翟婉璐 鐘哲科 高貴賓 楊慧敏

(國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心 杭州 310012)

覆蓋經(jīng)營對雷竹林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演變及多樣性的影響*

翟婉璐 鐘哲科 高貴賓 楊慧敏

(國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心 杭州 310012)

【目的】 研究覆蓋對雷竹林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，為科學(xué)評價該種植模式的生態(tài)風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù)。【方法】 調(diào)查并采集不同覆蓋年限(0、3、6、9、12年)雷竹林土樣，采用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)分析16S rDNA土壤細(xì)菌基因V3-V4區(qū)域，鑒定細(xì)菌類群，并結(jié)合測定土壤的N、P和有機(jī)質(zhì)等化學(xué)指標(biāo)分析覆蓋經(jīng)營土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演變及多樣性影響?！窘Y(jié)果】 1) 測序共獲得598個OTUs,計280 548條讀數(shù)，平均讀長 453.5 bp。調(diào)查林地土壤細(xì)菌優(yōu)勢門為變形菌門、酸桿菌門和放線菌門(平均相對豐度分別為30.80%、22.0%和13.9%)。2) 不同覆蓋年限土樣的多樣性指數(shù)及豐度指數(shù)存在較大差異。覆蓋初期，隨著覆蓋物的投入，林分土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)及豐度指數(shù)均呈增加趨勢，在覆蓋6年時達(dá)到最大值，之后則呈現(xiàn)一定程度的下降，覆蓋12年與覆蓋初期無較大差別。3) 覆蓋對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成一定影響，未覆蓋林地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與覆蓋后林地出現(xiàn)差異； 變形菌門豐度由17.60%(對照)上升為37.77%(覆蓋12年)，酸桿菌門豐度呈現(xiàn)下降的趨勢，而放線菌門豐度變化很小。4) 覆蓋造成的土壤理化性質(zhì)的改變在一定程度上對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可造成影響，隨著覆蓋時間的增加，細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境的關(guān)系也趨于復(fù)雜化，覆蓋造成土壤嚴(yán)重酸化，對照和覆蓋12年的pH值分別為5.23和3.42，但土壤中的嗜酸菌群落酸桿菌門的豐度反而出現(xiàn)下降的趨勢。5) RDA分析排序軸前兩軸解釋了覆蓋竹林土壤微生物群落變異的88.5%，土壤中各細(xì)菌種群對土壤環(huán)境因子變化的適應(yīng)性不同，土壤中速效K、全N和有機(jī)質(zhì)的積累會提高Proteobacteria、 Bacteroidetes的相對豐度，土壤酸化會降低Chloroflexi的相對豐度?！窘Y(jié)論】 竹林覆蓋經(jīng)營對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生較大的影響，短期覆蓋(小于6年)能增加土壤細(xì)菌的豐度和多樣性，但隨著覆蓋時間增加，土壤細(xì)菌的豐度和多樣性下降，土壤各環(huán)境因子的變化會對覆蓋竹林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響，對土壤中微生物多樣性的研究能夠從微生物角度分析土壤退化程度，為竹林土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。

雷竹； 林地覆蓋； 土壤微生物； 細(xì)菌多樣性； 時間變化

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分循環(huán)的驅(qū)動者，是維持土壤生產(chǎn)力的重要組分，而土壤中的細(xì)菌占微生物總數(shù)的70%～90%，是土壤中有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等過程的最主要的參與者(夏圍圍等， 2014)，如每年微生物從大氣中的氮素固定量近2×106t,其中約有2/3以上由細(xì)菌參與完成，土壤中的硝化細(xì)菌、氨化細(xì)菌含量和活性直接影響土壤中氮的有效性和土地生產(chǎn)率，而土壤中的纖維分解細(xì)菌是土壤中參與碳循環(huán)的最主要的微生物類型(秦華等， 2010； Pace， 1997)?？梢姡寥兰?xì)菌在土壤微生物中占有十分重要的地位。土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性對土壤環(huán)境的變化較為敏感，因此，其結(jié)構(gòu)變化是評價自然或人為干擾引起土壤質(zhì)量改變的重要指標(biāo)(Zellesetal., 1992; Geisseleretal., 2014)。但由于微生物體積小、形態(tài)簡單及繁殖速度快，基于純培養(yǎng)技術(shù)的表型特征分類具有很大的局限性。在土壤微生物培養(yǎng)方面雖然出現(xiàn)了高通量培養(yǎng)技術(shù)、土壤基質(zhì)膜培養(yǎng)和細(xì)胞微囊包埋技術(shù)等一系列的方法，但是土壤中微生物的可培養(yǎng)率仍然只有0.1%到10%(Torsviketal., 1990； 王保軍等， 2013)，土壤中的極大多數(shù)微生物種群仍處于不明的狀態(tài)。近十年來，宏基因組高通量測序法的出現(xiàn)使大規(guī)?？陀^揭示土壤微生物種類及遺傳多樣性成為可能(Gomez-Alvarezetal., 2009； Chistoserdova， 2010)。該方法不經(jīng)過微生物培養(yǎng)而直接提取土壤中的DNA，避開了土壤微生物培養(yǎng)、分離難度大的問題，極大地提高了土壤微生物的研究效率。利用高通量測序技術(shù)可以一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，且具有數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高的特點，在土壤微生物物種、結(jié)構(gòu)、功能和遺傳多樣性等各個方面都可以獲得豐富的信息。雖然該技術(shù)在引物設(shè)計、文庫構(gòu)建等方面尚不夠成熟，但該方法可全面覆蓋土壤中的微生物種群，重復(fù)性較好，適用性較強(qiáng)，已成為解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對豐度的最重要工具之一(Goslingetal., 2006； Damonetal., 2012)。

