陳 媛 尚麗麗 楊錦玲 李改云 殷亞方 戴好富

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所 北京 100091； 2.中國林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所 北京 100091； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 ?？?571101)

野生沉香的鑒別方法*

陳 媛1,2尚麗麗2楊錦玲3李改云1,2殷亞方2戴好富3

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所 北京 100091； 2.中國林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所 北京 100091； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 海口 571101)

【目的】 建立有效、準(zhǔn)確、科學(xué)的野生沉香鑒別技術(shù)，為沉香的鑒定和品質(zhì)評價體系建立提供參考依據(jù)?！痉椒ā?采用醇溶性浸出物含量、顯色反應(yīng)、薄層色譜分析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)方法，對10批次野生沉香進(jìn)行鑒別。【結(jié)果】 10批次野生沉香的醇溶性浸出物含量整體較高，明顯大于《中華人民共和國藥典》(2015年版)規(guī)定的10.0%； 野生沉香的顯色反應(yīng)除呈現(xiàn)人工沉香的櫻紅色或淺櫻紅外，還出現(xiàn)紫堇色、淺紅色和淺紫色在內(nèi)的多樣性顯色，可輔助鑒別野生沉香； 薄層色譜操作簡單，節(jié)省材料，且野生沉香樣品在薄層鑒別中呈現(xiàn)清晰的熒光斑點和較好的分離效果，對于大部分野生沉香樣品可通過薄層色譜進(jìn)行基礎(chǔ)鑒別； 通過相似度評價、峰面積比較，建立10批次野生沉香的HPLC指紋圖譜，并確定9個野生沉香共有特征峰，確定野生和人工沉香HPLC特征指紋圖譜的差異性。【結(jié)論】 基于各方法的優(yōu)勢及精準(zhǔn)程度，本文提出在顯微鑒別的基礎(chǔ)上，通過醇溶性浸出物含量、顯色反應(yīng)、薄層色譜分析和HPLC的指紋圖譜及特征峰鑒別野生沉香，可為沉香品質(zhì)評價體系建立提供參考。

野生沉香； 鑒別方法； 高效液相色譜； 指紋圖譜； 共有特征峰

沉香是瑞香科(Thymelaeaceae)白木香屬(Aquilaria)樹木在自然生長過程中形成的由木質(zhì)部組織及其分泌物共同組成的混合物質(zhì)(殷亞方， 2014)。在我國，白木香又名沉香樹、土沉香，主要分布在廣東、廣西、海南、云南、臺灣等地，其產(chǎn)生的樹脂被稱為國產(chǎn)沉香。沉香既是一種珍貴的香料，位列“沉檀龍麝”四大香料之首，又是一種名貴的中藥，具有悠久的入藥歷史。而且，沉香還用于工藝品和文化收藏等多個領(lǐng)域，其作為一種珍貴的林產(chǎn)品(傅立國， 1992)，得到了林業(yè)行業(yè)、香料行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)和文化收藏界的普遍重視。

沉香的形成具有特殊性，白木香樹只有在受到火燒、雷劈、蟲蛀、刀砍等損害后才能分泌樹脂(李戈等， 2009)，并沉積于木質(zhì)中，樹齡越長，樹脂沉積越久，沉香的品質(zhì)越高(田耀華等， 2009)。目前市場上主要有人工沉香和野生沉香2大類： 野生沉香是指在生長過程中沒有受到人為干預(yù)且經(jīng)較長時間自然形成的沉香； 人工沉香是采用物理法、化學(xué)法和生物法等結(jié)香方式使白木香樹木在較短時間內(nèi)形成的沉香(黃俊卿等， 2013； 梅文莉等， 2013a)。隨著人們對天然沉香的大量采挖，野生沉香資源逐漸枯竭，使得供求矛盾更加突出，野生沉香價格高漲。為滿足人們對沉香的需求，大量的人工沉香出現(xiàn)。然而，人工沉香結(jié)香時間較短，多為9～12個月，其品質(zhì)遠(yuǎn)低于野生沉香，市場價格也與野生沉香有巨大差距。在野生沉香價格利益的驅(qū)使下，市場上出現(xiàn)了很多假冒偽劣的野生沉香，利用人工沉香以次充好的現(xiàn)象愈加嚴(yán)重。因此，采用科學(xué)的方法鑒別野生沉香，對于沉香行業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

