王斌達(dá) 葉指南 唐維國 劉春艷 周琳 續(xù)力云

急性腦梗死患者單核細(xì)胞CD14+CD16+亞型的表達(dá)變化及臨床意義

王斌達(dá) 葉指南 唐維國 劉春艷 周琳 續(xù)力云

目的 探討急性腦梗死患者單核細(xì)胞CD14+CD16+亞型的表達(dá)及其臨床意義。方法 選擇發(fā)?。?4h入院的36例急性腦梗死患者為腦梗死組、同期在神經(jīng)內(nèi)科治療的32例頭暈患者為對照組，檢測腦梗死組患者入院當(dāng)天及第2、5、7～10天以及隨訪第90天，對照組入院當(dāng)天的血清單核細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞各亞型百分比，分析單核細(xì)胞亞型與病情的關(guān)系。 結(jié)果 與對照組相比，腦梗死組經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比各時間點(diǎn)均無明顯變化（均PP＞0.05）；中間型單核細(xì)胞百分比入院當(dāng)天及第2、5、7～10天均明顯升高（均P＜0.05）；非經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比入院第2、5天均明顯下降（均P＜0.05）。腦梗死組入院當(dāng)天單核細(xì)胞計數(shù)與NIHSS評分呈正相關(guān)（r=0.508，P＜0.05）；3個亞型百分比與NIHSS評分均未見相關(guān)（均PP＞0.05）。與未感染者比較，腦梗死感染患者入院第2、5、7～10天單核細(xì)胞計數(shù)均明顯升高（均P＜0.05），非經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比均明顯下降（均P＜0.05）；中間型單核細(xì)胞百分比入院當(dāng)天及第2、5天均明顯升高（均P＜0.05）；經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比各時間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均PP＞0.05）。與預(yù)后良好組比較，腦梗死預(yù)后不良組入院第2、5天單核細(xì)胞計數(shù)、中間型單核細(xì)胞百分比均明顯升高（均P＜0.05），非經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比均明顯下降（均P＜0.05）；經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比各時間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。 結(jié)論 急性腦梗死患者單核細(xì)胞CD14+CD16+亞型變化有一定的規(guī)律，中間型單核細(xì)胞、非經(jīng)典型單核細(xì)胞可能與腦梗死相關(guān)感染及預(yù)后有關(guān)。

單核細(xì)胞 CD14 CD16 腦梗死

炎癥反應(yīng)參與腦梗死的缺血損傷，與腦梗死的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[1-3]。單核細(xì)胞是重要的炎癥反應(yīng)細(xì)胞，在急性腦梗死人群中觀察到單核細(xì)胞上高表達(dá)的人類白細(xì)胞抗原DR位點(diǎn)抗原表達(dá)減少，其分泌的TNF-α減少，這表明單核細(xì)胞活性下降，可能與腦梗死早期階段免疫抑制有關(guān)[4]。目前，人類單核細(xì)胞亞型的劃分主要基于脂多糖受體CD14和IgG Fc段受體CD16的表達(dá)水平[5-6]。在正常人群中，循環(huán)血中80%～90%的單核細(xì)胞表達(dá)CD14++CD16-（經(jīng)典型單核細(xì)胞），約10%的單核細(xì)胞表達(dá)CD14+CD16++（非經(jīng)典型單核細(xì)胞）和CD14++CD16+（中間型單核細(xì)胞）[5,7]。單核細(xì)胞亞型在腦梗死的病理、生理過程中也許具有特定的作用，若其作用機(jī)制能被準(zhǔn)確闡明，它們有可能成為有效的治療靶點(diǎn)。本文就急性腦梗死患者單核細(xì)胞CD14+CD16+亞型的表達(dá)變化及臨床意義作一探討，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇舟山醫(yī)院2014年2月至2015年4月收治的36例急性腦梗死患者（發(fā)?。?4h入院）為研究對象，其中男 20 例，女 16 例；年齡 42～79（69.1±10.1）歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜80歲；發(fā)病時間＜24h；病前改良Rankin量表（mRS）評分≤2分；病后美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分≥3分；符合2014年中國急性腦梗死診治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)頭顱CT或MRI診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院時有發(fā)熱、感染等癥狀（體溫＞37.8℃，WBC＞11×109個/L 或＜4×109個/L）；入院前 3個月曾使用過抗生素、免疫抑制劑、類固醇激素；入院前3個月有腦出血、腦膿腫、短暫性腦缺血發(fā)作、顱內(nèi)手術(shù)及外傷史；既往有血液病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、肝炎、結(jié)核病史；準(zhǔn)備行溶栓者。選擇同期在舟山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科治療的32例頭暈患者進(jìn)行對照，其中男17例，女15例；年齡49～74（68.7±7.8）歲；均經(jīng)頭顱CT或MRI排除急性卒中。兩組患者年齡、性別、吸煙、合并基礎(chǔ)疾病等情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均PP＞0.05），見表 1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 試劑和儀器 FITC標(biāo)記的單克隆抗體CD14（20μl/支，Cat NO.557153）、PEcy5 標(biāo)記的單克隆抗體CD16（20μl/支，Cat NO.561313）、陰性對照 IgG（0.1mg,Cat NO.556651；0.1mg，Cat NO.556652） 和 FACS lysis solution（100ml，Cat NO.349202） 均由美國 BD 公司提供；血液自動分析儀為日本希森美抗公司生產(chǎn)的Sysmex XE-2100型，試劑為該公司供給的配套試劑盒；流式細(xì)胞儀為美國BD FACSCalibur。

