張晶芳 張繞繞 王璐 卜克

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科 河南 鄭州 450000)

ALX4基因啟動子區(qū)甲基化在大腸癌早期診斷中的意義

張晶芳 張繞繞 王璐 卜克

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科 河南 鄭州 450000)

目的通過檢測血液樣本中ALX4基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，為大腸癌早期診斷尋找非侵入性的篩查方法。方法收集25例大腸癌患者和25例健康對照者的血液樣本，使用亞硫酸氫鈉提取血DNA，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)分析ALX4基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化情況。結(jié)果25例大腸癌患者中有18例存在ALX4基因甲基化，25例健康對照組中4例存在甲基化。腫瘤組樣本中啟動子區(qū)甲基化檢測的敏感性為72%，特異性為84%。腫瘤組與對照組之間ALX4基因啟動子的甲基化狀態(tài)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論ALX4基因啟動子區(qū)甲基化檢測在大腸癌診斷中具有較高的敏感度和特異度，可能成為大腸癌早期篩查的血清學(xué)標(biāo)志物。

大腸癌；ALX4基因；DNA甲基化

大腸癌是臨床上常見的癌癥之一[1]。腺瘤的早期發(fā)現(xiàn)和切除可顯著降低大腸癌患者的死亡風(fēng)險[2-4]。因此大腸癌篩查可有效降低該病的死亡率。糞便潛血試驗是目前最廣泛的非侵入性篩查方法，但由于其靈敏度低以及患者的依從性差，仍需要尋找更靈敏、依從性更好的非侵入性檢測手段[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，在特殊人群中選擇性出現(xiàn)的一些基因是大腸癌篩查的理想血清學(xué)標(biāo)志物[9-11]。許多人類蛋白編碼基因的啟動子區(qū)包含有CpG島，而CpG島序列中胞嘧啶異常甲基化會導(dǎo)致該啟動子控制的基因失活。在許多癌癥的發(fā)生與腫瘤抑制基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化有關(guān)，包括大腸癌[12]。研究報道，啟動子甲基化改變最早發(fā)生癌前病變階段，這表明表觀遺傳學(xué)中DNA改變對惡性腫瘤可能具有早期診斷價值[11]。

人類ALX4基因位于11號染色體p11.2上，其編碼的蛋白是人體生長發(fā)育所必需的，ALX4基因啟動子甲基化在血液學(xué)方面的敏感性和特異性研究，已經(jīng)取得了令人滿意的結(jié)果[9-10]。本研究采用甲基化特異性PCR(MSP)評估了大腸癌患者和健康人群游離DNA樣本中ALX4基因甲基化狀態(tài)，為大腸癌早期檢測和早期篩查尋找潛在的血清學(xué)標(biāo)記物。

1 材料和方法

1.1實驗對象選取大腸癌患者和健康人各25例。大腸癌患者根據(jù)結(jié)腸鏡檢查和病理報告確診(腫瘤組)，經(jīng)結(jié)腸鏡檢查確診為正常者納入對照組。

1.2樣本采集抽取5 ml外周靜脈血液，所有的血液樣品采用冷凍離心機3 000 r/min×10 min分離血清，儲存在-80 ℃冰箱備用。

1.2.1DNA 提取 采用DNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)提取200 μl血清中游離DNA，儲存在-80 ℃冰箱備用。

1.2.2亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 按照說明書應(yīng)用甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒(Qiagen公司)將DNA樣本進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，使DNA分子中非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成尿嘧啶。

1.2.3MSP 分別設(shè)計ALX4特異性甲基化引物(ALX4-M)及特異性非甲基化引物(ALX4-U)。①ALX4-M：上游5’-GGGTAAGGAGTGATAAGTATAAGTTTTTTC-3’，下游5’-CATACCTAACTTACGCAAACGAC-3’，產(chǎn)物為118 bp；②ALX4-U：上游5’-GGGTAA GGAGTGATAAGTATAAGTTTTTTT-3’，下游5’-CAACATTCATACCTAACTTACACAAACA-3’，產(chǎn)物為125 bp。取3 μl亞硫酸鹽修飾后的DNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃×5 min；95 ℃×30 s，60 ℃×30 s，72 ℃×40 s，40個循環(huán)；72 ℃×5 min。以體外DNA甲基化(invitro methylated DNA，IVD)為陽性對照，以正常人外周血淋巴細(xì)胞(normal lymphocyte，NL)DNA為非甲基化對照。取PCR產(chǎn)物10 μl在2%的瓊脂糖凝膠中電泳。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，兩組甲基化率的比較采用Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