目前，國內(nèi)還沒有關(guān)于沉香的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，而作為藥用沉香的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要是《中華人民共和國藥典》(2015年版)(以下簡稱《藥典》)。該標(biāo)準(zhǔn)從外觀形狀、橫切面顯微結(jié)構(gòu)、醇溶性浸出物含量、顯色反應(yīng)、薄層色譜以及高效液相色譜等方面對其進(jìn)行鑒別，其中醇溶性浸出物含量為主要的評價標(biāo)準(zhǔn)。然而，《藥典》多用于人工種植沉香的鑒別，對于野生沉香的鑒別并不完全適用。除此之外，還有報道使用光譜法(李鳳琴等， 1994)、氣質(zhì)連用法(鐘建理等， 2010； Gaoetal., 2014)、近紅外光譜法(張妤琳等， 2011)等對沉香進(jìn)行鑒別。部分文獻(xiàn)報道通過GC-MS方法鑒別倍半萜及芳香族化合物成分(陳曉穎等， 2012； 林峰等， 2010a; 2010b； 梅文莉等， 2013b； Wetwitayaklungetal., 2009)來評價沉香的質(zhì)量品質(zhì)； 還有少量文獻(xiàn)報道利用HPLC檢測沉香樣品中的2-(2-苯乙基)色酮類、四氫色原酮類化合物(陳亞等， 2007； 楊錦玲等， 2014； 張倩等， 2015； Chenetal., 2012)等。依據(jù)以上方法雖可有效地鑒別沉香真?zhèn)?，但卻很少能將野生沉香加以分離鑒定。因此，針對沉香市場供求矛盾突出的現(xiàn)狀，科學(xué)防范造假沉香和以次充好的現(xiàn)象，完善野生沉香化學(xué)成分圖譜，建立有效的沉香質(zhì)量評價體系意義重大。

本文通過對10批次野生沉香的醇溶性浸出物含量、顯色反應(yīng)、薄層色譜和HPLC指紋圖譜進(jìn)行測定，建立野生沉香的HPLC指紋圖譜，結(jié)合相似度評價和峰面積，得到野生沉香特征圖譜和共有特征峰，構(gòu)建有效、準(zhǔn)確、科學(xué)的野生沉香鑒別技術(shù)，以期為沉香的鑒定和品質(zhì)評價體系建立提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品材料

對照樣品(CK)購自中國食品藥品檢定研究院。10批次野生沉香(編號為W1-W10)經(jīng)中國林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所鑒定，均為瑞香科植物白木香。樣品取樣地包括柬埔寨、越南、印度尼西亞、老撾、菲律賓、馬來西亞、中國海南等地，具體產(chǎn)地信息見表1。

表1 野生沉香樣品信息Tab.1 The wild agarwood sample information

1.2儀器和試劑

儀器設(shè)備： 粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司制造，50 g手提式高速萬能粉碎機(jī)， DFT-50A型)； 真空烘箱； 篩網(wǎng)(2號篩，篩孔內(nèi)徑850±29 μm)； 萬分之一天平(德國Sartorius公司R2000型)； 超聲波清洗器(南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司)； 島津高效液相色譜儀(包括高壓二元泵、DAD檢測器、柱溫箱、自動進(jìn)樣器、工作站)； 點樣器； 薄層色譜掃描儀。試劑： 五氧化二磷干燥劑；屈臣氏超純水；色譜級乙腈(美國Fisher公司)；三氯甲烷-丙酮；無水乙醇；鹽酸；香草醛；甲酸(分析純)；薄層板。

