康學(xué) 許保海

·論著·

參芪降糖顆粒對高糖環(huán)境下施萬細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用

康學(xué) 許保海

目的探討參芪降糖顆粒對高糖環(huán)境下施萬細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用。方法采用高糖環(huán)境下培養(yǎng)的施萬細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型，實驗分為正常對照組、高糖組、參芪降糖含藥血清組和甲鈷胺含藥血清組，干預(yù)48小時后，用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞中總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde， MDA)含量，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)水平。結(jié)果高糖干預(yù)48小時后，與正常對照組比較，高糖組細(xì)胞T-AOC和SOD含量明顯降低，ROS、MDA水平顯著升高(P<0.01)；與高糖組比較，參芪降糖含藥血清能顯著提高細(xì)胞T-AOC和SOD含量，明顯下調(diào)ROS和MDA水平(P<0.05)。結(jié)論參芪降糖顆粒能夠明顯提高具有抗氧化能力物質(zhì)T-AOC和SOD水平，清除有害的氧化代謝產(chǎn)物ROS和MDA，通過抑制高糖環(huán)境下施萬細(xì)胞的氧化應(yīng)激而發(fā)揮對糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激； 施萬細(xì)胞； 糖尿病周圍神經(jīng)病變； 參芪降糖顆粒

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的并發(fā)病之一[1]。DPN的發(fā)病機制尚未完全闡明，其發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，糖尿病并發(fā)癥統(tǒng)一機制學(xué)說認(rèn)為：高糖狀態(tài)引起線粒體中超氧陰離子生成過多，組織細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致包括DPN在內(nèi)的糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生[2]。DPN目前尚無特效治療方法，西藥治療現(xiàn)狀并不理想，而中醫(yī)藥在防治本病方面具有較大優(yōu)勢。DPN屬于中醫(yī)“消渴痹證”之范疇，其病機為氣陰兩虛，進(jìn)而脈絡(luò)瘀阻。中成藥參芪降糖顆粒益氣養(yǎng)陰，滋脾補腎，正切合DPN之中醫(yī)病機。本文旨在探討參芪降糖顆粒對高糖環(huán)境下周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞——施萬細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用，為DPN的機制研究及臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物和細(xì)胞來源

SPF級雄性SD大鼠35只，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。RSC96 cell line(ATCC?CRL-2765TM)，購自American Type Culture Collection。

1.2試劑與藥品

D-(+)-Glucose(No.D7021，Sigma-Aldrich Inc.)；DMEM培養(yǎng)基(No.11965-092，Gibco)，0.25%胰蛋白酶消化液(不含EDTA和酚紅，T1305，索萊寶科技有限公司)；MTT(No.M5655，Sigma)；DMSO(No.D2650，Sigma)。T-AOC試劑盒(No.20170320)、SOD試劑盒(No.20170314)、MDA試劑盒(No.20170314)和總蛋白測定試劑盒(No.20170308)，均購自南京建成生物工程研究所。ROS試劑盒(No.88-5930，eBioscience)。參芪降糖顆粒(批號：41913327，魯南厚普制藥有限公司)；甲鈷胺片(商品名：彌可保，0.5 mg/片，批號：1609066，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司)。

1.3儀器

371型CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；SpectraMax Plus 384全波長酶標(biāo)儀(Molecular Devices)LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀(BD Bioscience)；LWD300-38LTI三目倒置相差顯微鏡(上海測維光電)；Biofuge 15R低溫生物離心機(Heraeus SEPATECH)；UW3100型超聲破碎儀(BANDELIN)；XDTD-8222恒溫鼓風(fēng)干燥箱(精宏實驗設(shè)備有限公司)；W-01B數(shù)顯恒溫水浴鍋(金怡儀器科技有限公司)。

1.4含藥血清的制備

35只大鼠隨機分為空白血清組(7只)，高糖組(7只)，參芪降糖含藥血清組(14只)和甲鈷胺含藥血清組(7只)。按人和動物體表面積換算，大鼠給藥量為人體等效劑量8倍，即參芪降糖組按1.2 g/kg灌胃中藥水溶液，陽性藥含藥血清組給予20 mg/kg甲鈷胺水溶液，空白對照組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)7天。于末次給藥2小時后，腹主動脈取血，靜置2小時后，離心取血清，56℃水浴40分鐘滅活，除菌過濾，分裝后置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細(xì)胞活力MTT檢測

將對數(shù)生長期的RSC96細(xì)胞復(fù)蘇后，分別加入25 mM的DMEM培養(yǎng)基+10%正常大鼠血清、150 mM葡萄糖+10%正常大鼠血清、150 mM葡萄糖+10%參芪降糖血清、150 mM葡萄糖+1%參芪降糖血清、150 mM葡萄糖+10% 甲鈷胺含藥血清。孵育48小時后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入20% MTT/DMEM培養(yǎng)基，孵育4小時后，每孔加入DMSO，混勻溶解，于490 nm測OD值。

每組取4個復(fù)孔的OD值計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=實驗組OD值/25 mM組OD值×100%。

