劉俊波

(許昌市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 質(zhì)保室 河南 許昌 461000)

·藥學(xué)·

高效液相色譜法在二活雙烏通絡(luò)止痛濕敷劑芍藥苷含量測定中的應(yīng)用

劉俊波

(許昌市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 質(zhì)保室 河南 許昌 461000)

目的摸索、建立并確立二活雙烏通絡(luò)止痛濕敷劑中芍藥苷的含量測定方法。方法采用高效液相色譜法(NP-HPLC)測定二活雙烏通絡(luò)止痛濕敷劑的芍藥苷含量。結(jié)果以LC-10VP高效液相色譜儀、LC-10SPD紫外檢測器、VP-ODS(5 μm，150 mm×4.6 mm ID)色譜柱、N2000色譜工作站、流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85)、流速：1 ml/min、柱溫：室溫、檢測波長：230 nm；理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，對照品、樣品得以良好分離，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=35 685.612 15X+711 470.638 50，r=0.999 232 9，芍藥苷在0.200～0.800 μg范圍內(nèi)，芍藥苷峰面積值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。結(jié)論根據(jù)上述10批樣品測定結(jié)果，暫定本品每貼含赤芍以芍藥苷(C23H28O11)計(jì)，不得少于1.00 mg。經(jīng)對以上10批樣品中芍藥苷的含量進(jìn)行測定表明，本項(xiàng)研究確能控制和評判產(chǎn)品質(zhì)量，其操作簡便、滿足質(zhì)量控制要求。

高效液相色譜法；二活雙烏通絡(luò)止痛濕敷劑；芍藥苷

痹證是指一種因風(fēng)、寒、濕等病邪侵襲人體肌表，經(jīng)絡(luò)致氣血凝滯、閉阻不暢的病證。臨床特點(diǎn)是肢體、肌肉、關(guān)節(jié)等處疼痛、酸楚、麻木、重著、屈伸不利或關(guān)節(jié)腫脹等癥狀。痹癥出自《內(nèi)經(jīng)》，并對其病因、病機(jī)、癥狀等均有較詳細(xì)的論述，同時(shí)根據(jù)其不同發(fā)病季節(jié)、病因及經(jīng)絡(luò)和臟腑等而又提出各種不同的病證。如 《素問·痹論》說:“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也?！薄讹L(fēng)濕痹候》說：風(fēng)濕痹“由血?dú)馓搫t受風(fēng)濕，而成此病。”《素問·痹論》：“風(fēng)、寒、濕三氣雜到，合而為痹也”。病因在于經(jīng)久勞損，風(fēng)寒濕邪入侵相搏，痰阻經(jīng)絡(luò)而致經(jīng)絡(luò)不通，氣血痹阻，痹在于骨則重而不舉，在于脈則血凝不流，在于筋則屈伸不利”。肩周炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、頸椎病等多屬痹癥的范疇，臨床癥候以肢體疼痛、活動(dòng)受限、困重?zé)o力、麻木僵硬為其特點(diǎn)。解除這些癥狀，需要采取祛風(fēng)除濕、舒筋止痛、活血化瘀的方法予以治療。

取方于民間驗(yàn)方的二活雙烏通絡(luò)止痛濕敷劑以“祛風(fēng)、活絡(luò)、止痛”的“防風(fēng)、羌活、獨(dú)活”為君藥，以“溫通經(jīng)脈、活血化瘀、通絡(luò)止痛”的“白芷、桂枝、制川烏、制草烏、赤芍、肉桂”為臣，并佐使以“紅花、透骨草、千年健、伸筋草、川牛膝、川芎”等，具有 “祛風(fēng)散寒止痛，活血化瘀通絡(luò)”功效，對風(fēng)、寒、濕、血瘀引起的肩周炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩關(guān)節(jié)周圍軟組織疼痛，麻木，屈伸不利及頸椎病等有良好治療效果。

根據(jù)本品處方組成，為有效控制產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量，選擇處方中具有清熱涼血、散瘀止痛的傷科良藥-赤芍的活性成分芍藥苷作為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)。本標(biāo)準(zhǔn)參考有關(guān)文獻(xiàn)資料，采用高效液相色譜法(NP-HPLC)測定芍藥苷含量，建立起可迅速測定本品中芍藥苷含量的方法，本法具有分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器LC-10VP高效液相色譜儀(日本島津SHIMADZU公司)；LC-10SPD紫外檢測器(日本島津SHIMADZU公司)；VP-ODS(5 μm，150 mm×4.6 mm ID)色譜柱(日本島津SHIMADZU公司)；N2000色譜工作站(浙江大學(xué)軟件開發(fā)公司)；塞多利斯BP211D電子天平(德國)；AS 3120A超聲波清洗器(Automatic Science(Tianjing)Instrument Co.Ltd)。

1.2試藥芍藥苷對照品(批號110749-200512，供含測用，由中國藥品生物制品檢定所提供)；乙腈為色譜純試劑(美國TEDIA公司)；水為二次蒸餾水；其余試劑為分析純(西安化學(xué)試劑廠)。

2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：VP- ODS柱(5 μm，150 mm×4.6 mm ID)；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85)；流速：1 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：230 nm；理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。見表2。

按照上述色譜條件，分別注入對照品、供試品、陰性樣品溶液，其色譜圖分別為圖1、圖2、圖3，從對色譜分離的效果分析表(表1、表2、表3)可見，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算遠(yuǎn)大于3 000，且供試品色譜中，芍藥苷峰型規(guī)整，實(shí)現(xiàn)了良好的分離，表明色譜條件與系統(tǒng)均適用。

圖1 對照品色譜圖

峰號峰名保留時(shí)間峰面積含量13.065806.7880.153202芍藥苷17.248525817.23399.84688總計(jì)526624.021100.00000