雷竹(Phyllostachyspraecox)作為我國南方廣泛種植的優(yōu)良筍用竹，具有易栽培，竹筍營養(yǎng)豐富，味道鮮美的特點，因而其栽培面積不斷擴(kuò)大。近年來，為促進(jìn)竹筍提前發(fā)筍及提高產(chǎn)量，冬季覆蓋經(jīng)營技術(shù)已在雷竹生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用。冬季覆蓋經(jīng)營技術(shù)是指在秋冬季在竹林土壤上覆蓋大量的有機(jī)材料，如稻草、豬糞和礱糠，并在土壤中使用足量的化肥。有機(jī)覆蓋材料的主要功能是增溫保濕，而大量使用化肥的目的是促進(jìn)土壤中筍芽個體快速生長(趙麗麗等， 2015)，通過覆蓋經(jīng)營，打破地下筍芽的休眠，使雷竹提早出筍，延長出筍期，從而提高雷竹林的經(jīng)濟(jì)效益。研究表明，相較于未覆蓋竹林，用稻草和礱糠進(jìn)行雙層覆蓋后的竹林地表溫度能夠提高3 ℃以上(楊明等， 2012)，但隨之而來也出現(xiàn)了雷竹林生產(chǎn)力的退化現(xiàn)象。目前，針對雷竹林退化的研究很多，包括退化林立竹情況、鞭根生長狀態(tài)、土壤養(yǎng)分性質(zhì)、土壤生物活性及土壤酸化等。覆蓋過厚使竹林長期處于高濕和缺氧狀態(tài)造成地下鞭根系統(tǒng)嚴(yán)重退化，竹林生產(chǎn)力下降(孫曉等， 2009)； 施用復(fù)合肥過量造成土壤磷殘留積累過高、養(yǎng)分含量比例失調(diào)和土壤磷酸酶活性下降(秦華等， 2010)； 連年用高C/N的稻草等材料覆蓋竹林導(dǎo)致土壤C/N明顯升高、土壤酸化嚴(yán)重等(趙麗麗等， 2015)，但是，覆蓋經(jīng)營導(dǎo)致竹林生態(tài)系統(tǒng)退化的過程和機(jī)制仍沒有完全清楚，也沒有在生產(chǎn)實踐中提出更好的解決方法，至今，覆蓋經(jīng)營技術(shù)仍然是雷竹高效培育的主要技術(shù)措施。為此，本文采用第2代高通量測序技術(shù)，研究不同覆蓋年限的竹林土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分布特征，從微觀角度闡述覆蓋過程中土壤養(yǎng)分的動態(tài)變化，并分析可能造成這種變化的原因，為在生產(chǎn)中科學(xué)利用竹林覆蓋經(jīng)營技術(shù)提供依據(jù)，為科學(xué)評價該種植模式的生態(tài)風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域位于浙江省杭州市余杭區(qū)徑山鎮(zhèn)(120°30′E，30°33′N)。年均氣溫15.8 ℃，平均相對濕度80%，年降水量1 454 mm，年日照時數(shù)1 765 h。該區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候。調(diào)查雷竹林處于低丘地貌，坡度較一致，小于5°，土壤類型為紅壤。種植年齡都在30年以上，立竹密度在12 000株·hm-2左右。

