梁鳳蘭,趙海洲,練益成,黃政貴

（1.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶526061；2.肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶526061；3.廣東省湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東湛江524022）

TLC法快速辨別與真?zhèn)舞b定川黃柏和關(guān)黃柏

梁鳳蘭1,趙海洲1,練益成2,黃政貴3

（1.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶526061；2.肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶526061；3.廣東省湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東湛江524022）

為了建立中藥材川黃柏(Phellodendri Chinense)和關(guān)黃柏(Cortex Phellodendri Amurensis)的快速辨別和真?zhèn)舞b定方法，基于川黃柏含極少量黃柏酮而關(guān)黃柏含大量黃柏酮，同時(shí)川黃柏和關(guān)黃柏兩者均含有鹽酸小檗堿，用薄層色譜法中的分級展開法，在日光燈下將樣品與黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品對照，通過兩者顯著差異性快速辨別川黃柏和關(guān)黃柏，同時(shí)在紫外燈下與鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品對照實(shí)現(xiàn)真?zhèn)舞b定.該方法操作簡單，具有快速，分離效果和重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn).薄層色譜法能夠應(yīng)用于川黃柏與關(guān)黃柏的快速辨別和真?zhèn)舞b定，有助于該類中藥材的質(zhì)量控制.

川黃柏；關(guān)黃柏；薄層色譜法；差異性辨別；真?zhèn)舞b定

黃柏為蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮，習(xí)稱“川黃柏”.關(guān)黃柏為蕓香科植物黃檗的干燥樹皮[1].川黃柏和關(guān)黃柏是臨床常用中藥，味苦性寒，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等作用[2].川黃柏與關(guān)黃柏的成份有較大的區(qū)別，脂肪酸的組成有比較大的差異[3].《中國藥典》將川黃柏與關(guān)黃柏分列為兩種藥材，但沒有記載川黃柏與關(guān)黃柏的快速辨別和真?zhèn)舞b定方法[3]，只有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)川黃柏或關(guān)黃柏的鑒別研究[4-11].基于薄層色譜法對市場上流通的川黃柏、關(guān)黃柏中藥材進(jìn)行快速辨別和真?zhèn)舞b定，目前還未有報(bào)道.

薄層色譜法是根據(jù)同種吸附劑對各種成分的吸附能力不同，使移動(dòng)相(溶劑)流過固定相（吸附劑）的過程中，連續(xù)不斷地重復(fù)吸附和解吸附，以完成各種成分互相分離，定性分析物質(zhì)成分的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生化、衛(wèi)生、環(huán)境、食品、化工等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用.薄層色譜法的展開方法分為多級展開、分級展開和雙向展開，本研究采用分級展開方法，以同塊硅膠板沿同方向，依次使用2種展開劑進(jìn)行展開，從而達(dá)到對吸附性質(zhì)或分配性質(zhì)存在著明顯區(qū)別的組分進(jìn)行分離[12-16].

由于川黃柏含極少量黃柏酮而關(guān)黃柏含大量黃柏酮，且川黃柏和關(guān)黃柏均含有鹽酸小檗堿，而偽品不含鹽酸小檗堿，用薄層色譜法中的分級展開法，在第一級展開時(shí)在紫外燈下與鹽酸小檗堿對照品對照實(shí)現(xiàn)真?zhèn)舞b定.在第二級展開后噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇溶液顯色劑顯色，并與黃柏酮對照品對照，通過差異性來快速辨別川黃柏和關(guān)黃柏.為建立快速鑒定藥材真?zhèn)?，辨別川黃柏與關(guān)黃柏的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，有利于該類中藥材的質(zhì)量控制.

1 儀器與藥品

1.1 儀器

WFH-201B紫外透射反射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；定量毛細(xì)管（1 μL和2 μL）.

1.2 樣品

川黃柏（四川），川黃柏（四川，批號：D1409030），川黃柏（四川,批號：150701），川黃柏（四川，帶皮），川黃柏（廣西），關(guān)黃柏（吉林），關(guān)黃柏（內(nèi)蒙古），關(guān)黃柏（正品）.桐樹皮染色川黃柏偽品，楊樹皮染色川黃柏偽品.

