基因排列關(guān)系是否是由于建庫(kù)過(guò)程中Sau3AⅠ酶切后的片段拼接錯(cuò)誤，設(shè)計(jì)引物pQ30-2335、pQ30-3556(表2)分別以 pQ30、菌株77基因組和單菌落為模板進(jìn)行 PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件為：94℃變性5min；94℃變性40 s，55℃復(fù)性40 s，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)為30；72℃充分延伸10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 aidE基因的克隆與序列分析

Acinetobactersp.77分離自新疆阿瓦提縣的植物根圍土壤，能夠降解AHLs信號(hào)分子。利用Agrobacterium tumefaciensNTL4(pZLR4)信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)Acinetobactersp.77基因組文庫(kù)的篩選，從2000個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選到1個(gè)具有AHL信號(hào)降解功能的粘?？寺?pF38。對(duì) pF38進(jìn)一步的EcoRⅠ亞克隆篩選得到具有AHLs信號(hào)降解功能的陽(yáng)性克隆 pQ30，該質(zhì)?？寺×思s8 kb的外源片段，該序列已提交至GenBank(登錄號(hào)為MF074213)。

測(cè)序分析表明8 kb片段(圖1)編碼6個(gè)開放閱讀框(ORF)。ORF1為編碼490個(gè)氨基酸的琥珀酸半醛脫氫酶(Succinate-semialdehyde dehydrogenase)；ORF2為編碼268個(gè)氨基酸的內(nèi)酰胺酶家族蛋白(Beta-lactamase)；ORF3編碼一個(gè)含有191個(gè)氨基酸的假定蛋白；ORF4、ORF5、ORF6編碼的分別為含有575個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Transcriptional regulator)、含有331個(gè)氨基酸的苯酚羥化酶(Phenol hydroxylase)P1蛋白和酚-2-單氧酶(Phenol-2-monooxygenase)的部分序列，三者同為酚合成基因簇的組成部分。

用Hind Ⅲ對(duì)pQ30進(jìn)一步亞克隆，得到包含約1.2 kb有信號(hào)降解功能片段的陽(yáng)性克隆pCH6，序列分析表明，pCH6中僅含有一個(gè)完整的開放閱讀框，即上述 ORF2。據(jù)此確定orf2即為編碼AHL信號(hào)降解酶的基因，命名為aidE(Autoinducers degrading)。

aidE基因共807 bp，編碼268個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為29.48 kDa。序列一致性比較發(fā)現(xiàn)，aidE的氨基酸序列與已知的AHLs降解酶的氨基酸序列一致性較低，最高為AttM/AiiB家族蛋白(Mycobacterium lentiflavum，CQD23908.1)，一致性僅為33%。然而該蛋白與β-內(nèi)酰胺酶類家族蛋白高度一致，與Acinetobacter gyllenbergiiCIP110306中的β-內(nèi)酰胺酶類家族蛋白(EPF70788.1)一致性高達(dá)95%，與惡臭假單胞菌Pseudomonas putida中的β-內(nèi)酰胺酶類家族蛋白(KEX94407.1)一致性為93%，與海單胞菌Marinomonassp.MWYL1中的β-內(nèi)酰胺酶類結(jié)構(gòu)域蛋白(ABR69113.1)一致性為90%。AidE中具有β-內(nèi)酰胺酶類蛋白的特征序列105-HLHFDHAG-112以及與金屬水解酶特征序列一致的177-HTPGHOSL-184。將AidE與已報(bào)道的AHL內(nèi)酯酶進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)(圖2)，AidE與β-內(nèi)酰胺酶蛋白家族類的AHL內(nèi)酯酶一致性較高。

圖2 aidE與已發(fā)表AHL內(nèi)酯酶氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of theaidEand other published AHL-lactonases.The dendrogram was constructed after ClustalW alignment using Neighbor-Joining and and Kimura two-parameter methods subjected to1000 bootstrap trials with MEGA5.05.[9-11,12,13,22-40].