2 材料與方法

2.1 竹林地覆蓋方法 在第1年11月份對竹林進(jìn)行翻土至30 cm深，并施用有機(jī)肥和化肥，施用量為10 t·hm-2(未發(fā)酵豬糞)和1 t·hm-2,施肥結(jié)束后給竹林澆足發(fā)筍水，再覆蓋稻草為發(fā)酵層，厚約為5 cm，15～20 t·hm-2，并噴撒水使其濕度達(dá)70%左右。再覆蓋礱糠作為保溫層，厚度為15～20 cm，80～90 t·hm-2，以保持覆蓋層地表溫度在15～25 ℃，滿足筍芽正常萌發(fā)所需溫度。在第2年3、4月，當(dāng)氣溫逐漸回升，月均溫15 ℃以上時，逐步去除覆蓋物，移除覆蓋物的數(shù)量大約為加入量的2/3,約有1/3的覆蓋物留在林地中(高貴賓等， 2013)。

2.2 土壤樣品采集與處理 為研究不同覆蓋年限雷竹林土壤細(xì)菌的群落特征，于2014年11月在立地條件一致但覆蓋年限不同的雷竹林，選擇覆蓋0(CK)、3、6、9、12年的5種雷竹林，在每種林分內(nèi)選定面積為20 m×20 m的采樣區(qū)，在采樣區(qū)內(nèi)以Z型選取7個樣點，采集0～20 cm深的土壤樣品，混合均勻。各年份的竹林地都重復(fù)3次，共計15份土樣。新鮮土樣充分混勻后，用鑷子去除大的石礫和植物殘體，再過2 mm鋼篩后分2份保存：一份立即冷凍干燥，用于提取土壤細(xì)菌DNA，供細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析使用；另一份于室內(nèi)自然風(fēng)干，研磨過篩后用于土壤基本理化性質(zhì)分析。

2.3 土壤環(huán)境因子 土壤pH值采用1∶5土水比，酸度計測定； 土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀外加熱法測定； 總氮采用半微量凱氏定氮法； 全磷采用硫酸-高氯酸消煮，鉬銻抗比色法； 全鉀采用氫氟酸消煮-火焰光度法； 有效磷用0.5 mol·L-1NaHCO3法，分光光度計測定； 速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法(魯如坤， 2000)。

2.4 土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增及文庫的構(gòu)建 本試驗所有樣品均采用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程(上海)有限公司,稱取0.2 g于-80 ℃保存的土壤樣品，按試劑盒說明書進(jìn)行土壤DNA提取； 得到15個土壤DNA樣本。用濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小，電壓為110 V，電泳時間為30 min。用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop Technologies)測定濃度和純度。

土壤細(xì)菌16S rDNA基因序列的V3與V4 2個可變區(qū)域的PCR擴(kuò)增，采用土壤中總提取的DNA為模板，細(xì)菌通用型引物(5’-CCTACGGGNGGCW GCAG-3’)/(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為： 2.5 μL 細(xì)菌模板 DNA(5 ng·μL-1), 上游引物和下游引物各5 μL(引物濃度1 μmol·L-1)，12.5 μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix。擴(kuò)增程序為： 95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共25次循環(huán)； 最后72 ℃終延伸5 min結(jié)束。采用AMPure XP beads對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

對純化后產(chǎn)物進(jìn)行PCR并加上特定標(biāo)簽序列，為index PCR。反應(yīng)體系為： DNA，Nextera XT Index Primer 1及Nextera XT Index Primer 2各5 μL，2× KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25 μL，PCR Grade water 10 μL。擴(kuò)增程序為： 95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共8次循環(huán)； 最后72 ℃終延伸5 min結(jié)束。將PCR產(chǎn)物再次用AMPure XP beads進(jìn)行純化,所得產(chǎn)物即為16S文庫。

利用qubit定量計和Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer分別對文庫進(jìn)行濃度與片段的質(zhì)檢，參照Illumina文庫構(gòu)建試劑盒(16S Metagenomic Sequencing Library Preparation)指南進(jìn)行文庫的構(gòu)建，將構(gòu)建好的DNA文庫均一化至4 nmol·L-1后等體積混合，將混合好的文庫加入等體積的0.2 mol·L-1NaOH進(jìn)行變性，在Illumina MiSeq(Illumina Inc.,San Diego CA)平臺進(jìn)行2×300的測序模式。

2.5 原始數(shù)據(jù)整理、過濾及統(tǒng)計分析 首先對獲得的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，由于MiSeq平臺采用雙末端測序，因此需對雙端的序列做質(zhì)量過濾，使用FAXTS軟件去掉序列末尾質(zhì)量低于Q15的堿基并使用FLASH軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行合并。

為獲得更高質(zhì)量及更準(zhǔn)確的生物分析結(jié)果，則需要對有效序列進(jìn)行去雜。對后引物也按照不超過2個堿基錯配進(jìn)行過濾； 修剪、去除長度≤200 bp的序列； 最后剔除總堿基錯誤率高于1的序列。

