徐嘉娟 李火根

(1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037； 2. 貴州省林業(yè)科學研究院 貴陽 550005)

鵝掌楸LcPAT8基因的克隆及功能初步分析*

徐嘉娟1,2李火根1

(1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037； 2. 貴州省林業(yè)科學研究院 貴陽 550005)

【目的】 基于前期鵝掌楸生長性狀與EST-SSR分子標記關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，克隆分離與鵝掌楸生長性狀相關(guān)聯(lián)的SSR位點相對應的基因，通過分析其序列特征、結(jié)構(gòu)特征、與其他物種同源基因的親緣關(guān)系和表達特性，初步了解該基因在鵝掌楸生長發(fā)育過程中的作用。同時，利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對分離的基因進行功能研究，以期為鵝掌楸生長發(fā)育的分子機制研究及功能基因挖掘奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?以鵝掌楸葉芽為材料，借助其葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆分離與鵝掌楸生長性狀相關(guān)聯(lián)的642號位點對應的EST序列相關(guān)基因，對其進行生物信息學分析。通過實時熒光定量PCR檢測該基因在鵝掌楸花芽、盛花期的葉芽、葉片、花瓣、雄蕊、雌蕊中的相對表達量。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建該基因的植物過表達載體，使用農(nóng)桿菌GV3101介導的花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得T2代轉(zhuǎn)基因植株，直接觀察轉(zhuǎn)基因植株表型?！窘Y(jié)果】 克隆獲得與鵝掌楸生長性狀相關(guān)聯(lián)的642號位點相對應的基因，該基因全長1 968 bp(GenBank登錄號： KU883608)，開放閱讀框為1 269 bp，編碼422個氨基酸。生物信息學分析表明該基因編碼的蛋白序列含有1個典型的DHHC-CRD結(jié)構(gòu)域，屬于DHHC型鋅指蛋白家族成員，與其他植物預測的蛋白質(zhì)棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(PAT)高度相似，并根據(jù)與NCBI中擬南芥PAT基因的比對結(jié)果，將其命名為LcPAT8。組織表達分析表明，LcPAT8基因在鵝掌楸花芽、葉芽等6個組織中均有表達，在雌蕊中表達量最高，花瓣和葉片中的表達量高于葉芽和花芽，而在雄蕊中的表達量最低。利用Gateway技術(shù)，成功構(gòu)建了鵝掌楸LcPAT8基因的植物過量表達載體，獲得T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥。與野生型擬南芥相比，過表達LcPAT8基因的擬南芥植株的蓮座葉片數(shù)目以及抽薹時間沒有發(fā)生明顯變化，而野生型植株大部分角果成熟、葉片枯黃掉落時，轉(zhuǎn)基因植株依然生長旺盛，葉片鮮綠并且還有大量花絮，在野生型植株干枯死亡后，轉(zhuǎn)基因植株還有大量側(cè)枝生長、開花。【結(jié)論】 鵝掌楸LcPAT8基因在雌蕊中表達量最高，其次是花瓣，可能參與花瓣的擴展、心皮及胚的發(fā)育； 在擬南芥中過表達LcPAT8基因，明顯延長了植株的生長期。因此，鵝掌楸LcPAT8基因可能在植物生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。

鵝掌楸； 基因克??； 組織表達特征； 異源表達； 功能分析

植物的生長發(fā)育由基因控制，不同組織器官的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能的分化與特異基因的種類、數(shù)量及時空上的表達差異密切相關(guān)(張春玲, 2014)。分離有潛在應用價值的基因并進行深入研究，運用基因工程技術(shù)手段進行基因表達分析，對于功能基因挖掘及開展植物分子育種等方面均具有十分重要的意義。林木種質(zhì)資源豐富，種質(zhì)間遺傳差異大，克隆林木重要性狀基因并通過遺傳轉(zhuǎn)化加以利用，這是未來開展林木分子育種的一條重要途徑。