1.3樣品制備及干燥

采集約4 g樣品，去除表面腐銹，粉碎至全部通過2號篩。將加入五氧化二磷干燥劑的培養(yǎng)皿放入直徑真空烘箱中，粉碎的樣品放入稱量瓶中，打開瓶蓋，放入真空烘箱中，減壓至2.67 kPa以下持續(xù)24 h，得到干燥后的樣品。

1.4醇溶性浸出物含量、顯色反應(yīng)及薄層色譜測定

醇溶性浸出物含量、顯色反應(yīng)以及薄層色譜測定依據(jù)《藥典》中對沉香的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.5高效液相色譜測定

HPLC制樣依據(jù)《藥典》中對沉香的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

HPLC色譜條件： 色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)； 乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為32 ℃，流速為0.7 mL·min-1，檢測波長為252 nm，梯度洗脫程序： 0～10 min，15%～20%A； 10～19 min, 20%～23%A； 19～21 min，23%～33%A； 21～39 min，33%A； 39～40 min，33%～35%A； 40～50 min，35%A； 50～60 min，95%A。

2 結(jié)果與分析

2.1表觀性狀

如圖1所示，在整體形貌上，野生沉香不同于人工沉香。人工沉香多呈規(guī)整的薄木片或塊狀，有明顯的人工受傷痕跡(如火鉆、打洞等)，木質(zhì)較多且木紋粗糙； 而野生沉香多呈不規(guī)則形狀，黑褐色樹脂較為明顯，木質(zhì)較少，表面多有腐銹，燃燒時香味更加濃郁，具有強(qiáng)烈香氣，同時可見黑色油狀物滲出。

2.2醇溶性浸出物含量

如圖2所示，10批次野生沉香(W1-W10)的醇溶性含量為10.27%～41.93%，平均為24.9%。其中，醇溶性浸出物含量在10%～20%之間的有3批次(W2、W4、W5)， 20%～30%之間的有5批次(W1、W3、W7、W8、W9)，而大于30%的有2批次(W6、W10)。醇溶性浸出物中包括2-(2-苯乙基)色酮類化合物、倍半萜類化合物、芳香族化合物、脂肪酸等，是沉香中主要化學(xué)成分的總量，因此，醇溶性浸出物含量是沉香質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。根據(jù)《藥典》的檢驗標(biāo)準(zhǔn)，藥用沉香醇溶性浸出物含量不低于10.0%。野生沉香因結(jié)香時間較長，通常高于人工沉香的判別標(biāo)準(zhǔn)。然而，野生沉香結(jié)香時間差異性較大，表面處理腐朽程度不同，導(dǎo)致醇溶物含量相差較大。

圖1 部分野生沉香樣品Fig.1 Some wild agarwood samples

圖2 野生沉香醇溶性浸出物含量對比Fig.2 The alcohol extract content of 10 batches of wild agarwood

2.3顯色反應(yīng)

《藥典》規(guī)定藥用沉香的顯色反應(yīng)應(yīng)呈櫻紅色或淺櫻紅色；然而，入藥沉香材料多為人工沉香，《藥典》規(guī)定并沒有充分考慮到野生沉香的顯色反應(yīng)顏色。從圖3可以清晰地觀察到，除了明顯的櫻紅色或淺櫻紅色(W1、W2、W4、W8、W9、W10)外，野生沉香呈現(xiàn)出更多樣的顏色，包括紫堇色(W3、W7)、淺紅色(W5)和淺紫色(W6)。

2.4薄層色譜分析

由圖4可知，10批次野生沉香的薄層色譜均出現(xiàn)與對照樣品(CK)相對應(yīng)的熒光斑點，在比移值Rf為0.18、0.20、0.27和0.35四處有明顯的藍(lán)色或淡藍(lán)色熒光斑點是沉香的薄層色譜特征。由于部分樣品溶液濃度較低或色酮類成分含量的差異，導(dǎo)致有些熒光斑點較淡，但依然存在(如W8)。薄層色譜鑒別具有專屬性，采用適當(dāng)?shù)恼归_劑，可以通過熒光斑點鑒別其色酮類成分，斑點清晰，分離效果好，而且該種鑒別方法節(jié)省材料，簡單易操作，對于野生沉香的基礎(chǔ)鑒別(如真?zhèn)舞b定)具有較強(qiáng)的分辨能力。

