李周娜 陳香儒 金哲虎

133000吉林延吉，延邊大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

4-羥苯基維胺在不同載體中對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡影響

李周娜 陳香儒 金哲虎

133000吉林延吉，延邊大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

目的探討4-羥苯基維胺（4-HPR）在不同載體中對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（HKF）增殖及凋亡的影響。方法采用薄膜-超聲分散法制備4-HPR脂質(zhì)體溶液及4-HPR微泡溶液。用不同濃度（0～80 mg/L）4-HPR脂質(zhì)體溶液作用原代HKF 6～48 h后，噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。將部分HKF分成3組，分別用15 mg/L 4-HPR溶液、4-HPR脂質(zhì)體溶液、4-HPR微泡處理，每組再分成兩個(gè)亞組，一個(gè)亞組在給藥后接受超聲處理，另一亞組不做超聲處理。作用24 h后，噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)HKF的增殖情況。流式細(xì)胞儀檢測(cè)15 mg/L 4-HPR脂質(zhì)體或4-HPR微泡處理24 h后HKF的凋亡情況。結(jié)果成功制備4-HPR脂質(zhì)體溶液及4-HPR微泡溶液。MTT檢測(cè)顯示，4-HPR脂質(zhì)體溶液在1～80 mg/L濃度范圍內(nèi)對(duì)HKF增殖有抑制作用，且增殖抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)（r=0.633，P＜0.01）。超聲處理后4-HPR微泡組與4-HPR溶液及4-HPR脂質(zhì)體組對(duì)HKF的增殖抑制作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。4-HPR脂質(zhì)體組和4-HPR微泡組HKF凋亡率分別為（21.81±3.73）%和（39.79±1.61）%，較對(duì)照組（6.18±0.61）%均顯著增加（均P＜0.01）。結(jié)論成功制備4-HPR微泡，不同載體中4-HPR可促進(jìn)HKF凋亡，進(jìn)而抑制增殖，其中4-HPR微泡結(jié)合超聲抑制作用較4-HPR脂質(zhì)體強(qiáng)。

維甲酸；瘢痕疙瘩；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；4-羥苯基維胺

維A酸類(lèi)藥物對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞（fibroblast，F(xiàn)B）DNA合成具有干擾作用，可抑制成纖維細(xì)胞增殖及膠原代謝［1］。4-羥苯基維胺（4-hydroxyphenyl-retinamide，4-HPR）是人工合成的全反式維A酸文獻(xiàn)顯示，4-HPR對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞有較高的抗腫瘤活性，毒性低于其他維A酸類(lèi)藥物［2］。臨床上瘢痕疙瘩有腫瘤樣生長(zhǎng)的特性，推測(cè)4-HPR也可用于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的治療。但4-HPR水溶性差，直接給藥效果不佳。為了開(kāi)發(fā)一種治療瘢痕疙瘩的納米藥物載體，提高4-HPR的溶解度，我們結(jié)合超聲波技術(shù)，研究4-HPR對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（HKF）增殖及凋亡的作用，為臨床上更好地治療瘢痕疙瘩提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞株：將瘢痕疙瘩原代培養(yǎng)保存于液氮中的HKF（來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）取出，復(fù)蘇，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)90%時(shí)傳代，取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.主要試劑和儀器：流式細(xì)胞儀（FACS Calibur）產(chǎn)自美國(guó)BD公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY92-IIN）產(chǎn)自寧波新芝生物科技股份有限公司；4-HPR產(chǎn)自南京圣賽化工有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒產(chǎn)自上海貝博生物科技有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）、膽固醇、甲醇（HPLC級(jí)）均產(chǎn)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基產(chǎn)自美國(guó)HyClone公司；甲氧基聚乙二醇一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-2000（mPEG-DSPE2000）產(chǎn)自美國(guó) Laysan Bio公司；蛋黃卵磷脂（EPC）產(chǎn)自上海東尚公司。

二、方法

1.藥物配制：

（1）4-HPR 溶液：20 μg 4-HPR 加入 200 μl 0.04%的二甲基亞砜（DMSO）溶解，-20℃長(zhǎng)期保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。

