朱蘭平，莊 歡，余 妹

HPLC波長切換法同時(shí)測定參芪膏中6個(gè)主要成分的含量

朱蘭平1，莊 歡2，余 妹3

目的建立HPLC波長切換法同時(shí)測定參芪膏中黨參炔苷、丁香苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量。方法采用Zorbax XDB-C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5.0 μm)，以乙腈-甲醇(9∶1)(A)-0.1%甲酸溶液(B)為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，流速0.9 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長：266 nm(黨參炔苷、丁香苷)、254 nm(毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素)。結(jié)果黨參炔苷、丁香苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素6個(gè)成分分別在15.49～309.80、2.15～43.00、5.66～113.20、4.89～97.80、3.28～65.60、12.06～241.20 μg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7、0.999 2、0.999 5、0.999 3、0.999 6、0.999 9；平均加樣回收率及相應(yīng)的RSD分別為98.07% (0.61%)、99.09% (1.53%)、99.44% (1.33%)、97.86% (1.28%)、99.95% (1.04%)、97.19% (0.58%)。結(jié)論所建立的方法快速，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，專屬性好，為參芪膏的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

參芪膏；黨參炔苷；丁香苷；毛蕊異黃酮苷；芒柄花苷；毛蕊異黃酮；芒柄花素；波長切換法；多組分測定

0 引言

參芪膏為黨參、黃芪2味中藥材加工而成的煎膏劑，收載于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第17冊。該制劑的標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了性狀和黃芪薄層色譜鑒別，未對成分進(jìn)行定量測定[1]，且目前尚無關(guān)于該制劑多組分定量測定的文獻(xiàn)報(bào)道。本文建立了一種較為簡便的HPLC波長切換法，對參芪膏中2味中藥材中的6種指標(biāo)性成分(黨參中的黨參炔苷和丁香苷，黃芪中的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素)的含量進(jìn)行了測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 系列四元梯度泵高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；分析天平(十萬分之一，賽多利斯)；超聲波清洗機(jī)(SB-5200DTN型，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試劑與試藥 黨參炔苷對照品(批號：111732-201206，含量100.0%)、丁香苷對照品(批號：111574-201504，含量94.9%)、毛蕊異黃酮苷對照品(批號：111920-201505，含量97.1%)、芒柄花素對照品(批號：111703-201504，含量100.0%)來源于中國食品藥品檢定研究院；芒柄花苷對照品(批號：486-62-4，含量98.0%)來源于上海樊克生物科技有限公司；毛蕊異黃酮對照品(批號：20575-57-9，含量98.0%)來源于上海純優(yōu)生物科技有限公司；參芪膏(每瓶裝300 g，批號：d15070012、16030002、16040007)來源于太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司。乙腈和甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，甲酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 分別精密稱取各對照品適量，用甲醇分別溶解并稀釋制成含黨參炔苷、丁香苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素各3.098、0.430、1.132、0.978、0.656、2.412 mg/mL單一成分的對照品儲備液；再精密吸取適量，用甲醇稀釋成濃度為0.154 9、0.008 6、0.056 6、0.048 9、0.032 8、0.120 6 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取參芪膏約3.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲提取40 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，振搖均勻，過濾，取續(xù)濾液，即得參芪膏供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液 按《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第17冊參芪膏[1]質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方和生產(chǎn)工藝，分別制備不含黨參的陰性樣品和不含黃芪的陰性樣品，再按照上述方法制備各陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 采用Zorbax XDB-C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5.0 μm)；流動相A：乙腈-甲醇(9∶1)，流動相B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脫[2-5](0～9 min，16.0%A；9～15 min，16.0%A→28.0%A；15～30 min，28.0%A→55.0%A；30～35 min，55.0%A→16.0%A)；0～15 min時(shí)在266 nm[6]波長下檢測黨參炔苷和丁香苷，15～35 min時(shí)在254 nm[7-8]波長下檢測毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素；流速：0.9 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取“2.1”項(xiàng)下制備的4種溶液各適量，依法檢測，結(jié)果顯示，各陰性樣品溶液的色譜圖中，在混合對照品溶液和供試品溶液所測黨參炔苷、丁香苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素6個(gè)成分對應(yīng)的位置無干擾，理論塔板數(shù)均>3 500。色譜圖見圖1。

2.4 線性范圍考察 分別精密吸取對照品儲備溶液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別用甲醇稀釋至20 mL，振搖均勻，即得到6個(gè)系列濃度的混合對照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，分別以各成分質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)、峰面積A為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，如表1所示。

2.5 精密度試驗(yàn) 取上述混合對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，測定峰面積，結(jié)果黨參炔苷、丁香苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD(n=6)分別為 0.77%、1.35%、1.01%、1.06%、1.13%、0.93%。

圖1 樣品(A)、對照品(B)、黨參陰性(C)、黃芪陰性(D)色譜圖

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取參芪膏樣品(批號：15070012) 6份，按“2.1.2”的方法制備供試品溶液，依法測定，分別計(jì)算黨參炔苷、丁香苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量及RSD，結(jié)果各組分的含量依次為1.513、0.065、0.517、0.381、0.295、1.179 mg/g，RSD依次為1.32%、1.04%、1.63%、1.49%、0.56%、1.24%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號：15070012)，在室溫下放置0、2、4、6、8、12、18、24 h后進(jìn)樣測定，依法測定黨參炔苷、丁香苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的峰面積值，其RSD分別為0.88%、1.23%、1.11%、1.04%、1.03%、0.97%。結(jié)果表明，參芪膏供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取各對照品，用甲醇分別溶解并稀釋制成含黨參炔苷、丁香苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素為0.451、0.197、0.389、0.286、0.221、0.355 mg/mL的對照品溶液，備用。取批號為15070012的參芪膏6份，每份約1.5 g，精密稱定后，置于25 mL的量瓶中，精密加入上述備用對照品溶液各5.0、0.5、2.0、2.0、2.0、5.0 mL，再加甲醇適量，超聲提取40 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得參芪膏加樣回收樣品試液，依法測定，計(jì)算6種成分的回收率及RSD，結(jié)果見表2。