使用UPARSE對按97%的相似性非singleton序列聚OUT的同時檢測并去除其中的Chimeric序列； 將質(zhì)控后的clean reads與OUT中的序列進(jìn)行比較并根據(jù)97%的相似性將clean reads歸并到相關(guān)OTU中。使用UPARSE對優(yōu)質(zhì)序列按相似度≥97%進(jìn)行操作分類單元(OTU)的聚類，選取每個類最長的序列為代表序列。然后調(diào)用RDP-classifier的分類方法，以RDP數(shù)據(jù)庫的序列為訓(xùn)練集對OTU代表序列進(jìn)行注釋，最終得到每個OTU分分類學(xué)信息。利用mothur軟件對所有序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽取到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀疏曲線(rarefaction curve)。同時計算各個林齡樣本的細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Ace)、多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener)(王寶軍等， 2013)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤環(huán)境因子 由表1可以看出，覆蓋經(jīng)營造成雷竹林土壤有機(jī)質(zhì)及N、P、K等養(yǎng)分含量的增加，其中，有機(jī)質(zhì)、全P、有效P含量的增加幅度在42.9%～63.5%之間，全N和速效K含量的最大增值分別達(dá)106%和237.7%。土壤有機(jī)質(zhì)和速效K含量在覆蓋第3年顯著增加(P<0.05)，有機(jī)質(zhì)含量在3年后變動幅度很小，而速效K含量仍保持一定的幅度增加。覆蓋經(jīng)營3年后出現(xiàn) pH顯著下降，覆蓋12年的竹林土壤pH已呈極強(qiáng)酸性。

表1 不同覆蓋年限竹林土壤理化性質(zhì)①Tab.1 The physical and chemical properties of soil with different mulching time

①表中同列不同小寫字母表示 0.05水平的差異性顯著。 Different small letters indicate significant difference among treatment at 0.05 level.

3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)高通量測序結(jié)果統(tǒng)計分析，15個土壤樣本共獲得優(yōu)質(zhì)DNA序列數(shù)280 548條。平均長度為453.5 bp。分布在覆蓋0(CK)、3、6、9、12年的竹林地土壤細(xì)菌DNA優(yōu)質(zhì)序列分別為54 650、56 934、59 623、41 226、68 115條。把相似度水平≥97%的序列聚為一個操作分類單元(OTU)，共獲得598個OTUs。從測定細(xì)菌OTUs的稀釋曲線(圖1) 可以看出，15個樣本的稀釋曲線均趨于平緩，說明測序趨于飽和，測得的數(shù)據(jù)可以反映土壤細(xì)菌群落的真實情況。

圖1 雷竹林土壤細(xì)菌OTUs稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil bacteria OTUsCK、3、6、9、12分別表示覆蓋0、3、6、9、12年竹林土壤，Y1、Y2、Y3為3個重復(fù)。CK，3，6，9，12 mean the soil mulching with 0,3,6,9，12 years, respectively，Y1, Y2, Y3 mean 3 replicates.下同。The same below.

調(diào)用RDP-classifier的分類方法，對OTU代表序列進(jìn)行注釋，并對所獲得的分類學(xué)信息進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果表明： 在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)占總數(shù)的32.02%，酸桿菌門(Acidobacteria)占總數(shù)的22.89%，放線菌門(Actinobacteria)占總數(shù)的13.19%； 在綱水平上，酸桿菌綱(Acidobacteria)占總數(shù)的25.89%，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)占總數(shù)的16.97%，α-變形菌綱占總數(shù)的15.96%； 在目水平上, 酸桿菌目(Acidobacteriales)占總數(shù)的27.61%,放線菌目(Actinomycetales)占 總 數(shù) 的11.5%，黃色單胞菌目(Xanthomonadales)占總數(shù)的7.82%。雷竹林土壤樣本細(xì)菌OTU目分類水平上的具體信息可見表2。

3.3 土壤細(xì)菌群落組成分析 1) 覆蓋年限對細(xì)菌豐度及多樣性的影響 使用篩選出的V3—V4區(qū)序列，可得到細(xì)菌的豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)(表3)。覆蓋率是指各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低。從表3可以看出，各覆蓋年份的土壤樣品中微生物基因序列的覆蓋率均達(dá)到99%以上，表明所測定序列可以充分反映各采樣區(qū)域細(xì)菌群落的種類和結(jié)構(gòu)。細(xì)菌群落物種的豐度、多樣性分別用Ace指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)表示(朱琳， 2006)。不同覆蓋年限土樣的Ace指數(shù)及Shannon-Wiener指數(shù)存在較大差異,均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。土壤細(xì)菌豐度、多樣性在覆蓋6年時達(dá)到最大值，與CK相比分別提高17.3%和5.27%； 此時，隨著覆蓋年限的繼續(xù)增加，土壤細(xì)菌豐度、多樣性則開始呈現(xiàn)下降的趨勢，其中，多樣性指數(shù)在覆蓋12年時達(dá)到最小值，與CK相比下降了3.37%。