1.3 方法

1.3.1 血清檢測 腦梗死組患者入院當(dāng)天（用藥前）及第 2、5、7～10 天的 6∶30～8∶00，隨訪第 90 天分別采集靜脈血，并在30min內(nèi)分離血漿，并保存在-80℃冰箱內(nèi)。對照組患者于入院當(dāng)天采集靜脈血。（1）外周血單核細(xì)胞計數(shù)的測定：采集靜脈血3ml，加入EDTA抗凝管中，由舟山醫(yī)院血常規(guī)室采用日本希森美抗公司Sysmex XE-2100型血液自動分析儀作統(tǒng)一檢測。（2）單核細(xì)胞CD14、CD16的測定：①取2支流式細(xì)胞儀管，均加入已分離出血漿的抗凝血細(xì)胞80μl；在試管1加入陰性對照IgG，在試管2中加入FITC標(biāo)記的CD14、PEcy5標(biāo)記的CD16各4μl；震蕩混勻，保存在4℃暗箱中30min。②加入2ml紅細(xì)胞溶解液，震蕩混勻，靜置于37℃溫水浴中10min中，2 500r/min離心5min，棄上清液，殘留物中加200μl PBS，立即上機(jī)檢測。

1.3.2 評價標(biāo)準(zhǔn) 入院7d內(nèi)，每天記錄NIHSS評分；隨訪期間腦梗死后第90天，記錄NIHSS評分、mRS評分。（1）預(yù)后良好：腦梗死后第90天NIHSS評分0或1分，且mRS評分≤2分。（2）感染：依據(jù)國家衛(wèi)生部關(guān)于醫(yī)院感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。①下呼吸道感染：患者出現(xiàn)

咳嗽、痰黏稠、肺部出現(xiàn)啰音并伴隨下列三項中一項（發(fā)熱、WBC或中性粒細(xì)胞比例增高、X線示有肺部炎癥浸潤性病變）。②尿路感染：患者出現(xiàn)尿路刺激征，或有下腹觸痛、腎區(qū)叩痛伴或不伴發(fā)熱并具有下列情況之一（尿檢白細(xì)胞：男性≥5個/高倍視野，女性≥10個/高倍視野；插導(dǎo)尿管患者結(jié)合尿培養(yǎng)）；臨床已診斷為泌尿道感染，或抗菌治療有效而認(rèn)定的泌尿道感染。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布，用表示，組別比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；組內(nèi)各時點(diǎn)比較采用方差分析。腦梗死組入院當(dāng)天單核細(xì)胞計數(shù)及其亞型與NIHSS評分的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死組基本情況 住院1周內(nèi)，腦梗死組發(fā)生感染9例，占25.0%；包括肺炎8例、泌尿系感染1例。住院期間病死3例；隨訪期間病死3例，失訪4例。

2.2 腦梗死患者入院后不同時點(diǎn)單核細(xì)胞計數(shù)及其亞型的變化及與對照組比較 腦梗死組入院當(dāng)天及第2、5天單核細(xì)胞計數(shù)逐漸增高，之后逐漸恢復(fù)；入院當(dāng)天及第2、5、7～10天與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。腦梗死組入院當(dāng)天及第 2、5、7～10天經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均PP＞0.05）。腦梗死組入院當(dāng)天及第2、5天中間型單核細(xì)胞百分比逐漸增高，第7～10天逐漸恢復(fù)；入院當(dāng)天及第2、5、7～10天與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。腦梗死組入院當(dāng)天及第2、5天非經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比逐漸下降，第5天達(dá)最低值，之后逐漸恢復(fù)；入院第2、5天與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 腦梗死患者入院后不同時點(diǎn)單核細(xì)胞計數(shù)及其亞型的變化及與對照組比較

