劉又斌 張鵬 劉宗軍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 心內(nèi)科 上海 200062)

·論著·

過表達GCNF誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的相關(guān)研究

劉又斌 張鵬 劉宗軍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 心內(nèi)科 上海 200062)

目的研究過表達生殖細胞核因子(GCNF)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)凋亡的可能機制。方法通過過表達GCNF腺病毒上調(diào)BMSCs中GCNF表達水平，利用間接免疫熒光化學(xué)技術(shù)確定其亞細胞定位，MTT檢測細胞活力的影響，DAPI染色檢測細胞凋亡，Caspase3/8/9檢測細胞凋亡蛋白活性。結(jié)果BMSCs細胞中GCNF過表達后，GCNF蛋白亞細胞定位于細胞核，細胞活力降低，凋亡通路被激活。結(jié)論腺病毒GCNF過表達能降低大鼠BMSCs細胞活力，增加其凋亡水平。

生殖細胞核因子；骨髓間充質(zhì)干細胞；凋亡；半胱氨酸蛋白酶

生殖細胞核因子(germ cell nuclear factor，GCNF)為孤兒核受體，是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子。目前研究表明，GCNF在各系統(tǒng)如神經(jīng)系統(tǒng)、胎盤以及生殖細胞的發(fā)育過程中高度表達，也在成年人及動物的睪丸和卵巢中高表達[1-2]。Oct-4是胚胎干細胞維持其多潛能性的關(guān)鍵基因，它的表達與沉默決定胚胎干細胞是自我更新還是定向分化。在各種特定條件下，可定向誘導(dǎo)干細胞分化，如骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向心肌細胞、神經(jīng)細胞、骨細胞等細胞分化。

GCNF在不同物種間同源性很高，其中人和小鼠GCNF基因序列的同源性高達98.7%，因而在功能上很可能具有高度保守性[3]。萬成等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌細胞中過表達GCNF，通過RIPK2和RIPK3基因和蛋白水平的上調(diào)，從而引起心肌細胞凋亡。本研究利用腺病毒載體過表達大鼠BMSCs中GCNF表達水平，研究其誘導(dǎo)BMSCs凋亡過程中的可能機制。

基于仿真或標(biāo)準化病人的教學(xué)模式盛行；美國和歐洲藥學(xué)課程中以病人為中心的護理比較；基于團隊的學(xué)習(xí)課程中的同伴評估工具開發(fā)、管理和評估；學(xué)生對藥物治療學(xué)團隊學(xué)習(xí)和講座的態(tài)度和看法；比較面對面和在線團隊學(xué)習(xí)教導(dǎo)苯妥英的藥代動力學(xué)的有效性；課程中實行翻轉(zhuǎn)課堂模式和虛擬病例相結(jié)合；以過程為導(dǎo)向的探究式學(xué)習(xí)教學(xué)策略；通過角色扮演培養(yǎng)藥學(xué)學(xué)生交流技能；運用幽默提高學(xué)習(xí)效果；利用虛擬病例、虛擬患者促進自主學(xué)習(xí)；基于問題的學(xué)習(xí)方法研究。研究的趨勢是基于仿真或標(biāo)準化病人、虛擬病例的教學(xué)、基于問題的教學(xué)方法以及團隊學(xué)習(xí)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 150～200 g SD雄性大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。

1.2.3DAPI染色檢測細胞凋亡率 5×105個BMSCs細胞接種于6孔板，細胞密度約75%，加入腺病毒GCNF，于36 h和48 h進行DAPI液染核，檢測BMSCs細胞凋亡率。具體步驟：棄除培養(yǎng)液，PBS液洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，吸除甲醛，PBS液洗3次，200 μl DAPI液常溫避光孵育15 min，吸除DAPI液，PBS液洗3次，熒光顯微鏡下觀察。隨機選取6個視野，計數(shù)視野中凋亡細胞的百分比，進行統(tǒng)計分析。

1.2.2GCNF基因亞細胞定位 采用間接免疫熒光法確定GCNF在BMSCs細胞中的亞細胞定位。1×104個BMSCs細胞接種于24孔板，細胞鋪滿板底50%，加入腺病毒GCNF處理24 h，PBS液洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS液沖洗2次，3% BSA常溫封閉2 h；將帶FLAG標(biāo)簽兔抗人抗體以1∶500孵育過夜，PBS液沖洗2次，加入驢抗兔FITC標(biāo)記的二抗常溫避光孵育2 h，PBS液沖洗2次；加DAPI 液50 μl，常溫避光孵育15 min，PBS液洗3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2實驗方法