腫瘤組中有18例存在ALX4基因甲基化(圖1)，對照組中4例存在甲基化。外腫瘤組周血中血清ALX4基因甲基化的敏感性為84%，特異性為72%。與對照組相比，腫瘤組的ALX4基因甲基化水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 ALX4在大腸癌患者中的甲基化狀況

3 討論

大腸癌的高發(fā)病率、高死亡率以及早期診斷早期治愈的特點，使得大規(guī)模篩查很有意義。目前，大腸癌篩查方法存在的主要問題之一是患者依從性較低。大腸癌篩查試驗可分為直接和間接兩類。以大便為基礎(chǔ)的間接試驗可用于大腸癌的診斷，間接試驗的主要缺點是利于癌癥的檢測而不是腺瘤。直接檢查如乙狀結(jié)腸鏡、結(jié)腸鏡、CT結(jié)腸成像(CTC)，無論在癌癥還是腺瘤階段都可以直接觀察到病變的部位。但與間接試驗相比，直接檢查具有侵入性及費用高的特點。雖然結(jié)腸鏡檢查是大腸癌篩查和診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于低依從性和高費用，在我國不到30%的患者接受該檢查。

研究表明惡性腫瘤患者外周血中存在高水平的游離DNA，并發(fā)現(xiàn)這些循環(huán)DNA可以代表多種腫瘤特征的變化，如癌基因和抑癌基因的突變、微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性、染色體易位和基因表達的變化。在腫瘤患者血液中促進腫瘤增殖的DNA增多可以作為腫瘤檢測的血液學(xué)標(biāo)記物[8-10]。隨著血液學(xué)方面腫瘤檢測手段的發(fā)展，患者的依從性大大改善，提高了疾病的早期檢測率。研究發(fā)現(xiàn)，ALX4基因啟動子區(qū)甲基化在大多數(shù)大腸癌前病變的血液樣品中敏感性為83.3%，特異性為70%[11-12]。這種程度的敏感性幾乎與侵入性的結(jié)腸鏡檢查水平相當(dāng)。本研究分析了25例結(jié)直腸癌患者和對照者血液樣品中ALX4基因啟動子的甲基化狀況，得到84%的高靈敏度，高于先前的報道[9]。這項研究作為一種非侵入性的檢測方法首次在我國試行得到令人滿意的敏感性水平，希望未來有更多關(guān)于血液學(xué)DNA標(biāo)記的研究，為我國大腸癌篩查提供有影響力的非侵入性檢查方法。

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SignificanceofmethylationofpromoterregionofALX4geneinearlydiagnosisofcolorectalcancer

Zhang Jingfang，Zhang Raorao，Wang Lu，Bu Ke

(DepartmentofIntensiveCareUnit，theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450000，China)

ObjectiveTo develop a non-invasive screening method for early diagnosis of colorectal cancer by detecting methylation status of promoter region ofALX4 gene in blood samples.Methods25 patients with colorectal cancer and 25 healthy control subjects blood samples were collected, which were used sodium bisulfite to extract the blood DNA, used methylation specific polymerase chain reaction (MSP) to analysis ofALX4 gene promoter CpG island methylation.ResultsMethylation ofALX4 gene was present in 18 of 25 patients with colorectal cancer, and methylation in 4 of the 25 healthy controls. The sensitivity of promoter methylation detection in tumor samples was 72% and specificity was 84%. The methylation status ofALX4 gene promoter was statistically significant between tumor group and control group (P< 0.05).ConclusionDetection ofALX4 promoter methylation has high sensitivity and specificity in the diagnosis of colorectal cancer, and it may be a serological marker for early screening of colorectal cancer.

colorectal cancer；ALX4 gene；DNA methylation

R 735.3

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.20.009

2017-03-10)