為進(jìn)一步驗(yàn)證aidE基因是否為菌株77中唯一發(fā)揮信號(hào)降解功能的基因，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了aidE基因缺失471 bp片段的突變體(圖3A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，aidE基因缺失后，菌株77失去信號(hào)降解功能(圖3 B)。由此可見(jiàn)，aidE基因的正常表達(dá)是菌株77具有信號(hào)降解能力的決定性因素。

圖3 aidE基因缺失突變體的構(gòu)建及其功能驗(yàn)證Fig.3 In-frame deletion of theaidEgene(A)and determining the AHL-inactivating function(B)of wild-typeAcinetobactersp.77(1)and theaidEgene deletion mutantAcinetobactersp.77 ΔaidE(2).M:marker; dd H2O as negative control(CK).

2.2 aidE蛋白降解機(jī)制解析

利用表達(dá)載體 pETAidE 表達(dá)并精細(xì)純化得到融合的AidE-His6蛋白(圖4)，分子量與預(yù)測(cè)結(jié)果相同，約30 kDa。用精細(xì)純化的AidE蛋白處理信號(hào)分子C6-HSL，以NaOH處理C6-HSL作為對(duì)照[41]，通過(guò)高壓液相色譜(HPLC)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，信號(hào)分子 C6-HSL的保留時(shí)間(Retention time)為26.0min(圖5 A)，C6-HSL 經(jīng) NaOH 處理的降解產(chǎn)物N-己?；?高絲氨酸(C6-HS)保留時(shí)間為21.9min(圖5 C)。用純化的AidE蛋白與 C6-HSL信號(hào)分子反應(yīng)后，出現(xiàn)保留時(shí)間為22.0min和25.9min的兩種化合物(圖5 D)。比對(duì)分析可知二者分別為 AidE蛋白作用于C6-HSL的降解產(chǎn)物C6-HS(圖5 D)，與未反應(yīng)的C6-HSL信號(hào)分子(圖5 D)。通過(guò)降解產(chǎn)物分析可知，AidE為 AHL-內(nèi)酯酶。AidE蛋白作用于AHLs信號(hào)分子的內(nèi)酯鍵，形成降解產(chǎn)物C6-HS。

除C6-HSL信號(hào)外，AidE對(duì)C10-HSL、N-3-氧代己酰基高絲氨酸內(nèi)酯(3-oxo-C6-HSL)、3-oxo-C8-HSL和提取自熒光假單胞2-79的N-羥基高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子混合物具有降解活性，表明其AHL降解活性沒(méi)有明顯的底物特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖4 aidE蛋白的表達(dá)與純化Fig.4 Expression and purification ofaidE.1:E.coliBL21(pET-22b)(+);2:E.coliBL21(pETAidE)without induction;3:E.coliBL21(pETAidE)after induction by IPTG for4 h in37℃;4: purified AidE protein; M:marker.

2.3 aidE基因表達(dá)對(duì)軟腐果膠桿菌Z3-3生物學(xué)性狀及致病性影響

胡蘿卜軟腐歐文氏菌 Z3-3能夠引起胡蘿卜、白菜、馬鈴薯等多種作物的軟腐病。其毒力因子植物細(xì)胞壁降解酶等的合成受到QS系統(tǒng)嚴(yán)格調(diào)控[42]。將攜帶有aidE基因的載體pB77E導(dǎo)入菌株 Z3-3中，檢測(cè)其生長(zhǎng)趨勢(shì)、AHLs信號(hào)的產(chǎn)生以及對(duì)致病性的影響。

結(jié)果顯示，表達(dá)aidE基因的菌株 Z3-3(pB77E)的生長(zhǎng)趨勢(shì)與野生型菌株 Z3-3及空載體對(duì)照菌株 Z3-3(pBBR1MCS-2)在各個(gè)階段均無(wú)明顯差異(圖6 A)，說(shuō)明aidE基因的表達(dá)對(duì)菌株 Z3-3的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。菌株 Z3-3和 Z3-3(pBBR1MCS-2)在培養(yǎng)前期信號(hào)產(chǎn)量較大，培養(yǎng)18–21 h時(shí)信號(hào)產(chǎn)量達(dá)到最大值，而后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加信號(hào)產(chǎn)量逐步降低，而在菌株 Z3-3(pB77E)中始終未檢測(cè)到信號(hào)產(chǎn)生(圖6 B)。說(shuō)明aidE基因的表達(dá)能夠完全降解菌株Z3-3合成的信號(hào)分子。以上菌株針刺接種白蘿卜、馬鈴薯和大白菜，結(jié)果顯示接種菌株 Z3-3和 Z3-3(pBBR1MCS-2)后能夠在上述植物組織上形成明顯的軟腐癥狀，而aidE基因的表達(dá)能顯著降低病原菌Z3-3的致病能力(圖6 C，表3)。綜上，aidE基因能夠通過(guò)降解細(xì)菌產(chǎn)生的AHLs信號(hào)分子影響其群體感應(yīng)系統(tǒng)，從而抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的致病性。