圖3 野生沉香的顯色反應(yīng)Fig.3 Chromogenic reaction of wild agarwood

圖4 10批次野生沉香的薄層色譜Fig.4 Thin-layer chromatography of 10 batches of wild agarwood

2.5高效液相色譜分析

圖5 10批次野生沉香特征圖譜(a)以及野生沉香對照特征圖譜(b)Fig.5 Characteristic chromatograms (a) and reference characteristic chromatogram (b) of 10 batches of wild agarwood

野生沉香成分具有多樣性，各組分含量受結(jié)香時間、樹齡、產(chǎn)地等多因素影響，因此，在初步鑒別的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增加化學(xué)成分鑒別，有利于更好地鑒別野生沉香。按照HPLC色譜條件進(jìn)行分析，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A)對所得色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以對照樣品為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗為0.1，經(jīng)多點矯正后，10批次野生沉香的全峰匹配相似度范圍為0.350～0.983(W1-W10分別為0.981、0.978、0.947、0.863、0.350、0.973、0.983、0.946、0.975和0.838)。除W5樣品相似度較低外，其余樣品相似度均大于0.8，說明樣品之間品質(zhì)相差較小。如圖5所示，自動匹配得到特征圖譜兼顧了各批次樣品特征，出現(xiàn)了11個色譜共有峰(圖5a)。綜合分析，選定其中9個共有峰作為特征峰(CPW1-CPW9)，如圖5b所示，其對照特征圖譜的保留時間分別為19.648、20.301、22.600、23.310、23.870、24.472、34.957、39.304和44.300。根據(jù)相關(guān)報道(張倩等， 2015)，確定其中部分特征峰成分為： 1) 沉香四醇； 2) (5S, 6R, 7S, 8R)-2-[2-(4’-甲氧基-苯乙基)]-5,6,7,8-四氫色酮； 3) (5S, 6R, 7S, 8R)-異沉香四醇； 4) 沉香色酮B； 5) 沉香色酮C； 6) 8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羥基-5,6,7,8-四氫色酮。

表2給出了野生沉香9個共有峰面積在單批次圖譜總峰面積中所占比例。由表2可知，自動匹配選定的9個共有特征峰的峰面積之和占單批次總峰面積的比例很高(φW=S9/STotal)，為18.85%～83.42%，平均為53.77%，高于50%的有5批次樣品。其中，W5樣品CPW1和CPW3特征峰的峰面積所占比例遠(yuǎn)低于其他樣品，導(dǎo)致其共有特征峰面積比例最低，為18.85%，該結(jié)果與其醇溶性浸出物含量較低及薄層色譜中的熒光斑點較淡、相似度較低相一致，共同說明W5號樣品品質(zhì)較差。在較多批次野生沉香中，φW均高于50%，進(jìn)一步說明9個共有特征峰是野生沉香的主要成分，可作為野生沉香的鑒別依據(jù)。通過10批次野生沉香9個共有特征峰的φW可以看出，CPW1特征峰的平均峰面積比例為29.75%，成為最重要的野生沉香參照峰，這一特征與《藥典》中人工沉香的參照峰相同。