蛋白的翻譯后修飾(posttranslational modification)與植物體內(nèi)許多的過程，如DNA復制和損傷修復、細胞分化、染色質(zhì)凝聚和轉(zhuǎn)錄活性等相關(guān)，與蛋白質(zhì)完整功能的正確行使息息相關(guān)(Pedroetal., 2012； Sch?nichenetal., 2013； 阮班軍等, 2014； Marinoetal., 2015)。蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、脂質(zhì)化等(Hildmannetal., 2007)。蛋白質(zhì)乙?；軌蚋淖?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)以及調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、DNA復制和損傷修復，在植物生長發(fā)育、衰老和脅迫應答中發(fā)揮重要作用(Yuanetal., 2013)，組蛋白去乙酰化酶基因HD1可能通過脅迫和激素響應和應答途徑調(diào)控植物的衰老。許多蛋白質(zhì)的甲基化酶在植物衰老和發(fā)育過程中也具有重要作用(Dijketal., 2010； Zongetal., 2013； Widiezetal., 2014)。棕櫚?；揎検潜姸喾g后修飾類型中最普遍且唯一可逆的脂質(zhì)修飾形式，在蛋白活性調(diào)控(Abramietal., 2008； Linderetal., 2007)、穩(wěn)定性維持、膜結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)運以及信號傳導等過程中發(fā)揮著重要作用(Smotrysetal., 2004； Huangetal., 2005； Batistietal., 2008)，其可逆性增加了對底物蛋白調(diào)控的動態(tài)性和精確性(Greavesetal., 2011； Guanetal., 2011)。催化棕櫚酰化修飾的酶被稱為蛋白質(zhì)棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(protein S-acyltransferases，PATs)，DHHC-CRD(半胱氨酸富集域)類蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶是真核生物PATs中研究最多的家族。DHHC(Asp-His-His-Cys)型鋅指結(jié)構(gòu)域是一種富含高度保守的半胱氨酸殘基聚集域，具有C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)特征，屬于類C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)。目前將富含DHHC型鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白稱為DHHC蛋白，它們組成DHHC蛋白質(zhì)家族(Abramietal., 2008)。已有的研究表明，DHHC型鋅指蛋白在植物的生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。例如，從擬南芥(Arabidopsisthaliana)突變體中分離得到的DHHC型鋅指蛋白TIPl是首個報道的具有棕櫚?；D(zhuǎn)移酶活性的植物PAT，參與植株細胞的極性生長和細胞延伸，在植株生長發(fā)育過程中具有極為重要的作用(Hemsleyetal., 2005)。周良子(2013)發(fā)現(xiàn)擬南芥中的PAT10參與植株生長發(fā)育的多個過程，同時在植株對外界鹽脅迫響應過程中起著重要作用(Zhouetal., 2013)。水稻(Oryzasativa)DHHC型鋅指蛋白基因OsDHHC1和OsDHHC13分別參與水稻株型構(gòu)建和氧化脅迫反應(周波, 2011； 王文文, 2016)。2個同源的蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶PAT13和PAT14參與擬南芥葉片衰老調(diào)控(Laietal., 2015； Zhaoetal., 2016)。

鵝掌楸(Liriodendronchinense)是木蘭科(Magnoliaceae)鵝掌楸屬(Liriodendron)植物，分布在我國長江流域以南的亞熱帶中、低山區(qū)(王章榮, 2005)，是我國特有的珍稀植物。目前，國內(nèi)外有關(guān)鵝掌楸功能基因組學研究還很少，也缺乏相關(guān)功能基因的研究，限制了對其表型性狀的遺傳學機制的了解。研究鵝掌楸生長發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)、發(fā)掘生長性狀相關(guān)的功能基因，對于了解鵝掌楸重要性狀的遺傳基礎(chǔ)，以及今后開展鵝掌楸分子育種等方面均具有重要意義。本課題組前期工作篩選到與鵝掌楸生長性狀關(guān)聯(lián)的7個SSR位點(姚俊修, 2013)。本研究以其中1個位點(642位點)為目標，以鵝掌楸葉芽為材料，運用RT-PCR和RACE相結(jié)合的方法，克隆分離該位點對應基因的全長，分析該基因的序列特征； 利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技術(shù)分析其組織表達特性； 同時，構(gòu)建該基因的植物過量表達載體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥對其功能進行初步研究，以期為揭示鵝掌楸生長發(fā)育、形態(tài)建成的分子機制及功能基因的挖掘奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