1.3 對照品

川黃柏對照藥材（批號：12150-201105），關(guān)黃柏對照藥材（批號：120937-200506），黃柏酮對照品（批號：111923-201303），鹽酸小檗堿對照品（批號：200210）.

1.4 試劑和藥品

硅膠G板和H板（青島海洋化工集團(tuán)公司），其他試劑均為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層板制備

將硅膠G板和H板置于105°C烘箱內(nèi)進(jìn)行30 min活化.

2.2 樣品溶液的配制

分別取1.2中的樣品各0.2 g置于100 mL錐形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯，超聲處理30 min，過濾，水浴濃縮至1 mL，即得樣品溶液，備用.

2.3 對照品的配制

取0.2 g的川黃柏與關(guān)黃柏對照藥材分別置于2個(gè)100 mL錐形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯，超聲處理30 min，過濾，水浴濃縮至1 mL，即得對照藥材溶液，備用.

取黃柏酮對照品適量，加入甲醇配制成1 mL含1 mg黃柏酮的對照品溶液，備用.

取鹽酸小檗堿對照品適量，加入甲醇配制成1 mL含1 mg鹽酸小檗堿的對照品溶液，備用.

2.4 薄層鑒別方法的建立

2.4.1 展開劑的選擇

取活化后的商品硅膠G板，點(diǎn)樣(點(diǎn)樣量均為2 μL)，在展開劑中分別展開（圖1）.

由圖1所示，展開劑b和e的分離效果較好，清晰且無拖尾，Rf值約為0.6.因此選用氯仿-甲醇（體積比7:1）展開劑為一級展開劑，石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3）展開劑為二級展開劑.

圖1 不同展開劑展開效果對比

2.4.2 顯色方法的選擇

試驗(yàn)對于川黃柏與關(guān)黃柏的分辨以及真?zhèn)舞b別，基于是否含有鹽酸小檗堿和黃柏酮含量，因此，如何選擇這兩種物質(zhì)的顯色方法十分重要.鹽酸小檗堿可以用活化后的硅膠G板點(diǎn)樣，選用氯仿-甲醇（體積比7:1）為一次展開劑展開晾干后，通過觀察365 nm波長處紫外光斑點(diǎn)來判定結(jié)果.黃柏酮的顯色方法有：用活化后的硅膠G板點(diǎn)樣，選用氯仿-甲醇（體積比7:1）為一級展開劑展開晾干后，再以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3）為二級展開劑展開后晾干，噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇顯色劑在110°C下加熱至斑點(diǎn)清晰（圖2a），或者噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%香草酫溶液，置于110°C下加熱，直至斑點(diǎn)清晰（圖2b）.

圖2 顯色劑顯色效果對比

由圖2可見，a中色譜斑點(diǎn)清晰，顯色方法較好，b中色譜斑點(diǎn)非常模糊，難以分辨，所以選用a顯色方法.2.4.3 點(diǎn)樣量的選擇

取黃柏酮對照品和鹽酸小檗堿對照品于2塊薄層板上從左至右依次點(diǎn)樣，分別是0.5 μL、1 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL、3.5 μL和4 μL，并以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3）和氯仿-甲醇（體積比7:1）展開劑對上述對照品展開，結(jié)果如圖3所示.

圖3 點(diǎn)樣量對比

由圖3所示，黃柏酮從第四個(gè)點(diǎn)開始斑點(diǎn)均顯示清晰，鹽酸小檗堿從第二個(gè)點(diǎn)開始斑點(diǎn)均顯示清晰，因此選擇2 μL為黃柏酮對照品點(diǎn)樣量，1 μL為鹽酸小檗堿對照品點(diǎn)樣量.

2.4.4 溫度的影響

分別取黃柏酮和鹽酸小檗堿對照品，點(diǎn)樣量為2 μL和1 μL；取川黃柏對照藥材、關(guān)黃柏對照藥材和川黃柏、關(guān)黃柏樣品，點(diǎn)樣量為2 μL，點(diǎn)于活化后的薄層板上，分別在 6 °C（圖4 a和b）、30 °C（圖4 c和d）中同時(shí)展開，取出晾干，在365 nm紫外光下觀察熒光，然后噴質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇顯色劑顯色，在日光下觀察.