2) 覆蓋年限對土壤主要細(xì)菌群落組成的影響

采用Mothur軟件對不同覆蓋年限土壤細(xì)菌群落在門水平構(gòu)建分層聚類圖(hierarchical heatmap)(圖2),分層聚類圖可以用顏色變化直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來，通過顏色的梯度及相似程度來反映數(shù)據(jù)的相似性和差異性。由圖2可以看出,15個土壤樣品明顯地分成2大類,未經(jīng)覆蓋的竹林土壤的細(xì)菌群落聚為一支，經(jīng)過覆蓋處理后的12個土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較接近，聚為一支。由此可以得出,覆蓋對土壤細(xì)菌在門水平上群落結(jié)構(gòu)影響較大，覆蓋后不同年限間土壤細(xì)菌群落差異不明顯。分層聚類圖中紅色部分是相對豐度較高的門, 從圖中可以看出，酸桿菌門、變形菌門、放線菌門在不同覆蓋年限的土壤中相對豐度均較高。

在門的分類水平上，雷竹林土壤細(xì)菌分布在13個已知細(xì)菌門,除未被分類群體外, 還有2個候選細(xì)菌門。所占豐度在1%以上的門分別為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)和浮霉菌門(Planctomycetes)(表4)。其中，屬于變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門的序列占全部序列的74.13%。衣原體門(Chlamydiae)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、螺旋體門(Spirochaetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)等在不同覆蓋年限雷竹林土壤中均有分布，但其相對豐度極小，均低于1%。

由表4可以看出，隨著覆蓋年限的增加，變形菌門，酸桿菌門，擬桿菌門，綠彎菌門的豐度變化出現(xiàn)了顯著性差異，其中，變形菌門作為百分比最高的細(xì)菌群落，其豐度明顯增加。綠彎菌門則為受覆蓋措施影響最大的細(xì)菌群落。隨著覆蓋年限的增加，土壤酸化加劇，pH由5.23(CK)降至3.42(12年)，土壤中有機(jī)質(zhì)的含量從未覆蓋時的21.75 g·kg-1(CK)上升為為32.61 g·kg-1(9年)，由此造成的影響即是變形菌門的豐度由17.6%上升為40.6%，而綠彎菌門則由未覆蓋時的16.57%(CK)下降為2.03%(9年)。

3.4 土壤細(xì)菌種群與環(huán)境因子RDA分析 采用Canoco 5.0對土壤細(xì)菌種群與環(huán)境因子進(jìn)行分析，在 DCA結(jié)果中，第一排序軸的梯度長度(lengths of gradient)值為 1.247(<2)，則環(huán)境因子對細(xì)菌群落分布的影響較適合用RDA進(jìn)行評估。該排序圖的前兩軸解釋了覆蓋竹林土壤細(xì)菌群落變異程度的88.5%，由此可知，排序軸的前兩軸能夠真實的反應(yīng)環(huán)境因子對細(xì)菌群落的影響程度。

從RDA雙序圖中可以看出土壤有機(jī)質(zhì)，全N、全K，AK對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，裝甲菌門、變形菌門與土壤全鉀相關(guān)性最大； 螺旋菌門、擬桿菌門與土壤中全氮和有機(jī)質(zhì)含量相關(guān)性最大； 綠彎菌門與土壤中pH相關(guān)性最大。

表2 雷竹林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Tab.2 Soil bacterial community structure of P. praecox stand

表3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity indices of soil bacteria community

圖2 不同覆蓋年限土壤門水平上細(xì)菌分層聚類Fig.2 Hierarchical clustering diagram of bacteria at phylum level in the soil with different mulching time

覆蓋時間Mulchingtime/a變形菌門Proteobacteria酸桿菌門Acidobacteria放線菌門Actinobacteria擬桿菌門Bacteroidetes綠彎菌門Chloroflexi厚壁菌門Firmicutes浮霉菌門PlanctomycetesCK17.62c28.83a14.08a2.44b16.57a7.19a1.44a333.62b23.93ab14.48ab10.38ab4.07b3.59a3.00a631.61b18.26b14.63a9.01ab2.84b6.63a3.83a940.62a18.57b6.87b16.76a2.03b1.92a2.14a1237.77ab21.50ab15.33a4.06ab2.63b5.92a4.13a

①表中同列不同小寫字母表示 0.05水平的差異性顯著

Different small letters in the same column indicate significant difference among treatment at 0.05 level.

