董曉巧 俞文華 杜權(quán) 王昊 楊定博 沈永鋒 江力 胡強(qiáng) 杜垣鋒 朱強(qiáng) 車志豪 孫承龍 劉群杰 王鼎

●論 著

FTY720對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)功能的作用及機(jī)制

董曉巧 俞文華 杜權(quán) 王昊 楊定博 沈永鋒 江力 胡強(qiáng) 杜垣鋒 朱強(qiáng) 車志豪 孫承龍 劉群杰 王鼎

目的 探討FTY720對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)功能的作用及相關(guān)機(jī)制。方法 將96只大鼠隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組，每組24只，采用枕大池二次注血建立蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型。治療組按1mg/kg腹腔注射FTY720，其他3組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1ml。24h后每組取12只斷頭處死并分離海馬組織，采用Western blot法檢測NF-κB蛋白表達(dá)，采用免疫組化染色法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42蛋白表達(dá)；每組剩余12只大鼠用于神經(jīng)功能評估。結(jié)果 模型組大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達(dá)水平、小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42蛋白表達(dá)水平均較正常組、假手術(shù)組明顯增加（均P＜0.05），治療組較模型組明顯減少（P＜0.05）。前肢放置實(shí)驗(yàn)評分、平衡實(shí)驗(yàn)評分和改良神經(jīng)功能缺損程度評分術(shù)后7、14、21、28d比較，治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05）。結(jié)論 FTY720可改善蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)功能，其作用機(jī)制可能與FTY720的中樞炎癥抑制作用有關(guān)。

FTY720 大鼠 蛛網(wǎng)膜下腔出血 神經(jīng)功能 炎癥反應(yīng) 腦保護(hù)作用

蛛網(wǎng)膜下腔出血誘發(fā)的免疫反應(yīng)可繼發(fā)腦損傷，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1-2]。FTY720是一種新型的免疫抑制劑，系冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-I作結(jié)構(gòu)改造而成，對人體的免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，即在體內(nèi)抑制免疫反應(yīng)發(fā)生的同時，又不破壞機(jī)體對病毒的免疫應(yīng)答及免疫記憶能力，不良反應(yīng)少，生物利用度高[3]。因此，目前FTY720廣泛用于多發(fā)性硬化癥、器官移植等免疫性疾病的治療，它有望成為新一代免疫抑制劑[4-7]。本研究通過建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型并腹腔注射FTY720，觀察其對大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用，并檢測海馬組織炎癥因子（NF-κB、OX-42）的變化，以探討這一作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 FTY720（批號：SML0700；規(guī)格：25mg）購自美國Sigma公司；二辛可寧酸法（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：23229）購自美國Thermo Scientific公司；Tris 0.9%氯化鈉溶液和吐溫20緩沖液（TBST，批號：117087）均購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（批號：K820-50）購自武漢艾美捷科技有限公司；卵白素-生物素-酶復(fù)合物染色（ABC）復(fù)合物抗體（批號：PK-6100）購自上海翊圣生物科技有限公

司；轉(zhuǎn)印槽（型號：Trans-Blot）購自美國Biorad公司；電泳儀（型號：EPS-200）購自上海天能科技有限公司；小型垂直電泳槽（型號：164-8001）購自美國Biorad公司；脫色搖床（型號：TY-80B）購自常州澳華儀器有限公司；生物倒置顯微鏡（型號：IX-71）購自中國奧林巴斯有限公司；低溫高速離心機(jī)（型號：BECKMAN）購自北京普瑞麥迪實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；熒光分光光度儀（型號：UV-1202）購自日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及造模 將96只健康Wistar大鼠（雄性，清潔級，由南京大學(xué)模式動物研究所提供）隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組，每組24只。按50mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，采用Roux等[8]建立的枕大池二次注血法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型，假手術(shù)組兩次注入等量0.9%氯化鈉溶液。治療組大鼠模型形成前0.5h按1mg/kg腹腔注射FTY720，其他3組大鼠均予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1ml。24h后每組取12只大鼠，按80mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉，斷頭處死，分離海馬組織；每組剩余12只大鼠用于神經(jīng)功能評估。正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組24h分別死亡0、2、4和3只，4組大鼠死亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PP＞0.05）；大鼠死亡后補(bǔ)充成活大鼠，以保證每組24只大鼠。