（2）4-HPR脂質(zhì)體：EPC 28 mg、膽固醇2.5 mg、mPEG-DSPE2000 3 mg、4-HPR 3 mg，加入適量氯仿，渦旋、轉(zhuǎn)蒸得到淡黃色膜狀物，加入4 ml去離子水水浴水化，靜置后得到載4-HPR脂質(zhì)體混懸液，水膜過(guò)濾得4-HPR脂質(zhì)體溶液［3］。

（3）4-HPR微泡：取4-HPR脂質(zhì)體溶液1 ml，加入10 μl全氟戊烷，冷水浴內(nèi)超聲60 s，得4-HPR微泡溶液。置于4℃冰箱內(nèi)密封保存，30 d內(nèi)保存過(guò)程中，觀(guān)察外觀(guān)變化。

2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法）：

（1）不同濃度4-HPR脂質(zhì)體溶液對(duì)細(xì)胞增殖的影響：采用MTT比色法檢測(cè)。將HKF以4 000個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，分別向各孔內(nèi)加入4-HPR脂質(zhì)體溶液，使藥物終濃度分別為0、1、2.5、5、10、20、40和80 mg/L，同時(shí)設(shè)空白組（不加細(xì)胞），繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入（避光條件下）5 g/L的MTT溶液 20 μl，置 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育 4 h，加 DMSO 150 μl，振蕩10 min，置酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度（A）。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn)）/（A對(duì)照-A空白）× 100%。

（2）超聲及不同載體中HRP對(duì)細(xì)胞增殖的影響：細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)如同前操作，細(xì)胞分為3組，分別用含15 mg/L 4-HPR溶液、4-HPR脂質(zhì)體溶液和4-HPR微泡的含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，每組再分為2個(gè)亞組，超聲亞組給藥后立即進(jìn)行超聲，另一亞組則不予超聲處理。超聲方法為在培養(yǎng)皿底部涂層超聲耦合劑，利用低強(qiáng)度聚焦超聲儀以頻率3 MHz，功率 1 W/cm2，刺激周期 20%，超聲 30 s［4］。設(shè)對(duì)照組，僅加入細(xì)胞，但不給藥，其他處理同上。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，具體方法同上。

3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：將HKF以1×105個(gè)/孔接種入6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、4-HPR脂質(zhì)體組、4-HPR微泡組：4-HPR脂質(zhì)體組和4-HPR微泡組分別加入15 mg/L 4-HPR脂質(zhì)體和微泡，對(duì)照組則加入含等體積5%葡萄糖的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，加入結(jié)合液400 μl懸浮細(xì)胞，再加入5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素染色液，混勻后4℃避光孵育15 min，再加10 μl碘化丙錠染色液，混勻，4 ℃孵育（避光）5 min后，收集細(xì)胞立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)以Excel記錄，計(jì)量資料用±s表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，細(xì)胞增殖抑制率比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間比較采用Bonferroni法，藥物濃度與細(xì)胞增殖抑制率的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。。

結(jié) 果

一、不同載體藥物形態(tài)學(xué)觀(guān)察

4-HPR脂質(zhì)體溶液及4-HPR微泡溶液在外觀(guān)上未見(jiàn)明顯區(qū)別，均呈現(xiàn)為略帶藍(lán)色乳光的淡黃色澄清液體。在透射電鏡下觀(guān)察4-HPR脂質(zhì)體溶液及4-HPR微泡溶液均呈球形或類(lèi)球形結(jié)構(gòu)，大小均勻、外觀(guān)圓整（圖1）。兩種溶液置于4℃冰箱內(nèi)密封保存，30 d保存過(guò)程中，一直為淡黃色澄清液體，說(shuō)明制備藥物穩(wěn)定性良好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

二、4-HPR脂質(zhì)體溶液對(duì)HKF增殖的影響

1～80 mg/L 4-HPR脂質(zhì)體溶液作用24 h對(duì)HKF增殖有抑制作用，抑制率和藥物濃度呈正相關(guān)（r=1.158，P＜ 0.001）。見(jiàn)圖2。半數(shù)抑制濃度（IC50）估計(jì)值為15.01 mg/L，95%置信區(qū)間為13.10～17.02 mg/L。重復(fù)測(cè)量的方差分析顯示，增加溶液濃度或者延長(zhǎng)作用時(shí)間均能使細(xì)胞增殖抑制率增加（F值分別為5.45、11.26，P值均 ＜ 0.001），并且藥物濃度和作用時(shí)間表現(xiàn)為兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的因素，彼此之間交互作用不顯著（F=0.217，P=0.685）。

