丁浩，何光軍，王琳淇

1 中國科學(xué)院微生物研究所 真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

人類環(huán)境病原真菌
——新生隱球菌的社會(huì)行為

丁浩1,2，何光軍1，王琳淇1

1 中國科學(xué)院微生物研究所 真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

人類病原真菌代表了病原微生物一個(gè)重要類群，主要感染免疫缺陷、受損和受抑制的患者，導(dǎo)致很高的死亡率。絕大多數(shù)的人類病原真菌屬于環(huán)境病原微生物，它們與人類宿主并無長期共同進(jìn)化史以及緊密的共生關(guān)系，這類真菌被稱為環(huán)境病原真菌。新生隱球菌作為環(huán)境病原真菌的模式種，每年導(dǎo)致約60萬人死亡。與其他環(huán)境病原真菌相似，該菌的致病能力并不由宿主因素驅(qū)動(dòng)，而是衍生于其對(duì)于生境壓力出色的適應(yīng)性策略。近幾年來的研究表明，群體或社會(huì)行為可能作為一個(gè)關(guān)鍵環(huán)境適應(yīng)策略，廣泛參與新生隱球菌的感染、耐藥以及有性生殖過程。本文以新生隱球菌為例，針對(duì)生物被膜以及生物被膜樣群落，總結(jié)其中的群體或社會(huì)調(diào)控方式，并對(duì)其研究前景和臨床應(yīng)用提出了一些思考。

人類病原真菌，新生隱球菌，細(xì)胞交流，有性生殖，生物被膜

圖1 環(huán)境適應(yīng)策略參與維系了環(huán)境病原真菌對(duì)生境和宿主壓力的適應(yīng)Fig.1 Fungal adaptation strategies coordinate their survival both inside and outside of hosts.

人類病原真菌代表了病原微生物一個(gè)重要類群。由于其致死、致殘率高(感染致死率往往在20%以上，每年造成超過200萬人死亡)，嚴(yán)重威脅了人類公共健康安全。近年來，由于艾滋病、器官移植、癌癥患者增多以及老齡化等因素，由人類病原真菌感染所導(dǎo)致的死亡病例大幅度激增，這為該類病原微生物的防控構(gòu)成了極大挑戰(zhàn)。絕大多數(shù)人類病原真菌屬于環(huán)境來源的病原微生物(每年導(dǎo)致約150萬人死亡)，它們與人類宿主并無長期共進(jìn)化史也不存在緊密的共生關(guān)系，主要棲居于自然生境，進(jìn)化出了豐富的適應(yīng)行為或策略(Adaptation behavior)以應(yīng)對(duì)生境環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化[1-3]。該類病原真菌被稱為環(huán)境病原真菌(Environmental fungal pathogen)。越來越多的證據(jù)表明，該類致病菌的宿主侵染和高效的毒力進(jìn)化能力，可能就是衍生于其對(duì)于生境環(huán)境出色的適應(yīng)策略(圖1)。這些環(huán)境病原真菌如何將出色的環(huán)境適應(yīng)能力應(yīng)用于致命感染被認(rèn)為是環(huán)境真菌病原學(xué)的核心問題。

如同大多數(shù)環(huán)境微生物一樣，環(huán)境病原真菌在自然界中經(jīng)常以群落(Community)的方式存在。而生物被膜(Biofilm)是其中研究最為透徹的一種具有分化特征的群落生存方式[4]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜的形成與人類病原真菌的感染、耐藥甚至毒力進(jìn)化皆高度相關(guān)[5-7]。基于此，生物被膜的形成、維持、解聚以及相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制成為人類病原真菌的研究熱點(diǎn)之一。最近的一系列研究表明，在一些人類病原真菌生物被膜群落中，細(xì)胞呈現(xiàn)了高度的社會(huì)性(Sociality)[3,8]：群落中的個(gè)體細(xì)胞即使遺傳物質(zhì)完全相同，卻由于代謝和生理調(diào)控水平(基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控)的不同，導(dǎo)致它們?cè)谛螒B(tài)與功能上存在顯著差異。根據(jù)形態(tài)或功能的不同，這些群落內(nèi)細(xì)胞可被分成不同的形態(tài)或功能細(xì)胞亞群。不同細(xì)胞亞群利用細(xì)胞通訊策略進(jìn)行交流、協(xié)作，并可相互轉(zhuǎn)換。這些細(xì)胞分工和協(xié)作的手段代表了真菌主要社會(huì)性或群體策略。環(huán)境病原真菌正是借助這些策略，實(shí)現(xiàn)對(duì)高變的生境壓力的快速適應(yīng)以及對(duì)種群優(yōu)勢(Population fitness)的最大化維系，對(duì)其生境壓力適應(yīng)和宿主侵染方面進(jìn)行平衡[3]。本文以人類環(huán)境病原真菌模式菌新生隱球菌為范例，針對(duì)生物被膜以及生物被膜樣群落(Biofilm-like community)的形成和分化，重點(diǎn)討論其中社會(huì)行為的研究進(jìn)展。