圖5 HPLC分析AidE降解C6-HSL機(jī)制Fig.5 HPLC analysis of the AidE-degraded product ofN-hexanoyl-L-homoserine lactone(C6-HSL).(A)Reaction buffer containing C6-HSL.(B)Reaction buffer containing pure AidE protein.(C)C6-HSL degraded by NaOH.(D)C6-HSL degraded by AidE, the solid and dotted arrows represent for C6-HSL and its degraded productN-hexanoyl-L-homoserine(C6-HS), respectively.

圖6 aidE對(duì)軟腐果膠桿菌Z3-3生長(zhǎng)、AHL產(chǎn)量和致病性的影響Fig.6 Effect ofaidEon bacterial growth(A), extracellular AHLs accumulation(B)and pathogenicity(C)inP.carotovorumsubsp.carotovorumZ3-3.

表3 果膠桿菌對(duì)植物組織致病性分析Table3 Pathogenicity assay ofP.carotovorumsubsp.carotovorumstrains on plant tissues

2.4 aidE基因序列在不動(dòng)桿菌中特異性分析

通過(guò)對(duì)AidE氨基酸序列一致性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，aidE基因在不動(dòng)桿菌屬中并不保守。在已知不動(dòng)桿菌基因組中，僅在Acinetobacter gyllenbergii和鮑氏不動(dòng)桿菌A.baumannii144107中找到一致性較高的編碼基因。與其他屬細(xì)菌對(duì)比發(fā)現(xiàn)，P.putida與Marinomonassp.MWYL1中也含有一致性較高的aidE同源基因。

對(duì)pQ30中aidE上下游基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行一致性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，上游琥珀酸半醛脫氫酶(ORF1)基因在不動(dòng)桿菌屬中不保守，雖然在A.gyllenbergii中發(fā)現(xiàn)該基因的存在，但不動(dòng)桿菌其他種中并未發(fā)現(xiàn)該基因。下游假定蛋白(ORF3)基因在不動(dòng)桿菌屬中不保守，只在A.baumannii144107和A.gyllenbergii種的一些菌株中發(fā)現(xiàn)該基因。下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(ORF4)、苯酚羥化P1蛋白(ORF5)和酚-2-單氧酶(ORF6)組成的酚合成基因簇在不動(dòng)桿菌中卻是保守存在的。雖然在A.gyllenbergii和A.baumannii144107中未發(fā)現(xiàn)酚合成基因簇相關(guān)基因，但在不動(dòng)桿菌其他種中，酚合成基因簇下游基因高度保守，上游基因在種間存在差異，但均未發(fā)現(xiàn)AidE一致性高的蛋白及其他β-內(nèi)酰胺酶類蛋白。

pQ30中 AidE上下游基因位置關(guān)系與已知不動(dòng)桿菌中基因的排列均不相同。為了檢測(cè)上述特異性基因排列關(guān)系是否是由于文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中Sau3AⅠ酶切后拼接錯(cuò)誤，利用引物pQ30-2335和pQ30-3556分別以pQ30、菌株77基因組和單菌落為模板進(jìn)行 PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，pQ30、菌株77基因組和單菌落中均能擴(kuò)增出相同條帶(圖7B)，說(shuō)明aidE基因在菌株77基因組中的上下游的基因排列與pQ30中的亞克隆片段分析結(jié)果相同，菌株77基因組中存在一段與其他已知不動(dòng)桿菌不同的特異性序列。

圖7 aidE基因的特異性分析Fig.7 The specificity analysis of theaidEgene.A: Localization of theaidEand its neighboring genes in genomes of different bacterial species.B: The specificity detection of the fragment which has the function of AHL signal degradation in pQ30.C: Nucleotide consistency of the suspected IS sequence in pQ30 with its homologous inA.baumannii1461402, insertion sequence IS17 TnpA(tnpA)gene(EU850412.1)inA.baumanniiand insertion sequence IS17 putative transposase gene(U95013.1)inA.haemolyticus.