圖3 基于16S rDNA文庫的RDA雙序Fig.3 RDA biplots based on 16S rDNA cloning librariesAcid：酸桿菌門Acidobacteria；Acti：放線菌門Actinobacteria；Bact：擬桿菌門Bacteroidetes；Firm：厚壁菌門Firmicutes；Verr：疣微菌門Verrucomicrobia；Gemm：芽單胞菌門Gemmatimonadetes；Plan：浮霉菌門Planctomcetes；Nitr：硝化螺旋菌門Nitrospirae；Chlo：綠彎菌門Chloroflexi；Cyan：藍(lán)藻菌門Cyanobacteria；Prot：變形菌門Proteobacteria; Arma：裝甲菌門Armatimonadetes；Spir：螺旋體門Spirochaetes.

4 討論

4.1 覆蓋對土壤環(huán)境因子的影響 不同覆蓋年限雷竹林土壤pH值呈逐年下降的趨勢，覆蓋初期與未覆蓋竹林并無顯著性差異，覆蓋進(jìn)行到第12年時，pH值出現(xiàn)顯著性差異，由5.23(0年)降至3.42。覆蓋12年后竹林土壤有機(jī)質(zhì)、全P、全K含量的增加幅度分別為52.4%、38.8%、63.3%，全N含量的最大增值達(dá)106.59%。土壤有機(jī)質(zhì)在覆蓋3年后就出現(xiàn)顯著增加，但在覆蓋6年后增幅趨于平緩； 土壤中AP、AK的含量則一直保持較高的增長幅度。

4.2 覆蓋對土壤細(xì)菌群落的影響 在覆蓋6年后土壤中，土壤細(xì)菌的Ace指數(shù)及Shannon-Wiener指數(shù)達(dá)到最大值。覆蓋前期大量有機(jī)物質(zhì)的加入，帶來養(yǎng)分元素含量的顯著增大，對土壤細(xì)菌的繁殖、增加具有正向的作用(劉文娜等， 2006)。在覆蓋12年后土壤細(xì)菌的OTU值、Ace指數(shù)及Shannon-Wiener指數(shù)都有一定程度的下降，但與覆蓋初期相比并無較大差別，這可能是由于長期覆蓋施肥以及覆蓋后部分覆蓋物的還田處理使土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)及通氣性等較未覆蓋前發(fā)生了較大變化，使得土壤細(xì)菌豐度及多樣性達(dá)到了一個新的相對穩(wěn)定的狀態(tài)(王伏偉等， 2015)。