供試材料來源于南京林業(yè)大學下蜀實習林場鵝掌楸屬種源試驗林(種源來自江西廬山，代號LS)，樹齡20 年，4月份采集花芽，5月份采其盛花期的葉芽、葉片、花瓣、雄蕊、雌蕊，分裝于無RNA酶的離心管并迅速放入液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2基因全長cDNA序列的獲取

采用天根公司的RNAprep Pure Plant Kit(DP432)試劑盒提取上述鵝掌楸樣品的總RNA。根據(jù)從本實驗室鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(Yangetal., 2014)中篩選獲得的與鵝掌楸生長性狀相關(guān)聯(lián)的642號位點對應的EST序列(姚俊修, 2013)，利用Oligo 6軟件按照TaKaRa公司的3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase試劑盒巢式PCR的要求，設計基因3′ 末端擴增引物： LcPAT8-3GSP1(5′-GTTGCTTCTTGCTACTTCTGCCC-3′)，LcPAT8-3GSP2(5′-CCAAGTCTACAGTTTCCTCGTACC-3′)。用上述3′RACE試劑盒以葉芽總RNA為模板合成3′RACE cDNA，利用LcPAT8-3GSP1、LcPAT8-3GSP2分別進行第1輪和第2輪嵌套式PCR，擴增3′ 端序列，反應體系及擴增條件同3′RACE試劑盒說明書，退火溫度分別為56 ℃和57 ℃；擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測切取目的條帶，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)試劑盒進行回收、純化，連接到pEASY-T1 Cloning Vector(TransGen Biotech)載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細胞(TransGen Biotech)；經(jīng)藍白斑篩選，挑取陽性單克隆，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，獲得基因3′端序列。

根據(jù)獲取的3′ 端序列，按照5′-Full RACE Kit(TaKaRa)試劑盒要求設計5′ 末端擴增引物： LcPAT8-5GSP1(5′-TTCTCGTATGTGGTCTGGTTGGT G-3′)，LcPAT8-5GSP2(5′-AGTAAGACCACCAACA AACCACAGGGAG-3′)。以葉芽總RNA為模板，利用該試劑盒合成5′RACE cDNA，用LcPAT8-5GSP1和LcPAT8-5GSP2分別進行第1輪和第2輪PCR，擴增5′ 端序列，反應體系及擴增條件同5′ RACE試劑盒說明書，退火溫度分別為58 ℃和63 ℃。克隆測序過程同上，獲得基因的5′ 端序列。

將獲得的3′ 端和5′ 端序列利用DNAMAN 6.0軟件進行拼接，獲得基因全長cDNA序列，利用FGENESH軟件預測所得基因的ORF序列，設計正向引物LcPAT8OF(5′-ATGGCCAAGCGCGTCTACCA AG-3′)和反向引物LcPAT8OR(5′-CTAATGGCGT GCTTCCCTCTGC-3′)，利用RevertAid strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以葉芽總RNA為模板合成cDNA第1鏈，用2×TransStartFastPfuPCR SuperMix(TransGen Biotech)進行PCR擴增，獲取基因ORF序列，反應體系參照徐嘉娟等(2016)。反應條件為： 預變性(94 ℃，3 min)； 變性(94 ℃，30 s)，退火(60 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，2 min)，30個循環(huán)； 總延伸(72 ℃，10 min)。克隆測序過程同上，連接載體為pEASY-Blunt(TransGen Biotech)。

1.3基因生物信息學分析

利用各生物信息學分析軟件對目的基因的ORF、編碼的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)等進行分析(表1)。

表1 基因生物信息學分析軟件Tab.1 Gene bioinformatics analysis softwares

1.4基因的組織表達分析

以花芽、葉芽、葉片、花瓣、雄蕊、雌蕊6個不同組織樣品總RNA為模板，均一化濃度后，利用Invitrogen的M-MLV First Strand Kit試劑盒合成用于qPCR的cDNA，進行實時定量分析，檢測目的基因在6個組織中的相對表達量。根據(jù)SYBRPremixExTaq(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)qPCR試劑盒的要求，利用Primer Express Software version 3.0(Applied Biosystems)軟件設計qPCR引物(胥猛等, 2011)： LcPAT8qF(5′-AGAGGGAAGCACGCCATTAG GT-3′)和LcPAT8qR(5′-TTACACCAGCCTACCGCC TTTGA-3′)；內(nèi)參基因上下游引物： ACT-F(5′-TCGAGCAGGAGCTAGAGACA-3′)和ACT-R： (5′-AAGAGATGGCTGGAAGAGGA-3′)(羅群鳳等, 2015)。qPCR反應在ABI 7500 PCR儀上完成，每個反應重復3次，反應體系及PCR程序參照上述試劑盒說明書。