2.3 腦梗死患者入院當(dāng)天單核細(xì)胞計數(shù)及其亞型與NIHSS評分的關(guān)系 腦梗死組入院當(dāng)天單核細(xì)胞計數(shù)與NIHSS評分呈正相關(guān)（r=0.508，P=0.002），單核細(xì)胞3個亞型百分比與NIHSS評分均無明顯相關(guān)性（經(jīng)典型：r=0.231，P=0.174；中間型：r=0.084，P=0.627；非經(jīng)典型：r=-0.205，P=0.2297），見圖 1。

2.4 感染與未感染腦梗死患者入院后不同時點(diǎn)單核細(xì)胞計數(shù)及其亞型的變化與比較 與未感染者比較，腦梗死感染患者入院第2、5、7～10天單核細(xì)胞計數(shù)均明顯升高，非經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；中間型單核細(xì)胞百分比入院當(dāng)天及第2、5天均明顯升高（均P＜0.05）；經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比各時點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均PP＞0.05），見表3。

2.5 預(yù)后不良與良好腦梗死患者入院后不同時點(diǎn)單核細(xì)胞計數(shù)及其亞型的變化與比較 與預(yù)后良好組比較，腦梗死預(yù)后不良組入院第2、5天單核細(xì)胞計數(shù)、中間型單核細(xì)胞百分比均明顯升高，非經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；經(jīng)典型單核細(xì)胞百分比各時間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表 4。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死早期單核細(xì)胞計數(shù)增高，而后逐漸下降，提示腦梗死后單核細(xì)胞處于激活狀態(tài)，可能與病后下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)激活、刺激骨髓池中幼稚的單核細(xì)胞釋放入外周血有關(guān)[9]。有研究表明經(jīng)典型單核細(xì)胞處于相對低分化的幼稚階段，占外周血單核細(xì)胞總數(shù)的80%～90%；當(dāng)機(jī)體在炎癥免疫反應(yīng)的刺激下，開始表達(dá)CD16并伴有CD14表達(dá)下調(diào)，逐漸轉(zhuǎn)化為中間型單核細(xì)胞，最后成熟后呈現(xiàn)CD16高表達(dá)、CD14低表達(dá)的狀態(tài)，即非經(jīng)典型單核細(xì)胞[10]。本研究中腦梗死患者經(jīng)典型單核細(xì)胞變化不大，可能因為幼稚的經(jīng)典型單核細(xì)胞儲備大，占全部單核細(xì)胞的大部分，致使少量的經(jīng)典型單核細(xì)胞成熟轉(zhuǎn)化后在總體上觀察經(jīng)典型單核細(xì)胞仍無明顯變化。此外，中間型單核細(xì)胞總的趨勢表現(xiàn)為先增高再逐漸恢復(fù)的動態(tài)變化過程，提示機(jī)體在炎癥免疫刺激下會使單核細(xì)胞逐漸分化成熟。而更為成熟的非經(jīng)典型單核細(xì)胞在腦梗死急性期反而下降，原因可能是與其他亞型相比，非經(jīng)典型單核細(xì)胞有更高的遷徙能力，急性應(yīng)激狀態(tài)下能迅速從血管遷徙到損傷組織，導(dǎo)致外周血中非經(jīng)典型單核細(xì)胞不升反而下降[11-12]。