2.2間接免疫熒光法顯示GCNF蛋白位于細胞核用特定帶有熒光標(biāo)記抗體(綠色)標(biāo)記GCNF蛋白，DAPI染細胞核(藍色)。通過熒光顯微鏡觀察可知，GCNF蛋白主要位于細胞核中。見圖2。

1.1.3主要試劑 H-DMEM(GIBCO)培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS，GIBCO)，PBS平衡液(生工公司)，胰蛋白酶(Promega)，DAPI染色液(碧云天)，Caspase3、Caspas8、Caspase9(Promega)，MTT(碧云天)，二甲基亞砜(DMSO，sigma，USA)，多聚甲醛(碧云天)

土壤主要就是路基建設(shè)過程中所應(yīng)用的工程材料土壤。從成本方面來考慮，也要考慮到工程的便捷性，路基施工的土壤需要從施工周邊區(qū)域中進行選取，但是很多情況，施工周邊的區(qū)域中土壤未必能夠滿足路基施工的需要，特別是要求比較高的高速公路施工項目。如果工程中應(yīng)用大塊的紅砂巖，該種材料壓實度會非常低，風(fēng)化與滲透都比較強，所以整個土體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性都非常差，未能夠有效的調(diào)配就應(yīng)用到工程中，就會導(dǎo)致路基出現(xiàn)沉降的問題[2]。

1.1.2腺病毒 腺病毒GCNF本實驗室構(gòu)建。

光波導(dǎo)諧振腔的自由譜寬FSR(Free SpectrumRange)指的是兩個相鄰諧振譜的間隔。從相位域上來看相鄰諧振譜的間隔等于2π,說明光在光波導(dǎo)諧振腔中的諧振是周期性的,周期為2π。相位域上為2π的自由譜寬對應(yīng)到頻率域上為

1.2.5Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白活性檢測 5×104個BMSCs細胞接種于24孔板，細胞密度為75%時，加入陰性病毒GFP和腺病毒GCNF處理48 h，加入Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9檢測試劑4 h后，檢測熒光值。

1.2.4MTT法檢測細胞活力 2×105個BMSCs細胞接種于12孔板，細胞密度約75%時，加入陰性病毒GFP和腺病毒GCNF處理，24、48、72 h后加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清液且加入二甲基亞砜溶解，置于搖床中間振蕩 (避光)，酶標(biāo)儀測490 nm處的讀取所對應(yīng)的吸光度(A490)值，設(shè)立3個復(fù)孔，取其平均值。

2.3MTT實驗表明細胞活力下降光鏡下可見加入腺病毒GCNF組大量細胞漂浮，細胞形態(tài)顯著改變。MTT試驗顯示陰性病毒GFP組在490 nm處的OD值隨時間延長而增多，表明細胞增殖能力強；腺病毒GCNF組在490 nm處的OD值明顯低于病毒GEP組，且呈下降趨勢，表明細胞活力下降，與鏡下觀察結(jié)果一致。見圖3。

2 結(jié)果

2.1BMSCs原代細胞觀察通過全骨髓貼壁篩選法獲取BMSCs原代細胞。獲取骨髓細胞24 h后首次換液，鏡下可見小部分貼壁成梭形細胞，6 d左右細胞鋪滿傳代(圖1：A～B)。0.25%胰酶消化，離心傳代，細胞形態(tài)統(tǒng)一，呈長梭形，生長速度較原代快，接種3 d后即可鋪滿培養(yǎng)皿皿底(圖1 C)。

A：P0代細胞(×200)；B：P0代細胞(×400)；C：P1代細胞，傳代培養(yǎng)細胞長滿后均成漩渦狀生長，排列整齊，多呈長梭形、較薄、有突起(×100)。

圖1BMSCs原代細胞觀察

1.2.1BMSCs原代細胞分離 全骨髓貼壁篩選法分離原代細胞。取100～150 g SD雄性大鼠，脫頸處死，無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨，用5 ml含10% FBS的H-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓，收集離心，棄上清，接種于H-DMEM完全培養(yǎng)液(含體積分數(shù)為0.1的FBS，青霉素100 mg/L、鏈霉素100 mg/L)，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h首次換液，棄除未貼壁的細胞，以后每3 d換液，同時觀察細胞形態(tài)和生長速度。待細胞融合成單層后(約長滿瓶底95%)，以1∶3比例進行消化傳代培養(yǎng)。