三、4-HPR溶液、4-HPR脂質(zhì)體和4-HPR微泡聯(lián)合超聲對(duì)HKF增殖的影響

圖1 透射電鏡觀(guān)察4-HPR脂質(zhì)體（1A）和4-HPR微泡（1B）

圖2 不同濃度4-羥苯基維胺作用不同時(shí)間對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響 2A：增殖抑制率隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)；2B：增殖抑制率隨藥物濃度的變化曲線(xiàn)

在不超聲的情況下，4-HPR溶液對(duì)HKF的抑制作用大于4-HPR微泡和4-HPR脂質(zhì)體，而4-HPR微泡和4-HPR脂質(zhì)體的抑制作用相當(dāng)。超聲處理后，4-HPR微泡對(duì)HKF的抑制率顯著增加（t=9.440，P=0.001），4-HPR溶液和4-HPR脂質(zhì)體的抑制作用也明顯增強(qiáng)；對(duì)照組聯(lián)合超聲對(duì)HKF的增殖抑制率約為10%，見(jiàn)表1。

四、4-HPR對(duì)HKF凋亡的影響

4-HPR脂質(zhì)體組和4-HPR微泡組HKF凋亡率分別為（21.81±3.73）%和（39.79±1.61）%，較對(duì)照組（6.18±0.61）%均顯著增加（t值分別為16.59、52.12，均P＜ 0.01）。見(jiàn)圖3。

討 論

由于4-HPR的水溶性較差，在制備4-HPR脂質(zhì)體的過(guò)程中，載體與藥物的比例要適當(dāng)，使所投的載體能包裹藥物，盡量降低游離藥物的量。本研究選擇氯仿作為溶劑溶解4-HPR、PEG-DSPE和EPC，得到澄清的溶液，未見(jiàn)沉淀，溶解良好，旋蒸后成膜均勻。在4-HPR脂質(zhì)體中加入全氟戊烷超聲后得到4-HPR微泡，穩(wěn)定性增強(qiáng)，全氟戊烷能夠很好地包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部。

表1 各組藥物在有或無(wú)超聲處理時(shí)對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的抑制率（%，±s）

表1 各組藥物在有或無(wú)超聲處理時(shí)對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的抑制率（%，±s）

注：n=5。a：與對(duì)照組比較，P ＜ 0.01；b：與4-HPR溶液組比較，P＜0.05或＜0.01；c：與4-HPR脂質(zhì)體組比較，P＜0.01

分組對(duì)照組4-HPR溶液組4-HPR脂質(zhì)體組4-HPR微泡組F值P值P值＜0.001 0.007 0.036 0.001 t值8.660 5.080 2.550 9.440非超聲處理0 44.00±4.58a 30.33±1.53ab 34.33±5.86ab 25.063＜0.001超聲處理10.00±2.00 59.33±2.52a 34.67±1.52ab 73.00±4.00abc 29.394＜0.001----

圖3 流式細(xì)胞儀觀(guān)察不同載體中4-HPR對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響 3A：對(duì)照組；3B：4-HPR脂質(zhì)體組；3C：4-HPR微泡組

大量研究表明，4-HPR在體外實(shí)驗(yàn)中可引起多種腫瘤細(xì)胞的凋亡［5］。4-HPR主要通過(guò)維A酸受體（RAR）和非RAR途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但具體作用機(jī)理尚未明確，目前認(rèn)為主要是通過(guò)提高活性氧、神經(jīng)酰胺的水平，刺激半胱天冬酶活性增加等機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6］。