1.5LcPAT8植物過表達載體構(gòu)建

根據(jù)克隆所得LcPAT8基因全長cDNA序列，在ORF開頭和結(jié)尾設計引物(包含終止密碼子)(見1.2)，擴增基因編碼區(qū)，通過克隆測序確定目的片段。采用Gateway技術(shù)構(gòu)建植物表達載體： 利用pCR 8/GW/TOPO TA Cloning Kit進行TOPO克隆，將目的基因克隆到供體載體pCR 8/GW/TOPO上，通過克隆測序確定含有目的基因的入門載體； 利用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix將入門載體與目的載體pH35GS(由南京林業(yè)大學胥猛副教授惠贈)進行LR重組反應，構(gòu)建目的基因過表達載體，克隆測序確定目的片段及插入方向后，回收純化LR反應所得的目的基因植物過表達載體，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6擬南芥轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因植株檢測與表型觀察

采用電擊法將含有目的基因的植物過表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101感受態(tài)細胞，并通過擬南芥花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥(劉青等, 2014)，培養(yǎng)收種獲得大量T0代種子。經(jīng)潮霉素B抗性篩選(潮霉素B 30 mg·L-1)種植獲得T1代植株。正常生長的T1代陽性轉(zhuǎn)基因植株及野生型擬南芥植株移植2周后，用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取擬南芥葉片DNA，利用表達載體pH35GS上的35S引物和基因特異性后向引物LcPAT8OR(見1.2)進行PCR擴增檢測，同時以質(zhì)粒DNA和野生型擬南芥的DNA作為對照。PCR鑒定的T1代陽性植株成熟后收種子，進行抗性篩選(潮霉素B 30 mg·L-1)，將篩選所得陽性植株移栽獲得T2代植株，觀察轉(zhuǎn)基因植株的表型變異并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1LcPAT8基因全長序列的獲得及編碼蛋白分析

2.1.1LcPAT8基因cDNA全長的獲得及序列分析 通過3′ RACE和5′ RACE擴增分別獲得1 102 bp(圖1A)和1 247 bp(圖1B)的序列； 采用DNAMAN 6.0軟件進行拼接獲得基因全長cDNA序列(1 968 bp)。根據(jù)全長序列預測目的基因ORF，設計引物進行ORF擴增(圖1C)和測序驗證，測序結(jié)果與拼接結(jié)果一致，獲得基因全長cDNA序列。利用在線工具FGENESH對其ORF及所編碼氨基酸序列進行預測，將其在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行blastp比對。結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白與其他植物中預測的PAT高度相似，并根據(jù)與擬南芥PAT的比對結(jié)果，將其命名為LcPAT8。

LcPAT8基因全長1 968 bp(GenBank登錄： KU883608)，其中5′ 非編碼區(qū)有376 bp，3′ 非編碼區(qū)有323 bp，ORF序列為1 269 bp(377—1 645 bp)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，編碼422個氨基酸； 編碼的蛋白分子量約為48 kDa； 理論等電點為8.45，屬于堿性蛋白； 該蛋白脂溶指數(shù)為83.60； 不穩(wěn)定指數(shù)為42.37。

圖1 鵝掌楸LcPAT8基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 Amplification results of LcPAT8 gene fragmentsM: 100 bp-ⅣMarker(GENEray); 8: LcPAT8. A： 3′RACE獲得片斷； B： 5′RACE獲得片斷； C： ORF擴增片段。A: Fragments obtained by 3′ RACE; B: Fragments obtained by 5′ RACE; C: ORF fragments.