1 新生隱球菌——人類環(huán)境病原真菌模式菌

新生隱球菌Cryptococcus neoformans是人類環(huán)境病原真菌的模式菌，每年因其感染而死亡的人數(shù)在該類病原真菌中位列首位[1,9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，該菌每年導(dǎo)致的新發(fā)感染病例數(shù)超過了100萬例，其中約60萬人死亡[10]。此外，在絕大多數(shù)的國家和地區(qū)，新生隱球菌偏好感染免疫缺陷的患者，然而在我國以及一些東南亞國家，該菌傾向于感染免疫健全人群[11-13]。并且在我國的一些省市地區(qū)，該菌已成為感染性腦膜炎的主要感染病原體[14]，這為我國隱球菌的防控帶來了特殊而嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。作為環(huán)境來源的病原真菌，新生隱球菌主要以孢子和干酵母的形式，通過人類宿主的呼吸道進(jìn)入肺部，進(jìn)而可通過血液擴(kuò)散入侵患者所有臟器，最終通過血腦屏障進(jìn)入腦部引發(fā)致命的隱球菌腦膜炎。相對(duì)于其進(jìn)化地位臨近的非致病種而言，新生隱球菌能夠產(chǎn)生包裹細(xì)胞的多糖莢膜以及抵抗宿主氧自由基壓力的黑色素，且可在接近或高于宿主體溫(37℃)的溫度下快速生長[1]，這些被認(rèn)為是新生隱球菌的核心毒力因子。當(dāng)前針對(duì)新生隱球菌的藥物極為有限，近30年內(nèi)并無任何新藥面市。不僅如此，作為真核微生物，新生隱球菌具有完整的有性生殖周期[15]。最近的研究表明，隱球菌有性生殖參與了其多種病原表征[16-18]，并可作為重要的環(huán)境適應(yīng)手段加速毒力進(jìn)化過程，導(dǎo)致高毒和藥物抗性菌株不斷涌現(xiàn)。基于此，全面理解新生隱球菌的致病機(jī)制對(duì)于人類公共健康安全十分重要。

2 新生隱球菌生物被膜與臨床感染

新生隱球菌在自然界中分布極廣，包括植被表面、腐樹樹洞、動(dòng)物皮毛、鴿子糞便和大氣微塵等。這種“泛生態(tài)分布”的特點(diǎn)可能是造就其成為全球致病菌(Global pathogen)重要原因。作為“成功”的環(huán)境病原菌，新生隱球菌發(fā)展出了多樣的生存策略以應(yīng)對(duì)其寬泛的生境壓力。依靠多細(xì)胞分工、協(xié)作的群體或社會(huì)行為被認(rèn)為作為重要生物學(xué)策略以應(yīng)對(duì)多變的生境或宿主壓力[3]。其中，生物被膜以及生物被膜樣群落相關(guān)的細(xì)胞群體行為在新生隱球菌的感染和有性生殖進(jìn)程中皆扮演了關(guān)鍵的角色[3,7,19]。針對(duì)新生隱球菌生物被膜的首次臨床報(bào)道發(fā)生在20世紀(jì)80年代中期[20]。在一個(gè)28歲成年男子的腦室-心房分流管檢測到新生隱球菌生物被膜樣結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致該男子感染了嚴(yán)重的新生隱球菌腦膜炎[20]。隨后，生物被膜參與粘附多種不同植入醫(yī)療器械(包括腹膜透析瘺管、人工心臟瓣膜等)的事件相繼被報(bào)道[21-22]。不僅是參與粘附植入醫(yī)療器械，新生隱球菌也被報(bào)道以生物被膜的方式參與從巨噬細(xì)胞內(nèi)的逃逸[23-24]。