然而，在特征峰的選擇上，野生沉香與《藥典》規(guī)定的人工沉香存在差異。根據(jù)《藥典》，人工沉香特征圖譜應(yīng)呈現(xiàn)6個特征峰(圖6)，除1號峰所占峰面積比例很高外，在保留時間36～38 min存在很明顯的特征峰，在45～47 min存在2個特征峰，峰面積較高，是非常重要的人工沉香鑒別特征。而對于野生沉香，除1號峰外，其余特征峰比例較低，尤其是在以上2段保留時間內(nèi)(黑色虛線部分)，遠(yuǎn)低于人工沉香峰面積比例，不存在人工沉香的特征峰或峰面積極小而不作為明顯特征峰。造成這一現(xiàn)象的原因，可能是由于人工沉香結(jié)香時間較短(一般為12個月左右)，沉香化學(xué)成分在組分上分化較少，而野生沉香結(jié)香時間幾十年、上百年甚至更長，使植物次生代謝產(chǎn)物增加，原來的成分含量驟減(Chenetal., 2011; Gaoetal., 2014; Naefetal., 2011)。

彰顯了中國和東盟十國致力于共同維護(hù)南海地區(qū)和平穩(wěn)定的愿望和決心。在2015年中國-東盟防長非正式會晤上，中國首次提出與東盟成員國舉行海上聯(lián)合演習(xí)的建議，得到各方積極響應(yīng)。此后，中國與東盟各國多次交換意見，就海上聯(lián)演主要內(nèi)容達(dá)成共識，并在2018年2月中國-東盟防長非正式會晤上得到確認(rèn)。海上聯(lián)演的桌面推演已于8月2～3日在新加坡樟宜海軍基地舉行。舉行此次海上聯(lián)演是踐行習(xí)近平主席“親、誠、惠、容”周邊外交理念，打造中國-東盟命運(yùn)共同體的務(wù)實舉措，落實中國-東盟防長共識，深化中國與東盟防務(wù)安全合作、增進(jìn)互信的重要行動。

表2 10批次野生沉香共有特征峰面積所占比例Tab.2 Common characteristic peak area proportion of 10 batch wild agarwood %

圖6 人工沉香對照樣品(a)和野生沉香對照特征圖譜(b)對比Fig.6 Comparative fingerprint of characteristic peak in cultivated agarwood and wild agarwood

3 討論

從醇溶性浸出物含量結(jié)果分析，野生沉香因結(jié)香時間較長，通常高于人工沉香的判別標(biāo)準(zhǔn)。10批次野生沉香的醇溶性浸出物含量均高于《藥典》的檢驗標(biāo)準(zhǔn)，最高達(dá)41.93%，因此，醇溶性浸出物含量作為野生沉香鑒別指標(biāo)之一，其含量應(yīng)不低于10.0%。

從顯色反應(yīng)結(jié)果來看，野生沉香的顯色反應(yīng)呈現(xiàn)出更多樣的顏色，除人工沉香的櫻紅色或淺櫻紅色外，野生沉香的顯色反應(yīng)還包括紫堇色(W3、W7)、淺紅色(W5)和淺紫色(W6)。為了防止野生沉香的鑒定失誤，野生沉香的顯色反應(yīng)顏色需擴(kuò)展為櫻紅色、紫堇色、淺紅色和淺紫色。

從薄層色譜鑒別結(jié)果分析，野生沉香的薄層色譜均出現(xiàn)與對照樣品相對應(yīng)的熒光斑點，雖然樣品之間含油量的差異可能造成熒光斑點強(qiáng)弱不一，但熒光斑點并未缺失，這使薄層色譜與一般的鑒別方法相比，具有更強(qiáng)的分辨能力。

從HPLC結(jié)果分析，野生沉香的峰匹配相似度較高，說明該樣品品質(zhì)差異較小。選定的9個特征峰峰面積較大，全部存在于野生沉香樣品中，可作為野生沉香鑒別的特征峰。其中，部分特征峰與人工沉香相同，體現(xiàn)了野生沉香和人工沉香的共性，而在36～47 min保留時間內(nèi)，野生沉香特征峰明顯不同于人工沉香(《藥典》)，該特征可作為人工沉香和野生沉香的鑒別依據(jù)。