2.1.2LcPAT8基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析 蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，LcPAT8基因所編碼的蛋白包含1個典型的DHHC-CRD結(jié)構(gòu)域(C-x2-C-x9-HC-x2-C-x2-C-x4-DHHC-x5-C-x4-N-x3-F-x4，C代表半胱氨酸、H代表組氨酸、x代表任意氨基酸)(Putilinaetal., 1999)，該蛋白屬于DHHC蛋白家族成員，同時還包含1個DPG和TTxE結(jié)構(gòu)域，與具有S-?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)所特有的結(jié)構(gòu)域相符。利用SignalP 4.1進行信號肽預測，結(jié)果表明，LcPAT8基因不存在信號肽酶切位點，是1個非分泌型蛋白。TMHMM 2.0蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，該基因所編碼的蛋白具有4個跨膜區(qū)(圖2)。Pfam結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因含有zf-DHHC結(jié)構(gòu)域，位于跨膜域TM2和TM3之間。

SOPMA二級結(jié)構(gòu)分析表明，α螺旋(alpha helix)和無規(guī)則卷曲(random coil)是該DHHC蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要成分。α螺旋占37.68%，無規(guī)則卷曲占32.46%，延伸鏈占21.80%，β轉(zhuǎn)角占8.06%。ProtComp 9.0蛋白亞細胞定位分析表明： 該蛋白屬于膜蛋白，定位于葉綠體類囊體膜。

2.1.3 編碼蛋白同源性比較及系統(tǒng)進化分析 通過在NCBI搜索，初步得到了8個含有DHHC結(jié)構(gòu)域并且已經(jīng)證明具有蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的基因(Akr1p： NP_010550； Erf2： NP_013347； Swf1： NP_010411； Pfa3： NP_014073； ZDHHC8： XP_006724302； Pfa4： NP_014640； ZDHHC3： NP_001128651； AtTIP1： NP_197535)，將LcPAT8基因的氨基酸序列與8個PAT基因的氨基酸進行比對后發(fā)現(xiàn)，LcPAT8編碼的蛋白存在S-?；D(zhuǎn)移酶活性蛋白質(zhì)所特有的結(jié)構(gòu)域： DHHC-CRD結(jié)構(gòu)域，同時還具有DPG結(jié)構(gòu)域和TTxE結(jié)構(gòu)域(圖3)，因此推測鵝掌楸LcPAT8基因編碼的蛋白具有S-?；D(zhuǎn)移酶活性。

通過NCBI上的protein blast進行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)與LcPAT8蛋白同源的序列大部分都為預測的蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(PAT)，LcPAT8與蓮(Nelumbonucifera)、甜橙(Citrussinensis)、海棗(Phoenixdactylifera)、野草莓(Fragariavesca)、胡楊(Populuseuphratica)、油棕(Elaeisguineensis)、大豆(Glycinemax)、擬南芥中預測的PAT8相似性分別為79%、75%、74%、73%、73%、73%、72%、63%。

使用MEGA 5.1將鵝掌楸LcPAT8蛋白與其他物種中預測的PAT8蛋白構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹(圖4)，蛋白聚類分析表明，物種間的聚類基本符合物種的演化規(guī)律。首先蘋果(Malusdomestica)和梅(Prunusmume)處于同一小分支，同為薔薇科(Rosaceae)的野草莓與其關(guān)系較近； 十字花科(Cruciferae)的蕪菁(Brassicarapa)、野甘藍(Brassicaoleraceavar.oleracea)、歐洲油菜(Brassicanapus)聚合在一起； 茄科(Solanaceae)的絨狀毛煙草(Nicotianatomentosiformis)、林煙草(Nicotianasylvestris)、番茄(Solanumlycopersicum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)聚合在一起； 豆科(Leguminosae)的鷹嘴豆(Cicerarietinum)、綠豆(Vignaradiata)、大豆、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)聚合在一起； 禾本科(Gramineae)的二穗短柄草(Brachypodiumdistachyum)、谷子(Setariaitalica)、短花藥野生稻(Oryzabrachyantha)聚合在一起； 而鵝掌楸LcPAT8蛋白獨處一個分支，與蓮、無油樟(Amborellatrichopoda)、棕櫚科(Palmae)、禾本科的PAT8蛋白聚為一大類，與薔薇科、豆科、十字花科等的PAT8蛋白明顯分離開來。