在發(fā)育分化上，新生隱球菌的生物被膜形成和成熟與細(xì)菌相似，涉及了連續(xù)多個(gè)不同的生物學(xué)過程。首先，隱球菌細(xì)胞可附著在固體界面表面。隨后，細(xì)胞開始大量繁殖并產(chǎn)生豐富的胞外多糖，這些多糖一部分結(jié)合在細(xì)胞壁組分(幾丁質(zhì)和 α葡聚糖)上形成耐受宿主免疫攻擊的莢膜，另一部分可脫離于胞外構(gòu)成胞外基質(zhì)層(Extracellular matrix layer)參與生物被膜的構(gòu)成[25]。早期研究顯示，生物被膜能夠幫助新生隱球菌拮抗來自自然生境的多種生物和非生物來源的壓力。例如，生物被膜能夠幫助新生隱球菌抵御其天然捕食者(如變形蟲(Amoeba)的吞食)[26]。除此之外，生物被膜中的新生隱球菌細(xì)胞比游離細(xì)胞更具有藥物耐受性[27]。Casadevall研究組的研究表明，相對(duì)于游離細(xì)胞，生物被膜細(xì)胞對(duì)兩性霉素和卡泊芬凈更加耐受[27-28]。在自然界中，大量微生物能夠產(chǎn)生拮抗真菌生長的化合物，包括兩性霉素。生物被膜可能為新生隱球菌針對(duì)該類微生物“競爭者”提供生存優(yōu)勢。生物被膜不僅幫助新生隱球菌適應(yīng)生境壓力，在宿主微環(huán)境的適應(yīng)過程中同樣也扮演著重要的角色。前期研究顯示，生物被膜細(xì)胞相對(duì)于游離細(xì)胞展現(xiàn)了對(duì)宿主微環(huán)境中的氧自由基更好的抗性。這些結(jié)果說明，生物被膜是新生隱球菌的重要環(huán)境適應(yīng)策略(Adaptation strategy)，在抵御生境壓力以及適應(yīng)宿主微環(huán)境中扮演了至關(guān)重要的角色。

3 新生隱球菌生物被膜和有性生殖

有性生殖是真核生物特有的基礎(chǔ)生命繁殖方式[29]。該生命繁殖方式在不同進(jìn)化地位的真核生命中廣泛存在[30]。在人類環(huán)境病原真菌中，有性生殖被認(rèn)為是關(guān)鍵生物學(xué)策略導(dǎo)致高毒和藥物抗性表征的產(chǎn)生，從而快速推動(dòng)毒力進(jìn)化進(jìn)程[1,15]。其中，理解最為透徹的致病菌之一就是新生隱球菌。有性生殖與其多個(gè)病原表征高度相關(guān)。首先，有性生殖的產(chǎn)物性孢子(Sexual spore)可作為重要的感染繁殖體(Infectious propagule)參與早期宿主肺臟定植[17]；其次，通過群體遺傳策略，Joseph Heitman實(shí)驗(yàn)室證實(shí)有性生殖可作為關(guān)鍵的進(jìn)化動(dòng)力通過創(chuàng)建遺傳內(nèi)容和核型(Karyotype)多樣化，推動(dòng)了毒力進(jìn)化，并造成了北美嚴(yán)重的隱球菌爆發(fā)性感染[16,18,31]；再次，有性生殖能夠加速非整倍體子裔(Aneuploidy progeny)的產(chǎn)生，后者展現(xiàn)了顯著的臨床一線治療藥物(氟康唑)抗性，因而有性生殖被認(rèn)為是隱球菌抗藥菌株產(chǎn)生的關(guān)鍵因素之一[18]。新生隱球菌具有兩種交配型(α 和a)，可通過α-a異性生殖(α-a bisexual reproduction)和α同性生殖(α unisexual reproduction)兩種模式進(jìn)行有性生殖[32]。由于自然界中99%的菌株是α交配型，故 α同性生殖被認(rèn)為是新生隱球菌主要的有性生殖方式。然而相對(duì)于α同性生殖，α-a異性生殖發(fā)現(xiàn)更早，研究得也更為清楚[33]。早期研究表明，將 α和 a兩種細(xì)胞混合以后，細(xì)胞分泌大量性信息素(Pheromone)，該分子與異性細(xì)胞表面的性信息素受體(Ste3α或Ste3a)特異性結(jié)合，有效地誘導(dǎo)異性(α，a)細(xì)胞之間的融合，進(jìn)而促進(jìn)有性菌絲、減數(shù)分裂、有性孢子產(chǎn)生等一系列有性生殖相關(guān)的生物學(xué)過程的發(fā)生[34-35]。α同性生殖方式在發(fā)育上與異性生殖十分相似[18,36]，然而在染色體倍化(Diploidization)方式上有明顯差異，α同性生殖被認(rèn)為可通過細(xì)胞周期調(diào)控(例如核內(nèi)復(fù)制，Endoreplication)的方式完成染色體倍化[37-39]。除此之外，性菌絲在形態(tài)學(xué)上也有顯著差別：異性菌絲細(xì)胞之間具有鎖狀聯(lián)合(Clamp connection)，該結(jié)構(gòu)反映了擔(dān)子菌雙核菌絲的典型特征；然而，同性菌絲由于其單核的性質(zhì)，并無鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。在新生隱球菌有性生殖過程中，性群落(Mating community)中的底層細(xì)胞侵入培養(yǎng)基中，上層細(xì)胞構(gòu)成的菌落可進(jìn)行有序的發(fā)育分化，一部分酵母細(xì)胞分化成菌絲，一旦菌絲形成，菌絲細(xì)胞開始大量產(chǎn)生黏附蛋白 Cfl1，該蛋白促進(jìn)了菌絲細(xì)胞之間的黏連[40]。Xiaorong Lin研究組的研究表明，Cfl1蛋白能夠進(jìn)一步受到剪切，游離的Cfl1構(gòu)成胞外基質(zhì)層包裹了部分菌絲以及酵母細(xì)胞?；诖耍匀郝湔宫F(xiàn)出高度類似生物被膜的相關(guān)特征[19]，在該文中我們將其表述為生物被膜樣菌落(Biofilm-like community)。近期研究表明，性群落的生物被膜樣特征能夠幫助新生隱球菌抵御變形蟲的吞食[26]，說明性群落的形成可能是新生隱球菌適應(yīng)環(huán)境壓力的重要生存策略。