對不同覆蓋年限土壤細(xì)菌群落進(jìn)行分層聚類分析，未覆蓋林地土壤聚為一類，覆蓋后竹林土壤聚為一類，說明覆蓋對土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生一定影響。對調(diào)查林分中各竹林土壤細(xì)菌種群的平均值比較，變形菌門豐度隨著覆蓋時間的增加出現(xiàn)明顯增加，由17.60%(對照)上升為37.77%(覆蓋12年)，尤其是該類細(xì)菌中α-變形菌綱、γ-變形菌綱的種群占多數(shù)。變形菌門細(xì)菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，其中α-變形菌包括大量的參與C、N循環(huán)的細(xì)菌、與植物共生的細(xì)菌(如根瘤菌屬)及能夠抑制植物致病菌的有益菌等重要菌種，如變形菌門中α綱的紅螺菌大多為光合細(xì)菌和固氮細(xì)菌，這些細(xì)菌的增加能對生態(tài)系統(tǒng)氮的穩(wěn)定性和土壤能量的平衡起到重要的作用，對植物生長具有重要意義； Zhang等(2014)通過調(diào)查湖南、湖北等4個省份的土壤細(xì)菌認(rèn)為，變形菌細(xì)菌的增加同土壤有機(jī)質(zhì)含量關(guān)系密切。γ-變形桿菌有很強(qiáng)的適應(yīng)性，其中包括很多來源于動物排泄物的病原菌，如豬糞等有機(jī)肥的大量投入可能帶來這些菌群的增加，研究表明，γ-變形桿菌中的部分細(xì)菌(如假單胞菌屬)，能夠溶解土壤中的難溶性磷酸鹽(Elliottetal., 1987)。因此，變形菌門相對豐度的大幅增加在一定程度上表明土壤中有機(jī)質(zhì)及C、N等養(yǎng)分的積累量升高，隨著覆蓋物的分解和有機(jī)肥的大量投入，土壤的微生物群落構(gòu)成變得復(fù)雜。酸桿菌門是新近被分出的一門細(xì)菌，屬于嗜酸菌，在自然界的各種環(huán)境中都廣泛存在，該類菌可在一些特殊的生境中生存，包括酸雨灌溉、重金屬污染的土壤及其他一些極端環(huán)境(Barnsetal., 2007)，但在生態(tài)系統(tǒng)中的具體作用尚未得到很好的研究結(jié)論。本研究表明：該類細(xì)菌隨著覆蓋年限的增加，土壤pH出現(xiàn)顯著的下降，土壤酸化十分嚴(yán)重，從理論上來說，這一環(huán)境應(yīng)更加適合嗜酸菌的繁殖。但本研究中酸桿菌種群出現(xiàn)下降的趨勢，這一現(xiàn)象可能同土壤其他環(huán)境因子的改變有關(guān)，長期覆蓋后其他環(huán)境因子的變化對酸桿菌繁殖造成的遏制效果要大于土壤酸化帶來的正向作用。酸桿菌種群更傾向于生長在于可溶性有機(jī)碳含量較低的土壤中(Suletal., 2013)，因此，在長期覆蓋后，土壤中酸桿菌的下降可能表明土壤中易分解碳含量上升，土壤固碳能力下降。Magill等(2000)對森林土壤的研究表明，土壤中N含量的增加會使酸桿菌門的多樣性增加，其中Gp1和Gp3對土壤中的N循環(huán)起重要作用，Gp1和Gp3能夠促進(jìn)土壤中硝酸鹽和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化，從而降低土壤中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量。Acacio等(2013)把酸桿菌劃分成若干種群，發(fā)現(xiàn)酸桿菌中不同種群對土壤環(huán)境因子變化反應(yīng)具有差異性，一些種群同土壤可交換性鋁的含量成正相關(guān)，但一些種群同土壤中Ca、Mg、Mg及B含量的相關(guān)性更密切，對酸桿菌種群的特征能夠指示土壤不同環(huán)境因子的變化。放線菌屬于革蘭氏陽性菌，大部分屬于腐生菌，Crawford等(1978)的研究表明放線菌門的部分細(xì)菌種群能夠產(chǎn)生分解木質(zhì)素的酶，具有分解木質(zhì)素和纖維素的能力，起到分解植物有機(jī)殘體的作用。放線菌門相對豐度在覆蓋過程中整體呈上升趨勢，這表明土壤中植物纖維的積累量在逐步升高，覆蓋時竹葉、礱糠等覆蓋物的部分還田是土壤中植物纖維的主要來源。同時放線菌門還具有共生固氮和解磷作用(Elliottetal., 1987)，其豐度的上升也可能是土壤N、P含量升高的標(biāo)志。

覆蓋經(jīng)營使綠彎菌門的相對豐度顯著下降，覆蓋后的相對豐度只有對照的1/8左右，覆蓋后3～12年該值的數(shù)據(jù)基本保持穩(wěn)定。綠彎菌門是一類通過光合作用產(chǎn)生能量的細(xì)菌，它具有兼性厭氧的特點，在光合作用中不產(chǎn)生氧氣，綠彎菌門的大幅度減少可能同土壤中有機(jī)質(zhì)增加及覆蓋導(dǎo)致的光照條件改變有關(guān)(Fiereretal., 2007； Xunetal., 2016)。

4.3 土壤細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子的關(guān)系 土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組分，可將有機(jī)質(zhì)分解為腐殖質(zhì)，并釋放養(yǎng)分，參與土壤C、N、P、S等元素的循環(huán)過程，pH、有機(jī)質(zhì)組成、土壤養(yǎng)分及人為活動會對其群落結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生主要影響。RDA結(jié)果顯示，土壤有機(jī)質(zhì)，N、P、K等養(yǎng)分含量的變化均會對土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生影響，變形菌門、 擬桿菌門、綠彎菌門為土壤中豐度較高的細(xì)菌種群，其相對豐度分別與土壤中K、N和有機(jī)質(zhì)含量、pH相關(guān)，變形菌門、 擬桿菌門為土壤中相對豐度升高的屬，而綠彎菌門為相對豐度降低的屬，因此在覆蓋過程中應(yīng)當(dāng)適當(dāng)降低土壤N肥和K肥的使用量，同時在覆蓋過程中適當(dāng)增施熟石灰或堿性肥料，提高土壤酸堿度。