1.2.2 Western blot檢測NF-κB蛋白表達(dá)水平 取部分海馬組織按1∶10（密度∶體積）加入細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，13 000g離心20min，收集上清液；采用BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白（50μg）經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1h；加入相應(yīng)兔抗大鼠 NF-κB 單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫?fù)u床孵育 1h，TBST 洗膜 3 次；ECL試劑作用5min，X線膠片曝光。沖洗并掃描后結(jié)果用Quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以GAPDH水平為內(nèi)對照，計(jì)算相對灰度值，即NF-κB蛋白表達(dá)水平。1.2.3 免疫組化染色法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42蛋白表達(dá) 取部分海馬組織，采用ABC法進(jìn)行OX-42免疫組化染色。按常規(guī)方法將海馬組織制作蠟塊，切片，貼片，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；依次加入0.3%過氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01mol PBS 100ml＋30%過氧化氫）、0.3%Triton X-100（0.3ml Triton X-100＋0.01mol PBS 100ml）、血清稀釋液（牛血清白蛋白 1g＋0.01mol PBS 100ml＋疊氮鈉 0.08g）稀釋的一抗、0.01mol PBS稀釋的的二抗和ABC復(fù)合物抗體，每次予以0.01mol PBS清洗，最后蒸餾水迅速沖洗，加入顯色液，進(jìn)行免疫組化顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，透明，封片，拍照。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞立體測量計(jì)數(shù)，以正常組計(jì)數(shù)細(xì)胞值100為對照，計(jì)算相對表達(dá)值，即小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 動物行為測試 參照Kawamata等[9]的前肢放置試驗(yàn)和平衡試驗(yàn)方法，在術(shù)后 1、3、7、14、21、28d 對大鼠進(jìn)行前肢放置試驗(yàn)和平衡試驗(yàn)評分測定，前肢放置試驗(yàn)得分0～10分，平衡試驗(yàn)得分1～7分；得分越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.2.5 改良神經(jīng)功能缺損程度評分測定 參考Chen等[10]的方法，在術(shù)后 1、3、7、14、21、28d 對大鼠進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺損程度評分測定，包括運(yùn)動、感覺、反射和平衡試驗(yàn)，得分0～18分；得分越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTY720對NF-κB蛋白表達(dá)的影響 正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達(dá) 水 平 分 別 為 100.0±5.2、102.2±7.0、263.8±21.9 和171.6±21.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中正常組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PP＞0.05），模型組較正常組、假手術(shù)組均明顯增加（均P＜0.05），治療組較模型組明顯減少（P＜0.05），見圖1-2。

圖1 4組大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達(dá)的電泳圖

圖2 4組大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達(dá)水平的比較

2.2 FTY720對小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42蛋白表達(dá)的影響 正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42 蛋白表達(dá)水平為 100.0±15.5、98.6±15.4、299.2±36.9和192.1±30.8，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中正常組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PP＞0.05），模型組較正常組、假手術(shù)組均明顯增加（均P＜0.05），治療組較模型組明顯減少（P＜0.05），見圖3-4。

圖3 4組大鼠海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42免疫組化染色結(jié)果（×20）

圖4 4組大鼠海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42蛋白表達(dá)的比較

2.3 FTY720對大鼠運(yùn)動功能的影響 正常組、假手術(shù)組大鼠前肢放置試驗(yàn)評分均為0分（最低分），平衡實(shí)驗(yàn)評分均為1分（最低分）。因此對模型組與治療組前肢放置試驗(yàn)評分、平衡實(shí)驗(yàn)評分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1、3d差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P ＞0.05）；術(shù)后 7、14、21、28d，治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05），見表1。

2.4 FTY720對大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分的影響 正常組、假手術(shù)組大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評分均為0分（最低分）。因此對模型組與治療組改良神經(jīng)功能缺損程度評分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1、3d差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P ＞0.05）；術(shù)后 7、14、21、28d，治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05），見表2。

FTY720是一種新型的免疫抑制劑，將冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-I進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而成，屬于鞘氨醇-1-磷酸鹽受體阻滯劑[5]。FTY720在