4 新生隱球菌生物被膜和性群落社會(huì)調(diào)控：細(xì)胞功能分工

在一個(gè)分化的隱球菌性群落當(dāng)中(圖2A)，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性(Heterogeneity)，多樣的細(xì)胞形態(tài)共存其中(圖2A)[3]。近期研究表明，隱球菌性群落中不同形態(tài)的細(xì)胞能夠承載截然不同的生物學(xué)功能，具體如圖2B所示。

4.1 Shmoo細(xì)胞形態(tài)

當(dāng)有性生殖開始發(fā)生時(shí)，性群落中的一部分酵母細(xì)胞分化成一種梨狀細(xì)胞，該細(xì)胞形態(tài)被稱為shmoo形態(tài)(圖2B)[41]。在釀酒酵母中，該類細(xì)胞主要參與感應(yīng)來自異性細(xì)胞的性信息素以及與異性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合[42]。盡管現(xiàn)在沒有證據(jù)支持該細(xì)胞形態(tài)在新生隱球菌中參與了相同的生物學(xué)過程，但是前期的研究表明，該類細(xì)胞受控于性信息素 MAPK信號(hào)通路的核心調(diào)控蛋白Mat2和Mat2的過表達(dá)可導(dǎo)致該細(xì)胞形態(tài)組成型形成[41]。鑒于Mat2在性信息素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵角色[43]，其調(diào)控的shmoo細(xì)胞形態(tài)很可能直接參與了有性生殖過程。

圖2 分化的新生隱球菌同性生殖群落中多種細(xì)胞形態(tài)共存(圖2B源自文獻(xiàn)[3]).(A)新生隱球菌的同性生殖群落呈現(xiàn)高度分化特征.(B)不同細(xì)胞形態(tài)承載不同的生物學(xué)功能Fig.2 During the differentiation of unisexual community, cells exhibit remarkable heterogeneity in cellular morphotype.(A)Cryptococcal unisexual community can undergo remarkable differentiation.(B)The different morphologies ofC.neoformansare tightly linked with different biological functions[3].

4.2 假菌絲和菌絲形態(tài)

除了shmoo細(xì)胞形態(tài)以外，一部分新生隱球菌細(xì)胞可分化成假菌絲和菌絲形態(tài)(圖2B)。早期的研究認(rèn)為假菌絲和菌絲形態(tài)的生物學(xué)功能相似，皆參與生態(tài)位的擴(kuò)展以及抵御掠食者吞食。由于新生隱球菌和絕大多數(shù)真菌相同，并不具備鞭毛和纖毛等用于游動(dòng)的分子馬達(dá)。菌絲和假菌絲形成被認(rèn)為是生態(tài)位擴(kuò)展的重要手段。我們近期的研究表明，與假菌絲不同，菌絲發(fā)育與有性生殖的減數(shù)分裂過程在遺傳和發(fā)育上高度相關(guān)[31]。一個(gè)RNA結(jié)合蛋白Pum1可作為一個(gè)核心因子鏈接了菌絲發(fā)育和有性生殖過程。此外，借助單克隆掃描成像技術(shù)，我們直接觀測到菌絲發(fā)育與減數(shù)分裂過程偶聯(lián)。因此，菌絲形態(tài)可作為一個(gè)重要的發(fā)育階段參與了新生隱球菌的有性生殖過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)，菌絲形態(tài)能夠刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，經(jīng)過菌絲處理的小鼠展現(xiàn)出對(duì)高毒酵母細(xì)胞完全的免疫保護(hù)[44]。這說明對(duì)于菌絲細(xì)胞形態(tài)的研究有助于為新生隱球菌免疫療法的研發(fā)提供線索。