2.2鵝掌楸LcPAT8基因組織表達分析

分別以鵝掌楸葉芽、花芽等6個不同組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以鵝掌楸肌動蛋白基因Actin(ACT)為內(nèi)參(羅群鳳, 2013； 羅群鳳等, 2015)，進行實時熒光定量PCR。對LcPAT8基因在不同組織中的相對表達量進行分析(圖5)。從圖中可以看出：LcPAT8基因在葉芽、葉片、花芽、花瓣、雄蕊、雌蕊6個不同組織中均有不同程度的表達，其中雌蕊中表達量最高，花瓣和葉片中的表達量高于葉芽和花芽，雄蕊的表達量最低。

圖2 鵝掌楸LcPAT8蛋白跨膜結(jié)構(gòu)模式Fig.2 Transmembrane domain models of LcPAT8

圖3 鵝掌楸LcPAT8蛋白與其他PAT蛋白的序列比對Fig.3 The multiple alignments of the deduced amino acid sequence of LcPAT8 with those of other PATs黑色字體彩色背景標示保守氨基酸殘基； 紅色方框標示保守基序。The identical amino acids are shown in black fonts with colored background; The conserved motifs are boxed in red.

圖4 LcPAT8蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 The phylogenetic tree analysis of LcPAT8節(jié)點上的數(shù)值表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復該節(jié)點可信度的百分比。The number at the nodes represents the reliability percent (%) of bootstraps values based on 1 000 replications.

圖5 LcPAT8基因在鵝掌楸不同組織中的表達Fig.5 Expression level of LcPAT8 in different tissues of Liriodendron chinense1.葉芽； 2.葉片； 3.花芽； 4.花瓣； 5.雄蕊； 6.雌蕊。葉芽表達量被定義為1。1. Leaf bud； 2. Leaf； 3. Floral bud； 4. Petal； 5. Stamen； 6. Pistil. The expression is defined as 1 of leaf bud.

2.3植物過表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株表型分析

2.3.1 植物過表達載體及轉(zhuǎn)基因擬南芥植株構(gòu)建 為驗證LcPAT8基因的功能，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建LcPAT8基因的植物過量表達載體。用引物LcPAT8OF和LcPAT8OR擴增目的片段，測序驗證表明插入片段為1 269 bp。通過入門反應和LR反應將LcPAT8基因的編碼區(qū)連接到pH35GS過表達載體上，形成由CaMV 35S啟動的LcPAT8植物過量表達載體。測序結(jié)果表明LcPAT8基因正確重組到過表達載體pH35GS上，序列顯示正確，沒有發(fā)生移碼或單堿基突變的現(xiàn)象，證明LcPAT8基因的植物過表達載體構(gòu)建成功。利用電擊法LcPAT8基因的LR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，收取種子。

利用含有潮霉素B(30 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基平板進行篩選，得到陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。RT-PCR檢測顯示： 10株陽性植株能擴增出帶位大小符合要求且清晰的特異性條帶，而野生型擬南芥則不能擴增出相應片段(圖6)，說明LcPAT8基因已整合到擬南芥基因組中。

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株P(guān)CR檢測Fig.6 The PCR detection of the transgenic Arabidopsis thalianaM： 100 bp-ⅣMarker(捷瑞)； 1, 2： 陰性對照； 3, 4： 陽性對照； 5-15： 潮霉素B抗性篩選為陽性的植株。M: 100 bp-ⅣMarker(GENEray); 1, 2: Negative control; 3, 4: Positive control; 5-15: The respective positive A.thaliana lines survived under Hyg B screening.

圖7 野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥生長發(fā)育過程Fig.7 Growth and development process of wild-type and transgenic Arabidopsis thalianaA: 移栽后40天; B: 移栽后73天; C: 移栽后102天。1, 3, 5： 野生型植株; 2, 4, 6: 轉(zhuǎn)基因植株。A: 40 days after transplanting; B: 73 days after transplanting; C: 102 days after transplanting. 1, 3, 5: Wild-type; 2, 4, 6: Transgenic.