圖1 腦梗死患者入院當(dāng)天單核細(xì)胞計數(shù)及其亞型與NIHSS評分的散點(diǎn)圖

表3 感染與未感染腦梗死患者入院后不同時點(diǎn)單核細(xì)胞計數(shù)及其亞型的變化與比較

表4 腦預(yù)后不良與良好腦梗死患者入院后不同時點(diǎn)單核細(xì)胞計數(shù)及其亞型的變化與比較

研究表明中間型單核細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬活性及抗原提呈作用[13]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等多種慢性炎性疾病進(jìn)展期，中間型單核細(xì)胞明顯升高，且與疾病的進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)腦梗死急性期中間型單核細(xì)胞逐漸升高，可能與急性應(yīng)激狀態(tài)下經(jīng)典型單核細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為中間型單核細(xì)胞有關(guān)。此外，預(yù)后不良的腦梗死患者中間型單核細(xì)胞升高更為明顯，可能由于急性發(fā)病時本身病情重，腦組織損傷范圍廣泛，從而導(dǎo)致中間型單核細(xì)胞反應(yīng)性升高。中間型單核細(xì)胞的升高，進(jìn)一步加重了機(jī)體的炎癥免疫反應(yīng)，增強(qiáng)了單核細(xì)胞對損傷腦組織及細(xì)胞的清除，造成缺血腦組織的二次損傷。Deng等[17]研究發(fā)現(xiàn)中間型單核細(xì)胞可促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，再次對神經(jīng)組織造成毒性損害。因此，尋求阻斷經(jīng)典型單核細(xì)胞向中間型單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的有效方法，可能為腦梗死的治療提供新方向。Kaito等[5]研究發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典型單核細(xì)胞較其他亞型具有更高的遷移能力，在腦梗死早期就能迅速遷移到損傷的炎性組織周圍。本研究顯示入院后出現(xiàn)感染的腦梗死患者非經(jīng)典型單核細(xì)胞明顯減少，可能由于腦梗死后大量的非經(jīng)典型單核細(xì)胞迅速從血管中遷徙到損傷組織，導(dǎo)致機(jī)體免疫防御功能下降，從而使腦梗死患者更容易發(fā)生感染。Auffray等[12]利用感染的大鼠作為模型，發(fā)現(xiàn)與人類非經(jīng)典型單核細(xì)胞同源的大鼠Ly6Clow非經(jīng)典型單核細(xì)胞能在感染的數(shù)小時內(nèi)迅速從血管中遷移到感染組織中。本研究發(fā)現(xiàn)感染的腦梗死患者非經(jīng)典型單核細(xì)胞進(jìn)一步下降，可能由于非經(jīng)典型單核細(xì)胞大量遷移到感染組織所致。

綜上所述，急性腦梗死患者單核細(xì)胞CD14+CD16+亞型變化有一定的規(guī)律，中間型單核細(xì)胞、非經(jīng)典型單核細(xì)胞可能與腦梗死相關(guān)感染及預(yù)后有關(guān)。建議進(jìn)一步研究腦梗死后單核細(xì)胞及其亞型的分子機(jī)制，可能為腦梗死病情預(yù)測及治療提供新策略。

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Changes of monocyte CD14+CD16+subtypes in patients with acute cerebral infarction and its clinical significance

WANG Binda,YE

Zhinan,TANG Weiguo,et al.Department of Neurology,Zhoushan Hospital,Zhoushan 316021,China

Objective To investigate the changesof CD14+CD16+monocytes in patients with acute cerebral infarction and clinical significance. Methods Thirty six patients with acute cerebral infarction admitted within 24 h of onset(study group)and 32 patients with dizziness hospitalizedat the same period(control group)were enrolled in the study.The peripheral monocyte count and the percentage of monocyte subtype in study groupwere determined at 0,2,5,7-10d after admission and 90d in the followed up;those were measure at admission in control group.The correlation between monocyte subtypes and the progression of acute cerebral infarction was analyzed. Results Compared with the control group,the percentage of typical monocytes(CD14++CD16-)showed no significant changes at all time points in cerebral infarction group(PP＞0.05).The percentage of intermediate monocytes(CD14++CD16+)was significantly increased at d0,d2,d5,d7 and d10 after admission(P＜0.05),the percentage of non-typical monocytes(CD14+CD16++)was significantly decreased at d2 and d5(P＜0.05).There was a positive correlation between monocyte count and NIHSS score (r=0.508,P＜0.05)at admission,while no correlation between the subtypes of monocytes and NIHSS scores(PP＞0.05).Compared with non-infected patients,the monocyte count in infected cerebral infarction patients was significantly increased(P＜0.05),the percentage of non-typical monocytes was significantly decreased(P＜0.05),the intermediate monocytes were significantly increased(P＜0.05)at d0,d2 and d5 of admission,while the typical monocytes showed no significant differences at all time points(P＜0.05).Compared with the petients with good prognosis,the monocyte count and the percentage of intermediate monocytes were significantly increased at d2 and d5 in patients with poor prognosis(P＜0.05),and the percentage of non-typical monocytes was significantly decreased(P＜0.05),but the percentage of typical monocytes showedno significant difference at all time points(PP＞0.05). Conclusion The CD14+CD16+monocytes change with the progression of the disease in patients with acute cerebral infarction.The changes of intermediate monocytes and non-typical monocytes may be related to the infection and prognosis of cerebral infarction.

Monocytes CD14 CD16 Cerebral infarction

2016-07-09）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2016-1047

舟山市科技局項目（2014C31067）

316021 舟山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（王斌達(dá)、周琳、劉春艷、唐維國），細(xì)胞分子生物實驗室（續(xù)力云）；臺州市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（葉指南）

續(xù)力云，E-mail：xuliyunhappy@126.com