本研究顯示，4-HPR對(duì)HKF增殖的抑制作用具有濃度、外界條件依賴(lài)性。在藥物濃度相同的情況下，4-HPR溶液對(duì)HKF的抑制作用明顯強(qiáng)于4-HPR微泡和4-HPR脂質(zhì)體，可能是因?yàn)?-HPR溶液中藥物直接暴露于單層貼壁細(xì)胞，而4-HPR脂質(zhì)體與4-HPR微泡在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)逐漸分解緩慢釋藥，所以作用較4-HPR溶液緩慢。而且，超聲處理后4-HPR溶液組和4-HPR脂質(zhì)體組細(xì)胞抑制率相對(duì)于未經(jīng)超生處理時(shí)有明顯升高，表明超聲波對(duì)藥物的釋放和吸收有促進(jìn)作用；4-HPR微泡組由于超聲的作用，微泡破碎，對(duì)細(xì)胞的抑制作用顯著大于4-HPR溶液組、4-HPR脂質(zhì)體組；對(duì)照組超聲處理后對(duì)細(xì)胞具有一定的增殖抑制，說(shuō)明超聲不僅對(duì)納米粒的釋藥和藥物吸收有促進(jìn)作用，對(duì)HKF的增殖也有抑制作用。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，在同等強(qiáng)度超聲作用下，4-HPR脂質(zhì)體組和4-HPR微泡組HKF凋亡率與對(duì)照組相比均明顯增高，其中4-HPR微泡組最為顯著，說(shuō)明4-HPR微泡聯(lián)合超聲能更有效地誘導(dǎo)HKF凋亡。

綜上，我們認(rèn)為4-HPR可以有效抑制HKF增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，且4-HPR微泡聯(lián)合超聲較4-HPR溶液、4-HPR脂質(zhì)體溶液能更有效地抑制HKF增殖并誘導(dǎo)其凋亡，為臨床上更好地治療瘢痕疙瘩提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of 4-hydroxyphenyl retinamide in different vehicles on the proliferation and apoptosis of human keloid fibroblasts

Li Zhouna,Chen Xiangru,Jin Zhehu
Department of Dermatology,Yanbian University Hospital,Yanji 133000,Jilin,China

Jin Zhehu,Email:jinzh_621@163.com

ObjectiveTo evaluate effects of 4-hydroxyphenyl retinamide（4-HPR）in different vehicles on the proliferation and apoptosis of human keloid fibroblasts（HKFs）.MethodsA filmultrasonic dispersion method was used to prepare 4-HPR liposome solution and 4-HPR microbubbles.Primary HKFs werein vitrotreated with the 4-HPR liposome solution at different concentrations of 0-80 mg/L for 6-48 hours,and the proliferative activity of HKFs was evaluated by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay.Some other HKFs were divided into 3 experimental groups to be treated with 15 mg/L 4-HPR solution（4-HPR solution group）,15 mg/L 4-HPR liposome solution（4-HPR liposome solution group）and 15 mg/L 4-HPR microbubbles（4-HPR microbubble group）,respectively,and each group was divided into ultrasonic-treated and-untreated subgroups.HKFs without treatment served as control group.After 24-hour treatment,MTT assay was conducted to evaluate the proliferative activity of HKFs in the above groups,flow cytometry to detect apoptosis of HKFs in all groups except the 4-HPR solution group.ResultsThe 4-HPR liposome solution and 4-HPR microbubbles were successfully prepared.MTT assay showed inhibitory effects of 4-HPR liposome solution at concentrations of 1-80 mg/L on the proliferation of HKFs,and the proliferation inhibition rate was positively associated with the drug concentrations（r=0.633,P＜ 0.01）.After the ultrasonic treatment,inhibitory effects on the proliferation of HKFs significantly differed among the 4-HPR microbubble group,4-HPR solution group and 4-HPR liposome solution group（P＜ 0.01）.The 4-HPR liposome solution group and the 4-HPR microbubble group both showed significantly increased apoptosis rates（21.81% ±3.73%,39.79% ±1.61%,respectively）compared with the control group（6.18% ± 0.61%,bothP＜ 0.01）.ConclusionThe 4-HPR microbubbles are successfully prepared,and 4-HPR in different vehicles all can promote HKF apoptosis and suppress HKF proliferation,among which,4-HPR microbubbles in combination with ultrasonic treatment have stronger inhibitory effects than the 4-HPR liposome solution.

Tretinoin;Keloid;Fibroblasts;Cell proliferation;4-Hydroxyphenyl-retinamide

金哲虎，Email：jinzh_621@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.010

國(guó)家自然科學(xué)基金（81260233）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目［吉教科合字（2012）第2號(hào)］；吉林省衛(wèi)生廳科研課題（2011Z085）；吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)（2013C034）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81260233）;Science and Technology Research Project of the Education Department of Jilin Province during the 12th Five-Year Plan Period［（2012）2］;Research Foundation of Health Department of Jilin Province of China（2011Z085）;Research and Development Planning Project of Industries and Technology of Jilin Province of China（2013C034）

2016-12-02）

（本文編輯：尚淑賢）