表1 模型組與治療組大鼠術(shù)后各時點(diǎn)運(yùn)動功能的比較（分）

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是腦動脈瘤破裂最常見的表現(xiàn)，出血導(dǎo)致的早期腦損傷會影響患者的預(yù)后[9-10]。免疫反應(yīng)是繼發(fā)性腦損傷病理生理機(jī)制的重要組成部分，也參與蛛網(wǎng)膜下腔出血繼發(fā)的早期腦損傷過程；腦組織局部免疫反應(yīng)增強(qiáng)會加重腦組織的繼發(fā)性腦損傷[1-2]，為臨床應(yīng)用免疫抑制劑治療蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但臨床常規(guī)免疫抑制劑可導(dǎo)致全身免疫功能降低，繼發(fā)感染。因此，尋找一種安全有效的免疫抑制劑對于降低蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷具有重要意義。體外以無活性的形式存在，在體內(nèi)經(jīng)鞘氨醇激酶2磷酸化為具有生物活性的（S）-FTY720-P異構(gòu)體而發(fā)揮作用。FTY720主要用于抑制器官移植所引起的排斥反應(yīng)，還可以用于治療皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂或障礙疾病以及某些轉(zhuǎn)移性癌癥[3-7]。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)扮演炎癥細(xì)胞的角色。當(dāng)腦組織受到外傷、缺血及缺氧等損害時，小膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍，包括NF-κB在內(nèi)的諸多NF表達(dá)上調(diào)；通過不同信號途徑與DNA結(jié)合，使IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子分泌增加，進(jìn)而損傷神經(jīng)細(xì)胞，影響神經(jīng)功能[11-13]。OX-42是小膠質(zhì)細(xì)胞特異性的表達(dá)蛋白，OX-42表達(dá)能反映小膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍程度，也能間接反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的程度[14]。目前動物實(shí)驗(yàn)選擇1mg/kg FTY720腹腔或靜脈注射治療腦損傷[16-17]。本研究結(jié)果顯示大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后海馬組織NF-κB、小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42蛋白表達(dá)均明顯增加，給予FTY720處理后出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，提示FTY720可降低蛛網(wǎng)膜下腔出血后的炎癥反應(yīng)。既往研究表明FTY720可抑制體外培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎性因子釋放[15]，阻止腦外傷大鼠外傷皮層炎性細(xì)胞的聚集[16]，抑制動物腦出血后腦內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤[17]；以上研究結(jié)果均說明FTY720對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)具有明顯抑制作用。

表2 模型組與治療組大鼠術(shù)后各時點(diǎn)改良神經(jīng)功能缺損程度評分的比較（分）

目前關(guān)于FTY720改善腦損傷功能的研究較少。為評價FTY720對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)功能的影響，本研究采用前肢放置實(shí)驗(yàn)、平衡實(shí)驗(yàn)和改良神經(jīng)功能缺損程度評分，以綜合反映蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠的運(yùn)動、感覺及協(xié)調(diào)功能。研究結(jié)果提示FTY720可明顯降低蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠前肢放置實(shí)驗(yàn)、平衡實(shí)驗(yàn)和改良神經(jīng)功能缺損程度評分。既往研究表明FTY720能有效抑制短暫性腦缺血導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)細(xì)胞死亡[18]，降低腦出血大鼠腦水腫并改善腦功能[19]。因此，筆者推測FTY720可能通過抑制腦炎癥反應(yīng)，改善蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)功能障礙；但本研究未深入分析FTY720治療大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血的藥物劑量與療效的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

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Effect of FTY720 on neurological function in rats with subarachnoid hemorrhage and related mechanism

DONG Xiaoqiao,YU

Wenhua,DU Quan,et al.Department of Neurosurgery,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the effect of FTY720 on neurological function in rats with subarachnoid hemorrhage(SAH)and the related mechanism. Methods A total of 96 rats were randomly assigned to normal group,sham-operation group,model group and treatment group with 24 rats in each group.The rat SAH model was established via autologous blood injection into cisterna magna.Rats in treatment group were given intraperitoneally with 1mg/kg FTY720.Rats in other three groups were given intraperitoneal injection of 1ml normal saline.After 24 hours,12 rats in each group were sacrificed by decapitation and their hippocampus tissue samples were collected.Western blot was used to determine the expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB).Immunohistochemistry was utilized to investigate the microglial OX-42 expression.Other 12 rats in each group experienced neurological function assessment. Results The relative expressions of NF-κB and microglial OX-42 in the hippocampus tissues were significantly higher in model group than those in normal group and sham-operation group (allP＜0.05),also higher than those in treatment group(allP＜0.05).Forelimb-placement test,balance test and modified neurological severity scores at d 7,14,21 and 28 postoperatively in treatment group were all significantly lower than those in model group(allP＜0.05). Conclusion FTY720 can markedly improve the neurological function of rats with SAH,which may be related to the inhibition of inflammation in central nervous system.

FTY720 RatSubarachnoid hemorrhage Neurologicalfunction Inflammation Cerebralprotective effect

2016-09-08）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2016-1373

浙江省實(shí)驗(yàn)動物科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C37082）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院（南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院）神經(jīng)外科

董曉巧，E-mail：dxqhyy@163.com