4.3 Titan細(xì)胞形態(tài)

Titan形態(tài)細(xì)胞最初在感染患者的肺部病理切片中被發(fā)現(xiàn)。隨后，Kirsten Nielsen實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)氮饑餓也能驅(qū)動(dòng)該形態(tài)的產(chǎn)生[45-46]。典型酵母細(xì)胞是單倍體，直徑大概在5–7μm。而該形態(tài)細(xì)胞直徑往往超過15μm(圖2B)，甚至能夠達(dá)到100μm左右，一些Titan細(xì)胞的染色體倍數(shù)可達(dá)到64倍以上。Kirsten Nielsen的研究組利用小鼠模型發(fā)現(xiàn)該形態(tài)的形成主要發(fā)生在肺部，在腦部感染中較為罕見[47]。Titan形態(tài)細(xì)胞通過其巨大細(xì)胞體積能夠有效規(guī)避宿主巨噬細(xì)胞的吞噬[48]。除此之外，該形態(tài)細(xì)胞也展現(xiàn)了對(duì)宿主氧壓力的顯著抗性。我們前期觀察顯示，該形態(tài)在性群落中同樣存在，但其在性群落中扮演何種角色尚不清楚。但鑒于其巨大體積，推測其可能參與幫助新生隱球菌抵御天然捕食者的捕食。

相對(duì)于性群落，新生隱球菌生物被膜中細(xì)胞形態(tài)的異質(zhì)性并不顯著，主要由酵母形態(tài)細(xì)胞構(gòu)成。盡管在形態(tài)上相似，生物被膜中一些代謝和生理狀態(tài)不同的細(xì)胞可能參與執(zhí)行不同功能。Zdena Palková研究組對(duì)于真核微生物模式生物——釀酒酵母的研究支持了這個(gè)假說[49]。她們發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)成熟的菌落中(培養(yǎng)20 d以上)，細(xì)胞在垂直空間上能夠分化成兩個(gè)功能細(xì)胞亞群：上層細(xì)胞亞群(Upper subpopulation)和下層細(xì)胞亞群(Lower subpopulation)。下層細(xì)胞亞群一些降解代謝途徑的基因表達(dá)十分活躍，這個(gè)特征保障下層細(xì)胞群能夠?yàn)樯蠈蛹?xì)胞群提供易于利用的營養(yǎng)。這些結(jié)果說明，細(xì)胞功能的異質(zhì)性可能作為一個(gè)保守的環(huán)境適應(yīng)策略幫助微生物在不同生境壓力下維系群體生存優(yōu)勢。

5 新生隱球菌生物被膜和性群落社會(huì)調(diào)控：細(xì)胞-細(xì)胞協(xié)作

多細(xì)胞生物建立起了復(fù)雜的細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)在時(shí)空層面上參與細(xì)胞識(shí)別以及信息傳遞，保障有序生命活動(dòng)的進(jìn)行。與多細(xì)胞生物相同，白色念珠菌、新生隱球菌等單細(xì)胞致病真菌同樣存在多個(gè)細(xì)胞通訊系統(tǒng)。這些細(xì)胞通訊系統(tǒng)參與了病原菌生境壓力應(yīng)答、宿主微環(huán)境適應(yīng)、發(fā)育分化以及基礎(chǔ)生命繁殖過程。這些細(xì)胞通訊系統(tǒng)的核心部分由不同胞外信號(hào)分子構(gòu)成，如群感信號(hào)分子、性信息素以及胞外基質(zhì)信號(hào)分子。