5 結(jié)論

覆蓋措施對土壤性質(zhì)和主要養(yǎng)分含量產(chǎn)生了一定影響，導(dǎo)致表層土壤pH呈逐年降低的趨勢，土壤酸化的現(xiàn)象在長期覆蓋的竹林中尤為明顯； 同時雷竹林土壤有機(jī)質(zhì)及N、P、K等養(yǎng)分含量也逐漸增加。受覆蓋措施的影響，雷竹林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、豐度及多樣性均發(fā)生變化； 短期覆蓋能夠促進(jìn)土壤細(xì)菌的繁殖，對其豐度及多樣性帶來一定的促進(jìn)作用，但在覆蓋后期，其促進(jìn)作用逐漸減弱，微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性趨于穩(wěn)定。變形菌門、酸桿菌門、放線菌門在竹林土壤細(xì)菌群落中占據(jù)主要地位，隨著覆蓋年限的增加，其豐度呈現(xiàn)不同的變化趨勢。土壤中各種養(yǎng)分元素含量的變化對土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生了不同的影響，這是因為土壤細(xì)菌種類在土壤養(yǎng)分循環(huán)過程中各自的功能不同； 且細(xì)菌對土壤養(yǎng)分的變化較為敏感，通過對其群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究，能夠及時準(zhǔn)確地分析土壤養(yǎng)分的變化，對改善竹林土壤質(zhì)量、提高竹林生產(chǎn)力具有重要意義。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

InfluenceofMulchingManagementonSoilBacterialStructureandDiversityinPhyllostachyspraecoxStands

Zhai Wanlu Zhong Zheke Gao Guibin Yang Huimin

(ChinaNationalBambooResearchCenterHangzhou310012)

【Objective】 In order to provide a scientific basis for evaluating the management measure ofPhyllostachyspraecoxstand with mulching in winter, the impact of mulching on soil bacterial structure and biodiversity was studied.【Method】 Soil samples fromP.praecoxstands with different mulching age (0, 3 a, 6 a, 9 a, 12 a) at Jinshan, Yuhang, Zhejiang Province were collected. V3-V4 regions of 16S rDNA from soil bacteria were sequenced by Illumina Miseq High Throughput Sequencing technique and soil bacterial groups were identified. The soil nutrient indexes such as total N, total P and OM were analyzed with standard experimentalmethod . The impact on soil bacterial community and diversity through mulching management were analyzed.【Result】 1) There were 280 548 bacterial 16S rDNA sequences and 598 OTU types obtained from the soil samples. The dominant bacterial communities at phyum level were Proteobacteria, Acidobacteria and Actinobacteria, and their relative abundance was 30.80%, 22.0% and 13.9%, respectively. 2) The diversity (Shannon Wiener Index) and abundance (Ace Index) of soil bacterial community showed a greater difference among different mulching ages. At the initial stage Shannon Wiener index and Ace showed increasing tendency with the mulching age. These indexes reached the maximum at 6 years of mulching. After that time these indexes showed a decline, and these values were very close to the control at the 12 years of mulching. 3) The mulching management showed certain impact on the bacterial structure in the soil. The relative abundance of Proteobacteria was raised from 17.60%(CK) to 37.77%(12 a), and the relative abundance of Acidobacteria showed a downward trend, while the Actinobacteria hadlittle change. 4) The changes of soil physical and chemical property caused by mulching management influenced the bacterial community structure. With the increase of mulching time, the relationship between the bacterial structure and the environmental factors became more complicated. Mulching management caused a severe soil acidification. The pH of the soil in control and 12 a mulching were 5.23 and 3.42, respectively. However, the abundance of Acidobacteria in the soil, which is known as a kind of acidophil bacteria, was decreased. 5) The first two RDA axes collectively explained 88.5% of the species-environment variation. The diversity of Proteobacteria and Bacteroidetes was correlated with available K, total N and OM. The diversity of Chloroflexi was correlated with pH.【Conclusion】 This study showed that the mulching management had a marked influence on the structure and diversity of soil bacterial communities. The short-term mulching (less than 6 a) could increase the abundance and diversity of soil bacteria. However, with the increase of mulching age, the abundance and diversity of soil bacteria were decreased. Theresult indicated that the soil bacterial community was closely related to environmental variables．Changes of soil environmental factors will affect the soil bacterial community’s structure. Analysis of soil bacterial diversity in soil can analyze the degree of soil degradation from the view of microorganism, and provide theoretical basis for soil remediation ofP.praecoxstands.

Phyllostachyspraecox； mulching management of bamboo stand； soil microbe； bacterial biodiversity； temporal change

S718.83

A

1001-7488(2017)09-0133-10

10.11707/j.1001-7488.20170916

2016-01-14；

2016-09-12。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201504407)。

*鐘哲科為通訊作者。