對(duì) pQ30中的亞克隆片段核苷酸序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在aidE基因(pQ30：1624-2431)下游919 bp(pQ30-3350)處存在一段107 bp的疑似IS插入序列(圖7C)，與A.baumannii中的IS插入序列基因ISAba9 TnpA(tnpA)、IS17 TnpA(tnpA)(EU850412.1)和溶血不動(dòng)桿菌(A.haemolyticus)中的IS插入序列 IS17假定轉(zhuǎn)座酶基因(U95013.1)一致性高達(dá)97%。在A.baumannii1461402中，在酚合成基因簇下游同樣發(fā)現(xiàn)了兩段與pQ30中疑似IS插入序列一致性高達(dá)97%的同向重復(fù)序列，二者間隔約20 kb，且一致性高的片段附近基因編碼轉(zhuǎn)座酶家族蛋白增變(Mutator)家族轉(zhuǎn)座酶蛋白(EXB34237.1)等。而P.putidaH8234中AidE一致性較高蛋白上下游存在多個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因，推測(cè)在P.putidaH8234基因組中此位置可能來(lái)源于基因的水平轉(zhuǎn)移。aidE基因在不動(dòng)桿菌屬中的不保守存在，可能是水平轉(zhuǎn)移或基因組重排的結(jié)果。

3 討論

病原細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控多種與致病性密切相關(guān)的生物學(xué)功能。應(yīng)用AHL信號(hào)降解酶防治植物細(xì)菌病害的策略主要包括兩個(gè)方面：1)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，降解病原菌的AHL，從而抑制病原菌侵染[43]；2)以AHL降解細(xì)菌為生防菌防治植物病害[8,44]。

序列相似性比較發(fā)現(xiàn)，aidE的氨基酸序列與已知AHLs降解酶的氨基酸序列相似性較低(小于33%)，但與金屬依賴性水解酶(β-內(nèi)酰胺類家族蛋白)相似度高達(dá)95%，并具有β-內(nèi)酰胺類蛋白的特征序列105-HLHFDHAG-112以及與金屬水解酶特征序列相似的177-HTPGHTPGH-185[45]。2004年Wang等研究表明，AiiA為典型的Zn2+依賴型降解酶，能夠降解10種不同側(cè)鏈長(zhǎng)度和C3取代基不同的信號(hào)分子[46]。AidH是本實(shí)驗(yàn)室前期研究得到的具有 AHLs降解活性的Mn2+依賴性內(nèi)酯酶，對(duì)多種類型的AHLs信號(hào)分子具有降解活性；與之相比，AidE對(duì)于金屬離子的依賴性較低，外源添加 Zn2+和 Mg2+，其降解活性增強(qiáng)幅度較小(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，表達(dá)aidE基因的胡蘿卜軟腐歐文氏菌株Z3-3的致病性明顯下降，表明利用AidE降解信號(hào)分子進(jìn)而降低病原菌致病性具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

aidE基因不是不動(dòng)桿菌屬中的保守基因，aidE基因的上下游的基因排列與已測(cè)序不動(dòng)桿菌均不相同。aidE基因下游保守的酚合成基因簇序列比對(duì)表明，在波西米亞不動(dòng)桿菌Acinetobacter bohemicus、抗輻射不動(dòng)桿菌A.radioresistens和A.baumannii中該基因簇上游基因在不動(dòng)桿菌中保守性較低，可能在進(jìn)化過(guò)程中較為活躍，在不同屬細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移概率較大。此外在P.putidaH8234中與aidE一致性高的蛋白編碼基因上下游存在多個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因，也說(shuō)明基因有可能是通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)入P.putidaH8234中的。與此同時(shí)，在aidE基因下游919 bp(pQ30-3350)處發(fā)現(xiàn)的一段107 bp的IS插入序列，雖然在其基因附近未發(fā)現(xiàn)明確的轉(zhuǎn)座酶基因，但不排除該區(qū)域基因發(fā)生過(guò)水平轉(zhuǎn)移的可能性。信號(hào)降解酶基因通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)入細(xì)菌基因組并非無(wú)跡可尋，在Acinetobactersp.Ooi2中發(fā)現(xiàn)的AHL酰基轉(zhuǎn)移酶AmiE上游存在轉(zhuǎn)座酶家族蛋白，表明該基因可能通過(guò)水平轉(zhuǎn)移而來(lái)[47]。綜上，aidE基因可能是通過(guò)水平轉(zhuǎn)移進(jìn)入菌株77基因組中，或是aidE基因在基因組中的位置發(fā)生過(guò)重排。菌株77自身并未檢測(cè)到AHL信號(hào)產(chǎn)生，外源獲得具有信號(hào)降解功能的基因可能有利于增強(qiáng)其在環(huán)境中的生存優(yōu)勢(shì)。

