●李妍 羅玥佶 湯婷

HSP60與高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)性研究

●李妍 羅玥佶 湯婷

目的：探討熱激蛋白60在高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的表達機制。方法：4周齡C57BL/6J小鼠隨機分組為正常和高脂飲食組。高脂飲食組給予高脂飲食16周，建立胰島素抵抗小鼠模型。采用Western blot方法檢測HSP60及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子CHOP等蛋白表達。結(jié)果：與正常飲食組比較，高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠體重明顯增加，葡萄糖耐量降低。骨骼肌中HSP60、CHOP、ClpP表達顯著性升高（P＜0.05）。結(jié)論：高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠骨骼肌中HSP60表達水平升高，這可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生有關(guān)。

HSP60；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；高脂飲食；胰島素抵抗

熱休克蛋白60(Heat shock protein 60,HSP60)是一種高水平基礎(chǔ)表達的蛋白之一，作為一種分子伴侶，參與蛋白質(zhì)折疊、裝配及成熟過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞受到刺激后HSP60蛋白表達量明顯提高。在糖尿病患者血清中HSP60水平有顯著改變，可能是一個與炎癥反應(yīng)相關(guān)、參與糖尿病發(fā)生發(fā)展的潛在因素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum, ER）是真核細胞內(nèi)重要的膜性結(jié)構(gòu)細胞器。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中，線粒體的改變也扮演著重要角色，即線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細胞的凋亡之間存在密切關(guān)系。本研究探討熱激蛋白60在高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

SPF級C57BL/6J雄性小鼠4周齡14只，購自湖南斯萊克實驗動物有限公司。小鼠編號后，適應(yīng)喂養(yǎng)3天后隨機分為兩組，對照組7只喂養(yǎng)正常飼料（NC），高脂組7只喂養(yǎng)高脂飼料（HFD）。每周統(tǒng)計體重，喂養(yǎng)16周肥胖模型建立成功后處死小鼠，收集組織標本。

1.2 葡萄糖耐量試驗（GTT）

小鼠禁食12h，斷尾取血測血糖值，按體重2mg/g行50%葡萄糖注射，于15、30、60、90、120分鐘分別測血糖。

1.3 免疫印跡檢測

提取肌肉組織總蛋白，BAC法檢測蛋白濃度，取蛋白質(zhì)樣品10ug，經(jīng)SDS－PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)膜，經(jīng)與一抗HSP60、CHOP、ClpP、XBP1s、XBP1u和二抗溫育，發(fā)光試劑ECL顯色。以目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參條帶吸光度比值作為目蛋白相對表達量。選擇GAPDH為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s ）表示。兩兩比較采用t-檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食增加小鼠體重、降低葡萄糖耐量

與正常組比較，高脂飲食組小鼠在16周喂養(yǎng)后體重明顯上升，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表1。50%葡萄糖注射行葡萄糖耐量試驗，15、30、60、120分鐘測血糖，HFD小鼠血糖水平明顯升高，糖耐量明顯減退，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。高脂飲食誘導(dǎo)、胰島素抵抗動物模型建立成功。

表1 高脂飲食對小鼠體重的影響（g）

表1 高脂飲食對小鼠體重的影響（g）

喂養(yǎng)周數(shù)分組 4 8 12 14 16正常組 23.8±0.6127.75±0.9329.51±1.2229.45±1.99 30.09±2.5高脂組 25.32±1.0932.36±1.3739.04±0.9740.66±2.2142.28±2.17

表2 高脂飲食對小鼠葡萄糖耐量影響（mmol·L-1）

表2 高脂飲食對小鼠葡萄糖耐量影響（mmol·L-1）

15 30 60 120正常組 5.37±0.23 22.74±2.0917.37±2.21 9.97±1.40 7.68±0.53高脂組 10.81±0.4133.06±2.8431.46±2.4828.13±2.2013.33±0.66組別 時間（分鐘）0

2.2 高脂飲食增強HSP60及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的表達

正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)16周后，各組小鼠骨骼肌組織通過免疫印跡實驗檢測HSP60表達，正常對照組HSP60表達比HFD組顯著增加。同時，HFD組小鼠骨骼肌中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)CHOP、ClpP表達水平均比正常組增強，而XBP1s、 XBP1u表達無明顯變化。見圖1。

圖1 高脂飲食小鼠骨骼肌HSP60和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)CHOP、ClpP、XBP1s、XBP1u電泳條帶及相對密度值（?P＜0.05）

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞內(nèi)重要細胞器，在受到外界條件的刺激下引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），適應(yīng)性地抑制蛋白質(zhì)合成、加速蛋白降解等緩解ERS，協(xié)助細胞的自身修復(fù)。HSP60主要存在于真核細胞線粒體中，并被證實與自身免疫性等疾病發(fā)病相關(guān)。在生理狀態(tài)下，HSP60主要通過與凋亡相關(guān)因子的相互作用以及減少線粒體產(chǎn)生氧自由基而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。盡管已有研究表明，肥胖小鼠肝臟中出現(xiàn)氧化應(yīng)激是ERS的開始的主要標志，而后引起線粒體功能異常。體外實驗表明，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可阻止細胞凋亡和肌纖維的分化，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進肌細胞形成。研究還顯示鍛煉加上飲食的改善可提高葡萄糖耐受性受損個體的HSP60和GRP75在肌肉中的表達。在本研究中，長期高脂飲食可明顯增加小鼠體重和降低葡萄糖耐量，小鼠骨骼肌中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物CHOP表達上調(diào)，其相關(guān)蛋白ClpP表達也上調(diào)，而XBP1及其剪切形式變化不明顯?？梢哉J為高脂飲食引起的胰島素抵抗中HSP60與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活有關(guān)系。隨著對HSP60及肥胖糖尿病發(fā)病機制的進一步研究，HSP60可能成為預(yù)測糖尿病早期發(fā)生的一個新指標。

（作者單位：長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

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羅玥佶

湖南省教育廳科研項目（湘財教[2014]85號14C0130;湘財教[2015]54號15C0154）;長沙醫(yī)學(xué)院科研項目（長醫(yī)研[2014]2號-KY201442）