2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株表型分析 T2代轉(zhuǎn)基因植株表型分析表明： 篩選獲得的27株LcPAT8過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥植株蓮座葉片數(shù)以及抽薹時間與野生型無顯著差異，在土壤中生長40天的轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育情況與野生型植株沒有明顯差別，都已長出大量花絮和部分角果。培養(yǎng)至70天左右，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比表現(xiàn)出明顯的差異，野生型植株在移栽后73天，大部分角果都已成熟、葉片枯黃掉落，而轉(zhuǎn)基因植株依然生長旺盛，葉片鮮綠并且還有大量花絮。在移栽后102 天，野生型植株已經(jīng)干枯，轉(zhuǎn)基因植株還有大量側(cè)枝生長、開花(圖7)。由此說明35S啟動子驅(qū)動的LcPAT8基因的表達導致擬南芥植株生長期延長。

3 討論

植物的生長發(fā)育及形態(tài)建成是由基因表達調(diào)控的，同一基因及不同基因隨時間、空間選擇性地表達，形成了不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)及特異的生理功能。DHHC蛋白家族是一類與棕櫚?；揎椣嚓P(guān)的蛋白，多數(shù)DHHC蛋白家族成員具有蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(protein S-acyltransferase，PAT)活性(Greavesetal., 2011)。已有的研究表明，DHHC型鋅指蛋白在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成過程中起著非常重要的作用(Hemsleyetal., 2005； Xiangetal., 2010； Zhouetal., 2013)。徐嘉娟等(2016)研究發(fā)現(xiàn)鵝掌楸LcPAT7基因在花瓣中表達豐度最高，花芽和葉芽中較低。Wang等(2011)對擬南芥PAT基因家族中20個基因的研究表明：AtPAT8(At4g24630)在成熟果莢中表達量最高，其次是花，葉和莖中表達量很低。本研究中LcPAT8基因在鵝掌楸花芽和盛花期的葉片、葉芽、花瓣、雄蕊、雌蕊中均有表達，在雌蕊中表達量最高，其次是花瓣，可能參與花瓣的擴展、心皮及胚的發(fā)育。

目前，將目的基因在模式植物中過量表達是研究基因功能的重要手段之一。本研究將鵝掌楸LcPAT8基因通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化擬南芥植株，利用載體pH35GS中的CaMV35S啟動子驅(qū)動表達，通過觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型特征，以期來研究LcPAT8基因的功能。目前，對植物DHHC蛋白家族的研究相對較少，但已有的研究表明，大多植物DHHC蛋白具有PAT活性，通過介導其他蛋白的棕櫚?；谥参锏纳L發(fā)育、形態(tài)建成及逆境響應過程中起著極為重要的作用。擬南芥TIP1與根毛和花粉管生長、細胞延伸密切相關(guān)(Hemsleyetal., 2005)，PAT10在擬南芥生長發(fā)育和鹽脅迫響應過程中發(fā)揮著重要作用(Zhouetal., 2013)，PAT13、PAT14與NOA1的棕櫚?；嘘P(guān)進而參與擬南芥葉片衰老的調(diào)控(Laietal., 2015)；水稻OsDHHC13基因在氧化脅迫條件下能促進清除ROS的相關(guān)酶基因表達(王文文, 2016)。本研究結(jié)果表明，在擬南芥中過表達LcPAT8基因，明顯延長了植株的生長期。生長期的長短決定著生物體或器官的壽命，影響到作物的產(chǎn)量、品質(zhì)以及觀賞植物花期和牧草產(chǎn)量等。對植物生長發(fā)育調(diào)控機制的研究不僅具有重要的理論意義還有較好的實際應用價值，如有助于抗性強、抗衰老品種的選育，延長觀賞植物花期，森林、草原的更新保護等。但LcPAT8基因在鵝掌楸生長發(fā)育過程中的具體功能還有待系統(tǒng)深入的研究。