表2 系統(tǒng)評價(jià)表

圖2 樣品色譜圖

峰名保留時(shí)間峰面積理論塔板數(shù)分離度拖尾因子不對稱度芍藥苷16.785373856.000100118.6262.3701.0351.046

圖3 缺芍藥苷陰性色譜圖

3 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對照品10 mg，置25 ml量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 ml含芍藥苷40 μg)。

4 供試品溶液的制備

4.1提取完全性試驗(yàn)取本品5貼(批號20150601)，擠干，無紡布用水洗滌4次，每次10 ml，分別收集擠出液與各次洗滌液于水浴鍋上蒸干，殘?jiān)?0%甲醇適量溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml已精密稱定的量瓶中，再分別用50%甲醇稀釋至刻度，精密稱定，搖勻，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，分別精密吸取對照品溶液及各次洗滌液供試品溶液各10 μl測定芍藥苷含量。見表4。

表4 提取完全性試驗(yàn)

上述結(jié)果表明，第4次洗滌液中芍藥苷含量已微乎其微，第3次洗滌液中芍藥苷含量略有痕量，為簡化操作節(jié)約時(shí)間可采用洗滌2次，每次10 ml，擠出液與2次洗滌液合并，置于50 ml已精密稱定的量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，精密稱定，搖勻，精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇并稀釋至刻度以定容。

4.2制備方法的選擇取本品5貼，擠干，無紡布用水洗滌2次，每次10 ml，擠出液與2次洗滌液合并，置于50 ml已精密稱定的量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，精密稱定，搖勻，精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

5 線性關(guān)系考察

精密稱取芍藥苷對照品10 mg，置250 ml量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻(40 μg/ml)，分別精密吸取對照品溶液5.0、10.0、12.5、15.0、20.0 μl進(jìn)樣，測定峰面積值。見表5。

以峰面積值(Y)對進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=35 685.612 15X+711 470.638 50，r=0.999 232 9。以峰面積值(Y)對進(jìn)樣量(X)作圖，得一直線(見圖4)。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)結(jié)果

圖4 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

以上結(jié)果表明,在0.200～0.800 μg范圍內(nèi),芍藥苷峰面積值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

6 精密度考察

按所選定的對照品溶液的制備方法，制備對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μl，測定芍藥苷峰面積值。見表6。結(jié)果平均峰面積為594 683.742，SD=2 929.957，RSD=0.492 7%，表明精密度良好。

表6 精密度測定結(jié)果

7 穩(wěn)定性考察

按所選定的供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，分別在0、1.5、3、4.5、6 h進(jìn)樣，測定供試品溶液中芍藥苷峰面積。見表7。結(jié)果平均峰面積為369 726.043 8，SD=6 177.847，RSD=1.67%，結(jié)果表明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

8 重現(xiàn)性考察

按擬定的含量測定方法，取同一批樣品(批號150601)5份，分別按照供試品溶液的制法制備供試液，按擬定的色譜條件測定芍藥苷的含量，結(jié)果見表8。結(jié)果芍藥苷的平均含量為1.459 8mg/貼，SD=0.015 512 8，RSD=1.07%，表明重現(xiàn)性良好。

表8 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

9 干擾性試驗(yàn)

按本制劑處方組成，制備不含赤芍的陰性空白制劑，按擬定的樣品制備方法，制得陰性對照溶液，將對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液分別進(jìn)樣。結(jié)果陰性對照溶液在芍藥苷色譜峰處無相應(yīng)峰出現(xiàn)(見圖3)，而供試品溶液在芍藥苷峰處有峰出現(xiàn)(見圖2)，說明處方中其余藥味對芍藥苷的測定無干擾。

10 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(批號150601含量：1.46 mg/貼)24貼，其中12貼平均分作6份，另12貼平均分作4份。

取以上10份樣品，除去包裝，擠干，無紡布用水洗滌2次，每次10 ml，擠出液與2次洗滌液合并，置于50 ml已精密稱定的量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，精密稱定，搖勻，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，分別在其中精密加入濃度為40 μg/ml芍藥苷對照品溶液3 ml、3 ml、3 ml、10 ml、10 ml、10 ml、3 ml、3 ml、10 ml、10 ml，加50%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，測定芍藥苷的含量以下列公式計(jì)算回收率。見表9。結(jié)果表明，平均回收率為100.08%，SD=1.43，RSD=1.43%，加樣回收率良好。

表9 回收率試驗(yàn)結(jié)果

11 樣品測定

按上述方法測定中試生產(chǎn)樣品中芍藥苷的含量。見表10。

表10 中試樣品中芍藥苷含量測定結(jié)果

根據(jù)上述10批樣品測定結(jié)果,暫定本品每貼含赤芍以芍藥苷(C23H28O11)計(jì),不得少于1.00 mg。

12 結(jié)果與討論

本品為濕敷劑，系由無紡布等吸附載體吸收適量液體而成，由于吸附載體的引入，導(dǎo)致在定量取樣時(shí)不如固體或液體制劑方便，而類似于軟膏劑等，故采用獨(dú)立單體進(jìn)行取樣，尤在回收率試驗(yàn)中使用不同劑量以考察數(shù)據(jù)偏差而評價(jià)試驗(yàn)系統(tǒng)誤差。在供試品制備中，使用先定容濃配再定容稀配的處理樣品方式以控制和降低試驗(yàn)系統(tǒng)誤差。

經(jīng)對以上10批樣品中芍藥苷的含量進(jìn)行測定表明，本項(xiàng)研究確能控制和評判產(chǎn)品質(zhì)量，其操作簡便、滿足質(zhì)量控制要求。

R 284

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.20.022

2016-12-28)