5.1 群感信號(hào)分子

在單細(xì)胞微生物中，群體感應(yīng)(Quorumsensing)是研究得最為透徹的細(xì)胞通訊行為[50]。進(jìn)化地位迥異的微生物均能持續(xù)向胞外分泌特定的信號(hào)分子(群體感應(yīng)分子)，在細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)其分泌的群體感應(yīng)分子濃度能夠達(dá)到閾值，隨后改變相關(guān)基因的表達(dá)強(qiáng)度，從而啟動(dòng)或關(guān)閉特定的群體生物學(xué)行為，這一過程被稱為群體感應(yīng)(Quorum sensing)。與細(xì)菌相比，群體感應(yīng)現(xiàn)象在真核微生物中發(fā)現(xiàn)較晚，最早鑒定的群感分子來自于白色念珠菌的法尼醇(Farnesol)[51]。該群體感應(yīng)因子控制著菌絲到酵母形態(tài)之間的轉(zhuǎn)變，并影響其致病性以及生物被膜的形成。隨后，F(xiàn)ink實(shí)驗(yàn)室在白色念珠菌中鑒定了另一種群體感應(yīng)分子——酪醇(tyrosol)[52]。該信號(hào)分子的作用方式與法尼醇截然相反，其促進(jìn)白色念珠菌從酵母到菌絲形態(tài)的轉(zhuǎn)換。與白色念珠菌相似，新生隱球菌具有至少兩套群感效應(yīng)系統(tǒng)：多肽信號(hào)Qsp1群感系統(tǒng)[53]以及泛酸(Pantothenic acid)群感系統(tǒng)[54]。Albuquerque等在研究調(diào)控因子TUP1基因缺失對(duì)隱球菌影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，該突變體當(dāng)接種量小于103時(shí)，細(xì)胞生長相對(duì)于野生型菌株明顯滯后，高接種量則無此現(xiàn)象發(fā)生[54]。加入高接種量細(xì)胞的上清液同樣能夠使低密度tup1Δ突變體細(xì)胞正常生長，說明一個(gè)未知信號(hào)分子參與了該過程。通過對(duì)高細(xì)胞密度突變體上清液進(jìn)行分離得到了一種由11個(gè)氨基酸組成的小肽 Qsp1，該小肽的加入能夠彌補(bǔ)低接種量tup1Δ突變體的生長缺陷[54]。該小肽代表了新生隱球菌中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的群感信號(hào)分子。最近，Hiten Madhani實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，Qsp1能夠參與調(diào)控新生隱球菌的毒力過程，并鑒定了一個(gè)多肽運(yùn)輸?shù)鞍譕pt1參與Qsp1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，指出了群感系統(tǒng)在隱球菌感染中的關(guān)鍵角色[55]。2013年，Albuquerque等發(fā)現(xiàn)了隱球菌另一種群體感應(yīng)分子——泛酸[54]。他們收集穩(wěn)定生長隱球菌的培養(yǎng)上清(CM)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CM可誘導(dǎo)新生隱球菌生物被膜中的細(xì)胞生長，并參與激發(fā)細(xì)胞合成毒力因子黑色素(Melanin)以及大量分泌莢膜和生物被膜胞外基質(zhì)層的組分——葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)。我們未發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大接種量的酵母細(xì)胞能夠分泌一種未知因子，該因子能夠拮抗新生隱球菌從酵母到菌絲的轉(zhuǎn)換。有趣的是，泛酸和Qsp1并無該功能，暗示該因子可能代表了一個(gè)未被鑒定的群感或群感樣信號(hào)分子(Quorum sensing-like signal)。

5.2 性信息素

1956年，Homer等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將不同交配型的釀酒酵母混合后，釀酒酵母能發(fā)生形態(tài)變化，啟動(dòng)交配反應(yīng)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在酵母交配過程中，細(xì)胞能夠分泌一種多肽，該多肽能夠有效誘導(dǎo)交配(有性生殖)過程。該多肽被命名為性信息素(Pheromone)[55]。經(jīng)過50多年的研究，釀酒酵母中性信息素信號(hào)通路以及相關(guān)分子機(jī)制已經(jīng)十分清楚。性信息素通過結(jié)合在細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體，激活了下游的MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑，從而激發(fā)了交配應(yīng)答。因此，性信息素途徑又稱為性信息素 MAPK途徑[56]。該途徑在子囊菌門和擔(dān)子菌門的真菌中高度保守。前期研究表明，性信息素 MAPK途徑對(duì)于新生隱球菌性群落的形成至關(guān)重要。該途徑關(guān)鍵基因的缺失能夠完全阻斷異性生殖的發(fā)生，細(xì)胞也喪失了侵入培養(yǎng)基以及產(chǎn)生胞外基質(zhì)的能力[39]。有趣的是，該途徑的上游基因盡管對(duì)異性生殖十分關(guān)鍵，但對(duì)新生隱球菌的同性生殖過程并不必需。早期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除性信息素受體基因STE3α以及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因STE6對(duì)同性菌絲(同性生殖一個(gè)重要發(fā)育階段)的分化并無影響[57]。性信息素 MAPK途徑下游組分不論對(duì)同性生殖還是異性生殖均十分重要。這個(gè)現(xiàn)象似乎暗示可能存在一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞通訊系統(tǒng)能夠替代性信息素，通過整合性信息素 MAPK途徑的下游組分特異性地參與同性生殖性群落的分化。

5.3 胞外基質(zhì)蛋白信號(hào)