A：DAPI染細胞核；B：加入抗FLAG標(biāo)簽的一抗后，加入FITC標(biāo)記的二抗實驗孔，可見熒光位置與DAPI染核部位相符。

圖2免疫熒光研究GCNF的亞細胞定位(×200)

2.4DAPI染色表明BMSCs細胞凋亡明顯增加過表達GCNF 36、48 h后，固定細胞，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察細胞核呈藍色，凋亡細胞細胞核濃縮，核染色明顯變亮，甚至可見細胞核碎裂(見圖4A)，凋亡率見圖4B。

采用了2001-2014年共計14年的MODIS NDVI、降水、氣溫及生態(tài)區(qū)劃數(shù)據(jù)。通過在ENVI中使用最大值合成法(Maximum Synthesis Method,MVC)對14年的NDVI數(shù)據(jù)進行處理，除去如大氣、太陽高度、云層等干擾因素，計算黃土高原14年的NDVI值。降水與氣溫數(shù)據(jù)來自中國氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享服務(wù)網(wǎng)[7]，黃土高原的生態(tài)區(qū)矢量數(shù)據(jù)來自中國生態(tài)系統(tǒng)評估與生態(tài)安全數(shù)據(jù)庫[8]，中國生態(tài)區(qū)的劃分標(biāo)準根據(jù)城市與區(qū)域國家重點實驗室在中國生態(tài)功能區(qū)劃研究的前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并參照國家環(huán)境保護總局發(fā)布的《生態(tài)功能區(qū)劃(暫行)規(guī)程》。

48、72 h實驗組OD值低于對照組，aP<0.05，bP<0.01。

圖3不同時間點MTT實驗所得OD值

A B

A：白色箭頭所指為凋亡的細胞核(×200)；B:可見腺病毒GCNF組的凋亡率高于對照組，且隨時間延長呈擴大趨勢，cP<0.05，dP<0.01。

圖4DAPI染色及凋亡率

2.5Caspase3、Caspase8、Caspase9蛋白活性檢測圖5中可得出BMSCs細胞中過表達GCNF，能夠誘導(dǎo)BMSCs細胞中Caspase3、Caspase8、Caspase9活性增強，說明BMSCs細胞中過表達GCNF能夠激活Caspase3、Caspase8、Caspase9，誘導(dǎo)細胞凋亡，表明Caspase3、Caspase8、Caspase9以有活性的形式在BMSCs細胞凋亡過程中起重要作用。

實驗結(jié)果用3次平行實驗的平均值標(biāo)準差表示，用t檢驗表示組間差距，其中eP<0.05、fP<0.05、gP<0.05。

圖5腺病毒GCNF對BMSCs細胞Caspase3、Caspase8、Caspase9活性的影響

3 討論

生殖細胞核因子(GCNF)又名孤兒核受體NR6A1，無天然配體，主要表達于胚胎及生殖細胞內(nèi)。天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase 3)在細胞凋亡的過程中起關(guān)鍵作用，其以無活性前提存在于細胞質(zhì)中，當(dāng)細胞受到各種刺激或自主凋亡時即可被激活，從而引起細胞的死亡[5]。實驗研究表明，在細胞凋亡過程中，如染色體凝聚和DNA片段化等一些特征性標(biāo)志改變，均與Caspase 3有關(guān)[6]。研究結(jié)果顯示，GCNF腺病毒可使BMSCs細胞Caspase 3活性增強，阻止DNA修復(fù)，導(dǎo)致DNA碎片含量增加，進而促進細胞凋亡。

“不許往那跑,列隊!”張連長攔住一些知青,被攔住的知青不情愿地向倉庫的方向張望著,張連長生氣地吼道:“都聾了嗎?我再說一遍,列隊!”