1.6實驗分組及給藥

取對數(shù)生長期低糖培養(yǎng)的RSC96細(xì)胞，胰蛋白酶消化計數(shù)后，接種于96孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁，棄上清，加入不含胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基同步化24小時后，吸掉培養(yǎng)上清，分組加入藥物血清。實驗共分5組：(1)正常對照組(25 mM的DMEM培養(yǎng)基+10%正常大鼠血清)；(2)高糖組(150 mM葡萄糖+10%正常大鼠血清)；(3)參芪降糖高劑量組(150 mM葡萄糖+10%參芪降糖顆含藥血清)；(4)參芪降糖低劑量組(150 mM葡萄糖+1%參芪降糖顆含藥血清)；(5)陽性藥組(150 mM葡萄糖+10%甲鈷胺含藥血清)。每組設(shè)4個復(fù)孔，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48小時后待檢。

1.7細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測

總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒測定T-AOC活力；羥胺法測定各組細(xì)胞中SOD活力；微量丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒檢測MDA含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，最終利用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行各組施萬細(xì)胞中三者含量的比較。

ROS試劑盒是一種利用熒光探針DCFH2-DA進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。DCFH2-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，故使用LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，利用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行各組細(xì)胞中DCF熒光強度(FITC)的比較。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1參芪降糖含藥血清對細(xì)胞活性的影響

分別檢測各組干預(yù)RSC96細(xì)胞48小時后細(xì)胞活性情況。結(jié)果顯示：與正常對照組比較，高糖組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.01)；與高糖組比較，參芪降糖高、低劑量組及甲鈷胺組均能顯著提高細(xì)胞活性(P<0.05)。故選擇10%和1%參芪降糖含藥血清分別作為高、低劑量進(jìn)行下一步試驗。見表1。

表1 各組細(xì)胞活性的比較

注： 與正常對照組比較，aP<0.01； 與高糖組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.2參芪降糖顆粒對高糖環(huán)境下施萬細(xì)胞T-AOC、SOD的影響

與正常對照組比較，高糖組細(xì)胞T-AOC和SOD含量均顯著降低(均P<0.01)；與高糖組比較，參芪降糖高劑量組和甲鈷胺組T-AOC含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，參芪降糖高、低劑量組及甲鈷胺組均能明顯提高細(xì)胞SOD含量(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 各組細(xì)胞中T-AOC、SOD含量的比較

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.3參芪降糖顆粒對高糖環(huán)境下施萬細(xì)胞ROS、MDA的影響

與正常對照組比較，高糖組細(xì)胞ROS含量明顯升高(P<0.01)；參芪降糖高、低劑量組和甲鈷胺組細(xì)胞中ROS含量較高糖組顯著降低(均P<0.01)。見表3、圖1。高糖組細(xì)胞MDA含量較正常組顯著升高(P<0.01)；各含藥血清組均能明顯降低細(xì)胞中MDA含量(均P<0.01)。見表3。

表3 各組細(xì)胞中ROS、MDA含量的比較

注： 與正常對照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.01。

圖1 各組細(xì)胞中ROS熒光強度的比較

3 討論

研究表明，90%的DM患者隨病程的延長可最終發(fā)展為DPN。DPN患者存在因周圍神經(jīng)功能障礙引起的肢體麻木、疼痛、異樣感，甚至肌肉萎縮[3]。因其高發(fā)病率及嚴(yán)重的致殘率，對DPN的防治已成為糖尿病并發(fā)癥研究的重要課題。DPN的主要病理學(xué)變化是神經(jīng)纖維的多灶性丟失，從而使自由基防御減少，脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞損傷或凋亡。眾多研究發(fā)現(xiàn)，DPN的病機是細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致多個代謝途徑受損的最終結(jié)果，氧化應(yīng)激貫穿于DPN的發(fā)生發(fā)展過程中[4]。Brownlee[5]提出的統(tǒng)一機制學(xué)說認(rèn)為：經(jīng)典的糖尿病并發(fā)癥的多元醇途徑、氨基己糖途徑、AGES途徑和PKC途徑均是高糖環(huán)境下線粒體呼吸鏈中的超氧陰離子生成過多導(dǎo)致的結(jié)果，進(jìn)而氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，引起組織損傷。目前，對于DPN這一復(fù)雜的病變而言，單純的西醫(yī)治療存在治療費用高、療程長、不良反應(yīng)多等弊端，治療現(xiàn)狀并不理想。而中醫(yī)藥著重調(diào)動內(nèi)因，多靶點多途徑整體調(diào)節(jié)。研究報道[6]，中藥可通過增強抗氧化物酶活性，減少過氧化物表達(dá)、抑制線粒體途徑細(xì)胞凋亡、抑制DNA氧化損傷途徑、抑制HO-1表達(dá)等發(fā)揮對DPN的治療作用，優(yōu)勢顯著。