胞外基質(zhì)分子在高等真核生物中往往作為信號(hào)分子調(diào)控基因表達(dá)，借此指導(dǎo)多樣的生物學(xué)行為。在微生物中，胞外基質(zhì)分子往往作為重要的結(jié)構(gòu)組分參與生物被膜的形成。例如，在釀酒酵母中，粘附因子Flo11可通過剪切游離于胞外，參與胞外基質(zhì)層形成以及生物被膜的分化和擴(kuò)展[58-59]。然而，一些基于分子遺傳學(xué)的研究暗示，在一些微生物中，胞外基質(zhì)分子可能直接作為信號(hào)分子參與微生物發(fā)育分化過程。例如，Roberto Kolter實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，胞外基質(zhì)蛋白編碼基因tasA的缺失導(dǎo)致了枯草芽胞桿菌產(chǎn)孢缺陷，暗示胞外基質(zhì)分子可能具有調(diào)控活性[60]。最近，Matthew R.Parsek研究組的研究為上述假說提供了更為直接的證據(jù)[61]。他們發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌能夠直接利用胞外基質(zhì)多糖 Psl作為信號(hào)分子激活產(chǎn)生二級(jí)信使c-di-GMP的相關(guān)基因，導(dǎo)致細(xì)胞大量合成c-di-GMP進(jìn)而誘導(dǎo)生物被膜形成[61]。不僅是胞外基質(zhì)多糖，我們近期的研究發(fā)現(xiàn)胞外基質(zhì)蛋白也可激活新生隱球菌性群落分化。當(dāng)新生隱球菌性群落開始分化時(shí)，胞外基質(zhì)蛋白Cfl1編碼基因被極大誘導(dǎo)，導(dǎo)致大量Cfl1蛋白形成[19]。Cfl1蛋白具有雙功能：一方面可錨定在細(xì)胞壁上作為細(xì)胞粘附蛋白指導(dǎo)細(xì)胞粘附；另一方面，其可通過剪切形成胞外游離蛋白，參與胞外基質(zhì)層形成。重要的是，胞外基質(zhì)層中Cfl1蛋白可作為信號(hào)分子通過Znf2菌絲形成途徑直接參與性群落的分化。然而，Cfl1信號(hào)分子的受體以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍尚待揭示。Cfl1信號(hào)分子量超過20 kDa，代表了一個(gè)新穎的蛋白信號(hào)分子[19]。單克隆掃描成像結(jié)果顯示，Cfl1特異性地激活了性群落外層細(xì)胞的基因表達(dá)，內(nèi)層細(xì)胞并不能應(yīng)答Cfl1產(chǎn)生菌絲。這說明Cfl1屬于空間信號(hào)分子。最近，Xiaorong Lin實(shí)驗(yàn)室鑒定了另一個(gè)蛋白類信號(hào)分子——分泌乙酰輔酶A結(jié)合蛋白Acb1[62]。Acb1并不包含信號(hào)肽序列，因此并不能通過經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑進(jìn)行外排，而是依賴Golgi reassembly stacking蛋白依賴的途徑進(jìn)行分泌。與Cfl1相似，外泌Acb1同樣對(duì)性群落的正常分化非常重要。

6 結(jié)語與展望

絕大多數(shù)人類病原真菌并不是專性病原菌，而是腐生微生物。這些“環(huán)境微生物”的毒力進(jìn)化并不由宿主因素驅(qū)動(dòng)，其“致命感染”被認(rèn)為就是簡單衍生于其對(duì)生境環(huán)境出色的適應(yīng)性策略或行為。絕大多數(shù)人類病原真菌進(jìn)化出多樣的群體或社會(huì)調(diào)控策略，包括細(xì)胞功能異質(zhì)性(Functional heterogeneity)、功能(形態(tài))轉(zhuǎn)換以及細(xì)胞-細(xì)胞交流。這些相互聯(lián)系和彼此交織的環(huán)境適應(yīng)策略不僅保障了環(huán)境病原真菌在自然生境下的存活，同樣也維系了其在不同宿主微環(huán)境中的生存優(yōu)勢。然而，當(dāng)前對(duì)于該類病原菌的研究主要圍繞單一致病性狀或致病形態(tài)來開展，對(duì)于真菌群體或社會(huì)調(diào)控的研究盡管有一些突破，但對(duì)其遺傳基礎(chǔ)以及相關(guān)分子或細(xì)胞機(jī)制的理解仍非常有限。