4 結(jié)論

本研究從鵝掌楸中克隆得到與鵝掌楸生長性狀相關(guān)聯(lián)的642號位點對應基因LcPAT8的全長cDNA序列(GenBank登錄號： KU883608)，該基因編碼的LcPAT8蛋白具有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，與已報道的動植物DHHC蛋白家族的跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目(4～6)一致，并且在跨膜域TM2和TM3之間存在1個蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的活性位點(DHHC-CRD結(jié)構(gòu)域： C-X2-C-X9-HC-X2-C-X2-C-X4-DHHC-X5-C-X4-N-X3-F-X4)。系統(tǒng)進化樹分析表明鵝掌楸LcPAT8基因所編碼的蛋白與擬南芥中已在蛋白水平證實的PAT蛋白同源，表明LcPAT8基因編碼的蛋白可能具有蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性。成功構(gòu)建了該基因的植物過量表達載體，在擬南芥中過表達該基因，明顯延長了擬南芥植株的生長期。本研究結(jié)果為揭示鵝掌楸生長發(fā)育、形態(tài)建成的分子機制奠定了一定的基礎(chǔ)。

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(責任編輯 徐 紅)

CloningandPrimaryFunctionalAnalysisofLcPAT8GenefromLiriodendronchinense

Xu Jiajuan1, 2Li Huogen1

(1.Co-InnovationCenterforSustainableForestryinSouthernChina,NanjingForestryUniversityNanjing210037； 2.GuizhouAcademyofForestryGuiyang550005)

【Objective】 Based on the previous results of association analysis between growth traits and EST-SSR markers inLiriodendron, a gene corresponding to the marker locus associated with growth traits was cloned fromLiriodendronchinense, the function of this gene was studied by analyzing its sequence characteristics, structural features, genetic relationship with other species homologous genes and expression characteristics. Finally, the gene function was validated through over-expression inArabidopsisthaliana, the aim of this study was to understand the molecular mechanism of its growth and development and contribute to the further utilization of functional genes.【Method】 Based on the transcriptome database ofL.chinenseleaf, RT-PCR and RACE were used to clone and separate the EST related gene corresponding to 642 locus that associated with growth traits of hybridLiriodendronfor analyzing bioinformatics of the sequences. Quantitative real-time PCR was used for the analysis of gene expression in different tissues such as floral bud, flowering leaf buds, leafs, petals, stamens and pistil ofL.chinense. Using the Gateway Recombination Cloning Technology, the over-expression vector ofLcPAT8 was constructed, and transformed intoA.thalianawith the floral dipping method ofAgrobacterium-mediated transformation, the T2 transgenic plants were obtained and then the phenotype was analyzed.【Result】 The full-length cDNA of 1 968 bp was cloned(GenBank accession number: KU883608), containing 1 269 bp ORF and encoding 422 aa protein. Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by this gene had a typical DHHC-CRD domain, and it belonged to the DHHC-type zinc finger protein family. BLAST analysis indicated its high similarity to predicted protein S-acyltransferase(PAT) of other plants, and according to the alignmentresult withAtPATgenes in NCBI, we named itLcPAT8. Gene expression suggested that theLcPAT8 was expressed in various tissues, it had the highest expression in pistil but the least in stamen, and the expression in petal and leaf were higher than that in flower bud and leaf bud. The over-expression vector of theLcPAT8 was successfully constructed by the Gateway technology, the T2 transgenicA.thalianawere obtained. The rosette leaf number and bolting time of transgenic plants over-expressedLcPAT8 had no significant difference from the wild type, but when most pods of the wild type ripen, and leaves turned yellow and fell, the transgenic plants were still vigorous in growth, their leaves were fresh and green,and a large number of flower wads were present; when the wild types withered and died, the transgenic plants still had a large number of branches growing and flowering.【Conclusion】 The experimental data confirmed that theLcPAT8, a DHHC-type zinc finger protein gene fromL.chinense, was highly-expressing in the pistil and petal, it might have been involved in petal expansion and the development of carpel and embryo. Functional analysis showed that the over-expression ofLcPAT8 inA.thalianaled to obvious extension of growth cycle in the transgenic plants. This result indicated that theLcPAT8 played a vital role on the regulation of plant growth and development.

Liriodendronchinense； gene clone； tissue expression characteristics； heterologous expression； functional analysis

S718.46

A

1001-7488(2017)09-0045-10

10.11707/j.1001-7488.20170906

2016-12-19；

2017-03-29。

國家自然科學基金項目(31470660)； 江蘇省高校優(yōu)勢學科(PAPD)。

*李火根為通訊作者。