DPN具有“冷、麻、痛、痿”等特點，當(dāng)屬于中醫(yī)“消渴痹癥”范疇[7]，中醫(yī)理論認(rèn)為，消渴初期患者熱盛于內(nèi)，燥熱日久，進(jìn)而傷陰耗氣并出現(xiàn)氣陰兩虛，導(dǎo)致血行澀滯，脈絡(luò)痹阻。正如《證治要訣》所云：“消渴日久，精血虧耗，可致雀盲或四肢麻木?！痹摬∫詺馓撗潪楸?，瘀血阻絡(luò)為標(biāo)；病位在肌膚、脈絡(luò)、筋肉，內(nèi)及脾、腎、肝等臟腑。參芪降糖顆粒中主藥人參、黃芪大補元氣；生地黃、麥冬、五味子等養(yǎng)陰生津；枸杞子、覆盆子滋腎固精；加之山藥、茯苓健脾和胃，諸藥合用共奏益腎養(yǎng)陰、滋脾補腎之功，正切合DPN之中醫(yī)病機。此外，氧化應(yīng)激是DPN發(fā)生發(fā)展的核心，該機制近似于中醫(yī)的熱邪入內(nèi)，耗氣傷陰，瘀血痹阻，同時熱化為毒，損傷臟腑經(jīng)絡(luò)，最終出現(xiàn)周圍神經(jīng)病變[8]。現(xiàn)代藥理研究表明[9]黃芪中的主要成分黃芪多糖、皂苷、異黃酮類能抑制自由基產(chǎn)生，清除過剩的自由基，保護(hù)細(xì)胞，還可提高機體抗氧化酶活力；人參中的超氧化物歧化酶活力相對穩(wěn)定，可保持在95%以上，具有顯著的抗氧化作用。

氧化應(yīng)激損傷與DPN發(fā)病密切相關(guān)，高糖可引起線粒體電子傳遞鏈中ROS生成過量和抗氧化防御系統(tǒng)受損，引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而通過直接損傷或激活各種通路的方式損傷血管和神經(jīng)組織[10]。T-AOC是總抗氧化分子和酶含量總和，能夠清除過量的活性氧，使機體處于氧化還原相對平衡的狀態(tài)。SOD是機體重要抗氧化物酶，能將機體在正常新陳代謝中產(chǎn)生的有害物質(zhì)及時消除，避免造成生理性損傷，它的活力和含量反映了機體清除氧自由基的能力[11]。MDA是氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，反映機體脂質(zhì)過氧化水平，它能加劇細(xì)胞膜膜損傷程度，進(jìn)而誘發(fā)一系列蛋白質(zhì)、核酸交聯(lián)聚合，形成細(xì)胞毒性[12]。本實驗結(jié)果顯示：高糖干預(yù)48小時后，細(xì)胞T-AOC和SOD含量明顯降低，ROS、MDA水平顯著升高(均P<0.01)，提示高糖可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS大量堆積，從而抑制抗氧化劑活性，使總抗氧化能力降低，而毒性代謝產(chǎn)物MDA明顯升高，機體處于氧化應(yīng)激失衡狀態(tài)；參芪降糖顆粒能顯著提高細(xì)胞T-AOC和SOD含量，明顯下調(diào)ROS和MDA水平，提示藥物可通過提高抗氧化能力物質(zhì)，清除有害代謝產(chǎn)物，減少氧化應(yīng)激損傷，最終發(fā)揮對DPN的保護(hù)作用。

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EffectsofShenqiJiangtanggranuleonoxidativestressinSchwanncellswithhighglucoseenvironment

KANGXue,XUBaohai.PharmacyofTCM,BeijingJishuitanHospital,Beijing10035,China

Correspondingauthor:XUBaohai,E-mail:xubaohai70@163.com

ObjectiveTo explore the effects ofShenqiJiangtanggranule on oxidative stress in Schwann cells with high glucose environment.MethodsOxidative stress model of Schwann cells was established by high glucose environment. The experiment was divided into normal control group, high glucose group,ShenqiJiangtangserum group and methylcobalamin serum group and treatment for 48 hours (h). Microplate Reader was used to detect the content of total antioxidant capacity (T-AOC), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA). Flow cytometry was used to analysis the level of reactive oxygen species (ROS).ResultsAfter incubated with high glucose for 24 h, the content of T-AOC and SOD in high glucose group were significantly lower, while ROS and MDA activity were significantly higher than normal control group (P<0.01). Compared with high glucose group,ShenqiJiangtangserum could significantly increase the content of T-AOC and SOD, while the level of ROS and MDA was decreased obviously (P<0.05).ConclusionShenqiJiangtanggranule can obviously improve the levels of antioxidant substances T-AOC and SOD, meanwhile eliminate the harmful oxidation metabolites ROS and MDA, play a protective effect on diabetic peripheral neuropathy by inhibiting oxidative stress in Schwann cells with high glucose environment.

Oxidative stress； Schwann cells； Diabetic peripheral neuropathy；ShenqiJiangtanggranule

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.002

2017-04-11)

(本文編輯： 王馨瑤)

100035 北京積水潭醫(yī)院中藥房

康學(xué)(1989- )，女，碩士，藥師。研究方向：中藥藥效與作用機制。E-mail：kangxue0907@126.com

許保海(1970- )，本科，主任藥師。研究方向：中藥調(diào)劑、鑒定，合理使用中成藥。E-mail：xubaohai70@163.com