2.9 參芪膏樣品測定 取3批參芪膏，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按“2.2” 項(xiàng)下色譜條件測定黨參炔苷、丁香苷、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量，見表3。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

表3 含量測定結(jié)果[含量mg/g，RSD(%)]

3 討論

3.1 樣品處理方法的考察 在供試品溶液制備實(shí)驗(yàn)過程中，筆者考察了參芪膏供試品制備用不同的提取溶劑(乙醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇)和不同提取時(shí)間(20、40、60 min)對參芪膏所測成分的影響，以所測各成分的提取率為指標(biāo)，優(yōu)選最佳的樣品處理方法。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，采用甲醇提取40 min和甲醇提取60 min，所測各成分提取率相當(dāng)，考慮到操作的便捷性，最終優(yōu)選參芪膏供試品溶液制備的溶劑和時(shí)間為甲醇提取40 min。

3.2 流動相的考察 在實(shí)驗(yàn)中，對梯度洗脫用流動相體系進(jìn)行了對比考察，選取甲醇-水流動相體系、乙腈-水流動相體系[2]、乙腈-甲醇-水流動相體系[3]分別進(jìn)行試驗(yàn)，以所測6種成分的分離效果及峰形等為指標(biāo)，結(jié)果表明乙腈-甲醇-水流動相體系優(yōu)于甲醇-水流動相體系和乙腈-水流動相體系，但毛蕊異黃酮的分離度欠佳，在此基礎(chǔ)上，又分別考察了乙腈-甲醇(9∶1)-0.1%甲酸溶液、乙腈-甲醇(9∶1)-0.1%磷酸溶液流動相體系，結(jié)果表明，以乙腈-甲醇(9∶1)-0.1%甲酸溶液按照文中規(guī)定的梯度洗脫程序作為流動相時(shí)，所測各成分均能有效分離，峰形對稱，基線較平穩(wěn)。故優(yōu)選乙腈-甲醇(9∶1)-0.1%甲酸溶液為流動相體系。

3.3 暫定含量限度的確定 根據(jù)本文所測各成分含量平均值約為80%，暫定本品每1 g含黨參以黨參炔苷計(jì)，不得低于1.2 mg，以丁香苷計(jì)，不得低于0.05 mg；含黃芪以毛蕊異黃酮苷計(jì)，不得低于0.4 mg，以芒柄花苷計(jì)，不得低于0.3 mg，以毛蕊異黃酮計(jì)，不得低于0.2 mg，以芒柄花素計(jì)，不得低于0.9 mg。

4 結(jié)論

高效液相波長轉(zhuǎn)換法同時(shí)測定參芪膏中6種主要成分，專屬性強(qiáng)、操作簡便，樣品溶液穩(wěn)定性好，對參芪膏的質(zhì)量控制及臨床安全應(yīng)用有重要意義。

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Simultaneousdeterminationof6componentsinShenqiGaobyHPLCwavelengthswitchingmethod

ZHU Lan-ping1,ZHUANG Huan2,YU Mei3

(1.Department of Pharmacy,Tinglin Hospital of Shanghai Jinshan District,Shanghai 210505,China;2.Market Supervision and Administration of Shanghai Jinshan District,Shanghai 200540,China;3.Nanqiao Community Health Service Center of Shanghai Fengxian District,Shanghai 201499,China)

ObjectiveTo develop an HPLC wavelength switching method for simultaneous determination of the content of lobetyolin,syringin,calycosin7-O-β-D-glucopyranoside,ononin,calycosin and formononetin in Shenqi Gao.MethodsThe Zorbax XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm) chromatographic column was adopted;the mobile phase consisted of acetonitrile-methanol (9∶1) (A)-0.1% formic acid solution (B) with gradient elution at a flow rate of 0.9 mL/min;the column temperature was set at 30 ℃;the sample quantity was 10 μL.The wavelength was set at 266 nm (lobetyolin and syringin) and 254 nm (calycosin7-O-β-D-glucopyranoside,ononin,calycosin and formononetin).ResultsLobetyolin,syringin,calycosin7-O-β-D-glucopyranoside,ononin,calycosin and formononetin had good linearity within the range of 15.49～309.80 (r=0.999 7),2.15～43.00 (r=0.999 2),5.66～113.20 (r=0.999 5),4.89～97.80 (r=0.999 3),3.28～65.60 (r=0.999 6) and 12.06～241.20 μg/mL (r=0.999 9),respectively.The average recoveries and the correspondingRSDwere 98.07% (0.61%),99.09% (1.53%),99.44% (1.33%),97.86% (1.28%),99.95% (1.04%) and 97.19% (0.58%),respectively.ConclusionThe established method is rapid with high sensitivity,accuracy and specificity,which can be applied to the quality control of Shenqi Gao.

Shenqi Gao;Lobetyolin;Syringin;Calycosin7-O-β-D-glucopyranoside;Ononin;Calycosin;Formononetin;Wavelength switching method;Multicomponent determination

2017-02-14

1.上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院藥劑科，上海 201505；2.上海市金山區(qū)市場監(jiān)督管理局，上海 200540；3.上海市奉賢區(qū)南橋鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 201499

10.14053/j.cnki.ppcr.201710022