大多數(shù)環(huán)境人類病原真菌能夠通過改變形態(tài)去適應(yīng)不同的生境壓力以及宿主微環(huán)境。不同形態(tài)的細(xì)胞由于生理、代謝和細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)(細(xì)胞壁組分)的不同，導(dǎo)致它們對(duì)于宿主感染以及生境或宿主壓力適應(yīng)存在顯著差異。例如，酵母形態(tài)作為高毒形態(tài)參與隱球菌對(duì)宿主的侵染。與酵母形態(tài)相反，菌絲形態(tài)完全無毒，但能刺激小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)以及作為重要的分化階段參與隱球菌有性生殖過程。這反映了兩個(gè)信息：1)形態(tài)和細(xì)胞功能高度相關(guān)，兩種形態(tài)承載了兩個(gè)截然不同的生物學(xué)功能；2)存在形態(tài)特異的抗原和病原分子，抗原和病原基因在兩種形態(tài)中差異表達(dá)。值得注意的是，在新生隱球菌感染和性群落分化過程中，多種不同形態(tài)或功能的細(xì)胞亞群共存其中，除了酵母和菌絲形態(tài)還包括其他多種形態(tài)。這種顯著的形態(tài)異質(zhì)性可為新生隱球菌在細(xì)胞功能上提供多樣的選擇和組合。不僅如此，這些形態(tài)或功能的細(xì)胞可借助細(xì)胞通訊信號(hào)進(jìn)行相互轉(zhuǎn)換，極大擴(kuò)展了新生隱球菌細(xì)胞在功能選擇或組合上的可塑性。這些復(fù)雜多樣的社會(huì)調(diào)控方式和策略可能為新生隱球菌作為環(huán)境微生物和致命病原菌雙重角色提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。了解真菌群體或社會(huì)調(diào)控機(jī)制有助于揭示環(huán)境真菌感染宿主的核心病原學(xué)機(jī)制，可為開發(fā)抗真菌疫苗、鑒定藥物靶點(diǎn)和發(fā)展防控真菌感染的新型療法奠定重要的理論基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Party for killing: the social behaviors inCryptococcus neoformans

Hao Ding1,2, Guangjun He1, and Linqi Wang1
1State Key Laboratory of Mycology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China
2University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China

Fungal pathogens represent an important group of human pathogenic microbes that lead to an unacceptably severe global burden especially due to exceptionally high mortality.For many fungal pathogens, they are widespreadsaprophytes and human host is not the exclusive niche for their proliferation.Their exceptional capability to survive and thrive within infected host likely stems from their sophisticated strategies in adaptation to diverse biotic and abiotic stressors from natural niches or predators.Among these ‘environmental pathogens’,Cryptococcus neoformansas a model organism claims the lives of more than half a million annually.Some recent studies indicate that cryptococcal survival both inside and outside of hosts can be coordinated by a combination of social behaviors.In this review, we describe and discuss the social behaviors employed byC.neoformansand address their significant impact on biofilm formation, sexual reproduction and pathogenicity.

human fungal pathogen,Cryptococcus neoformans, cell communication, sexual reproduction, biofilm

March29,2017;Accepted:June15,2017

Linqi Wang.Tel/Fax: +86-10-64806184; E-mail: wanglq@im.ac.cn

丁浩, 何光軍, 王琳淇.人類環(huán)境病原真菌——新生隱球菌的社會(huì)行為.生物工程學(xué)報(bào),2017,33(9):1555?1566.

Ding H, He GJ, Wang LQ.Party for killing: the social behaviors inCryptococcus neoformans.Chin J Biotech,2017,33(9):1555?1566.

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.31570138,31501008), Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences(No.QYZDB-SSW-SSMC040).

國家自然科學(xué)基金(Nos.31570138,31501008)，中國科學(xué)院前沿科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目(No.QYZDB-SSW-SSMC040)資助。

王琳淇 中國科學(xué)院微生物研究所研究員，博士生導(dǎo)師。2009年于中國科學(xué)院微生物研究所獲得理學(xué)博士學(xué)位；2010–2014年先后在紐約大學(xué)蘭貢醫(yī)學(xué)中心和德克薩斯A&M 大學(xué)進(jìn)行博士后研究。中組部第6批“青年千人計(jì)劃”、國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者、中國科學(xué)院大學(xué)崗位教授、國際論文評(píng)述機(jī)構(gòu)“Faculty of1000”副編輯(微生物生長發(fā)育方向)。當(dāng)前研究方向?yàn)槿祟愔虏≌婢h(huán)境適應(yīng)與致病性，作為第一和通訊作者在Proc Natl Acad Sci USA(2篇)和PLoS Pathogens(3篇)等雜志上發(fā)表了多篇論文，獲得了分別由美國微生物學(xué)會(huì)與“Faculty of1000”機(jī)構(gòu)頒發(fā)的“真核細(xì)胞青年科學(xué)家獎(jiǎng)”與“F1000 AMF旅行獎(jiǎng)”。