4 結(jié)論

通過對10批次野生沉香的醇溶性浸出物含量測定、顯色反應(yīng)、薄層色譜分析和HPLC方法測定，采用簡單、準(zhǔn)確、快捷的鑒別方法，達(dá)到了鑒別野生沉香的目的。結(jié)果表明： 1) 野生沉香的醇溶性浸出物含量≥10.0%，是野生沉香基礎(chǔ)鑒別的依據(jù)之一； 2) 《藥典》中規(guī)定人工沉香顯色反應(yīng)為櫻紅色，而野生沉香的顯色反應(yīng)則呈現(xiàn)多樣性，包括櫻紅色、紫堇色、淺紅色和淺紫色，顯色反應(yīng)成為鑒別野生沉香的重要方法之一； 3) 野生沉香樣品在薄層色譜分析中，整體上呈現(xiàn)清晰的熒光斑點和較好的分離效果，薄層色譜分析可作為野生沉香基礎(chǔ)鑒別方法之一； 4) 根據(jù)10批次野生沉香的HPLC圖譜，建立其特征圖譜，通過相似度評價、峰面積比較，確定了野生沉香的9個共有特征峰，通過與人工沉香特征峰對比，可以科學(xué)、有效、準(zhǔn)確地鑒別野生沉香。

目前，野生沉香的鑒別方法研究較少，本文從繁雜高成本的眾多方法中，基于節(jié)約原料、降低檢測時間、科學(xué)準(zhǔn)確的原則，提出以顯微鑒別、醇溶性浸出物含量、顯色反應(yīng)、薄層色譜作為沉香基礎(chǔ)鑒別方法，輔助高效液相色譜進(jìn)行深入鑒別，最終能夠準(zhǔn)確、快捷地鑒定野生沉香樣品，可為沉香品質(zhì)評價體系的建立提供參考。

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(責(zé)任編輯 石紅青)

TheExplorationofIdentificationMethodofWildAgarwood

Chen Yuan1,2Shang Lili2Yang Jinling3Li Gaiyun1,2Yin Yafang2Dai Haofu3

(1.ResearchInstituteofForestryNewTechnology,CAFBeijing100091； 2.ResearchInstituteofWoodIndustry,CAFBeijing100091； 3.InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciencesHaikou571101)

【Objective】 This paper focused on the establishment of effective, accurate and scientific wild agarwood identification technology, and will help to offer a reference basis for the quality evaluation of agarwood standard.【Method】 Using alcohol soluble extract content, color reaction, thin layer chromatography (TLC) analysis methods, and the high performance liquid chromatography (HPLC), 10 batches of wild agarwood are identified.【Result】 The alcohol soluble extract content of 10 batches of wild agarwood is significantly higher than 10% regulated by Pharmacopoeia(2015). The color reaction of cultivated agarwood shows pale cherry red or cherry red, while the wild ones also show violet,light red and purple except cherry red. The color reaction can assist in the identification of wild agarwood samples.TLC is a simple and sample-saving method. The wild agarwood in TLC show clear fluorescent spots and good separation effect. The most of the wild samples can be identified by TLC. By comparing with similarity evaluation, peak area of 10 batches of wild agarwood, HPLC fingerprints and 9 common characteristic peaks are established. Moreover, the differences of wild and cultivated agarwood HPLC fingerprints, which can identify the wild agarwood effectively and accurately,are determined.【Conclusion】 Based on the advantages of each method, this paper proposes HPLC common characteristic peaks with microscopic identification, color reaction, the alcohol soluble extract content and thin layer chromatography to identify the wild agarwood. The results will provide the reference for the establishment of quality evaluation system of agarwood.

wild agarwood； identification method； high performance liquid chromatography； fingerprint； common characteristic peak

S781.4； R282.71

A

1001-7488(2017)09-0090-07

10.11707/j.1001-7488.20170911

2016-04-14;

2016-05-31。

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金(CAFINT2015C05)； 林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目《沉香》(2014-LY-071)。

* 李改云為通訊作者。