針對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)的植物細(xì)菌性病害防治是近些年的研究熱點(diǎn)。對(duì)群體感應(yīng)淬滅的研究近年來(lái)更傾向于小分子抑制物的篩選和利用，但AHLs信號(hào)降解酶仍具有開發(fā)和應(yīng)用潛力。AidE的發(fā)現(xiàn)豐富了信號(hào)降解酶的來(lái)源和種類，為生物防治提供了新資源。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

AidEencodes anN-acyl homoserine lactonase inAcinetobacter

Chunyan Liu*, Song Guo*, Ali Turak, Junwei Zhang, and Liqun Zhang
Department of Plant Pathology,China Agricultural University,Beijing100193,China

Quorum sensing(QS)is a cell-cell communication mechanism that allows bacterial populations to coordinategene expression in response to cell density.N-acylhomoserine lactones(AHL)are used as quorum-sensing signal molecules by many Gram negative bacteria.Acinetobactersp.77, an AHL-degrading bacterium, was isolated in our previous work.The geneaidEfor AHL inactivation was cloned in this study by screening a genomic DNA library.The deduced protein AidE is268 amino acids in length and shares a high identity(95%)with the beta-lactamase family protein inAcinetobacter gyllenbergiiCIP110306, but low identities with known AHL-degrading enzymes.HPLC analysis of the AidE-degraded C6-HSL products revealed that AidE functioned as an AHL lactonase.Sequences alignment suggested that theaidEgene is not conserved inAcinetobacterspecies, flanking sequences ofaidEand their arrangement are specific inAcinetobactersp.77 genome, and some IS insertion sequences were found downstream of theaidEgene.These evidences indicated that theaidEgene might be foreign DNA taken up via horizontal gene transferring or had changed its relative location due to the genome rear-arrangement.Expression of theaidEgene inPectobacterium carotovorumsubsp.carotovorumZ3-3 significantly reduced its AHL production as well as the pathogenicity on host plants, indicating that AidE was able to effectively quench quorum sensing-dependent functions in bacteria.In conclusion,aidEis a newfound AHL-lactonase with a potential for suppression of bacterial infections.

quorum sensing(QS),N-acylhomoserine lactones(AHL),Acinetobactersp.,aidE

April12,2017;Accepted:July14,2017

Liqun Zhang.Tel: +86-10-62731464; E-mail: zhanglq@cau.edu.cn

劉春妍, 郭松, 艾力·吐熱克, 等.不動(dòng)桿菌屬中aidE基因編碼高絲氨酸內(nèi)酯酶.生物工程學(xué)報(bào),2017,33(9):1625–1639.

Liu CY, Guo S, Turak A, et al.AidEencodes anN-acyl homoserine lactonase inAcinetobacter. Chin J Biotech,2017,33(9):1625–1639.

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.31272082,31572045), National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2015CB150605), National Key Research and Development Program(No.2017YFD0201108).

*These authors contribute equally to this study.

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.31272082,31572045)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2015CB150605)，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)(No.2017YFD0201108)資助。

張力群 2001年畢業(yè)于日本神戶大學(xué)，獲得博士學(xué)位?，F(xiàn)任中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理系教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)橹参锊『ι锓乐魏椭参锵嚓P(guān)細(xì)菌分子遺傳，主要研究領(lǐng)域包括假單胞菌Pseudomonas抗生素的合成與調(diào)控、抗逆信號(hào)傳導(dǎo)和病害生物防治機(jī)制；植物病原細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)和群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制劑的篩選和抑制機(jī)制。主持國(guó)家自然科學(xué)基金課題7項(xiàng)，發(fā)表 SCI論文20余篇。