最后，民法的公序良俗原則也不應(yīng)當(dāng)成為其取得著作權(quán)的消極理由。這是因為，違禁作品對公序良俗的侵犯性往往更為嚴重，而違禁作品依然能取得著作權(quán)，因此根據(jù)“舉重以明輕”的當(dāng)然解釋要求，對公序良俗違反程度相對弱得多的未經(jīng)許可演繹作品，當(dāng)然也不應(yīng)以公序良俗原則作為其著作權(quán)取得的消極條件。

死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑中，Caspase 8通過甲基化、基因突變等形式起到促進細胞凋亡的作用，是凋亡的關(guān)鍵啟動因子。實驗研究表明，在細胞凋亡過程中，依賴一類對天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)的小分子物質(zhì)，而Caspase 8通過寡聚，裂解為17～20 kD和10～12 kD的活化片段，并激活細胞質(zhì)中其他的半胱氨酸蛋白酶，從而產(chǎn)生凋亡效應(yīng)[7-8]。線粒體為細胞提供能源，是細胞中重要的細胞器，稱為動力車間。內(nèi)源或外源刺激細胞的凋亡途徑中，誘導(dǎo)凋亡的信號可以引起線粒體中細胞色素C增加和釋放，從而激活Caspase 9和參與凋亡的其他關(guān)鍵酶。本研究結(jié)果說明過表達BMSCs細胞中生殖細胞核因子，激活了Caspase 8，即而啟動Caspase級聯(lián)發(fā)應(yīng)，使線粒體下游Caspase 9效應(yīng)酶激活，最終誘導(dǎo)細胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，大鼠BMSCs細胞中過表達GCNF可通過活化半胱氨酸蛋白酶(Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9)，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。

[1] Zhang Y L,Akmal K M,Tsuruta J K,et al.Analysis of germ cell nuclear factor transcripts and protein expression during spermatogenesis[J].Biol Reprod,2003,68(10):1621.

[2] Yang H M,Do H J,Kim D K,et al.Transcriptional regulation of human Oct 4 by steroidogenic factor[J].J Cell Biochem,2007,110(5):1198.

[3] Braat A K,Zandbergen M A,de Vries E,et al.Cloning and expression of the zebrafish germ cell nuclear factor[J].Mol Reprod Dev,1999,53(4):369-375.

[4] 萬成,蔣學(xué)俊,張鵬,等.核受體GCNF對H9C2心肌細胞的影響及作用機制[J].2015,36(2):199-203.

[5] 劉明艷,張虹.caspase-3和Fas在上皮性卵巢癌中的表達及相關(guān)性研究[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2007.

[6] Femandez-Ainem Lri T,Litwack G,AlnemriEs.ccp32,a novel human apotosis protein with homology to caehorhabditis elegans cell death proteinced -3 and mamma lian in erlenkin-1 beta-converting enzyme[J].Biol Chem,1994,269(49):30761-30767.

[7] Zhang W,Shi H Y,Zhang M.Maspin overexpression modulates tumor cell apoptosis through the regulation of Bcl-2 family proteins[J].BMC Cancer,2005,5(1):50.

[8] Werner A B,de Vries E,Borst J,et al.Bcl-2 family member Bfl-1/A1 sequesters truncated bid to inhibit is collaboration with pro-apoptotic Bak or Bax[J].J Biol Chem,2002,277(25):22781-22788.

StudyontheapoptosisofbonemarrowmesenchymalstemcellsinducedbyoverexpressionofGCNF

Liu Youbin, Zhang Peng, Liu Zongjun

(DepartmentofCardiovascularMedicine,PutuoHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200062,China)

ObjectiveTo study the effect and mechanism of apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells induced by overexpression of germ cell nuclear factor(GCNF).MethodsGCNF expression was upregulated in BMSCs by overexpression of GCNF adenovirus, and subcellular localization was determined by indirect immunofluorescence technique, cell viability was detected by MTT, and DAPI staining was used to detect cell apoptosis, cell apoptosis protein activity was detected by Caspase3/8/9.ResultsAfter overexpression of GCNF in BMSCs cells, the subcellular localization of GCNF protein was found in the nucleus, the cell viability was decreased and the apoptotic pathway was activated.ConclusionOverexpression of adenovirus GCNF can decrease the activity of BMSCs cells and increase the level of apoptosis.

germ cell nuclear factor; bone marrow mesenchymal stem cells; apoptosis; cysteine protease

上海市醫(yī)學(xué)重點?？平ㄔO(shè)計劃項目-心血管內(nèi)科(ZK2015A17)。

劉宗軍，E-mail：lzj72@163.com。

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10.3969/j.issn.1004-437X.2017.20.001

2017-03-21)