圖4 不同溫度下效果對比

如圖4所示，在一定的相對濕度（60%）下，a-d的Rf值均約為0.55，表明在6～30°C溫度范圍內(nèi)對鑒別無明顯的影響.

2.4.5 濕度的影響

在活化后的薄層板上點(diǎn)樣黃柏酮對照品2 μL，關(guān)黃柏樣品2 μL，鹽酸小檗堿對照品1 μL，然后在不同相對濕度（20%、50%和80%）的層析缸中分別展開，顯色，檢視（表1和圖5）.

表1 不同相對濕度條件

圖5 不同相對濕度下對比

結(jié)果顯示，相同溫度（28 °C）下，相對濕度為20%（a、d）、50%（b、e）和80%（c、f）時(shí)，對應(yīng)的Rf值分別為0.72、0.64和0.55，可見相對濕度會(huì)影響展開效果：相對濕度越高，對應(yīng)的Rf值就越?。幌鄬穸仍降?，色譜斑點(diǎn)變得模糊且分散.因此，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)控制相對濕度為45%～60%.

2.4.6 溶劑的影響

由于黃柏酮與鹽酸小檗堿均溶于甲醇和乙酸乙酯，因此分別使用甲醇和乙酸乙酯配制對照品溶液與釋稀樣品溶液，進(jìn)而比較其對展開效果的影響，由圖6所示，2種溶劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無明顯影響.

圖6 乙酸乙酯、甲醇對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

2.4.7 展開劑的預(yù)飽和時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

分別取黃柏酮對照品，川黃柏樣品各2 μL，鹽酸小檗堿對照品1 μL點(diǎn)于活化后的薄層板，比較不同預(yù)飽和時(shí)間（5 min和30 min）對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，由圖7可知兩者的Rf值均為0.4，而b、d的斑點(diǎn)更為清晰，分離效果更好，因此預(yù)飽和時(shí)間選擇30 min為佳.

圖7 預(yù)飽和時(shí)間對比

2.5 樣品檢測

取不同的10種樣品溶液在常溫（25°C）和相對濕度（61%）的條件下，與川黃柏、關(guān)黃柏對照藥材、黃柏酮對照品，在預(yù)制硅膠G板上點(diǎn)樣，一次展開劑為氯仿-甲醇（體積比7:1），二次展開劑為石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3），展開后噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇顯色劑顯色.結(jié)果如圖8所示，圖8a和b中3～5和11與c和d中3的樣品中均含有黃柏酮，表明川黃柏（廣西）是關(guān)黃柏；而2個(gè)偽品（圖a和b中的12，圖8c和d中的7）均不含鹽酸小檗堿與黃柏酮，此結(jié)果與高效液相色譜分析結(jié)果一致，表明該方法適合于關(guān)黃柏、川黃柏的快速鑒別.

圖8 基于TLC法的樣品檢測結(jié)果

3 結(jié)果與討論

目前川黃柏和關(guān)黃柏的鑒別是通過對川黃柏與關(guān)黃柏的來源、藥材性狀、顯微鑒別等方面進(jìn)行辨別[3]，但它們性狀極為相似，還需要用到顯微鑒別，步驟較為復(fù)雜且對鑒別人員的要求較高；同時(shí)，在川黃柏藥材薄層色譜特征鑒別研究[9]中，雖然做出了對川黃柏和關(guān)黃柏的快速鑒別，但無真?zhèn)舞b別判斷，且其中的顯色方法重復(fù)性較差.研究采用薄層色譜法中二級展開方法，在同一薄層硅膠G板上，以第一次展開劑為氯仿-甲醇（體積比7:1），在365 nm波片下與鹽酸小檗堿對照品色譜圖比較鑒別川黃柏真?zhèn)?，以第二次展開劑為石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3），展開后噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇顯色劑顯色，與黃柏酮對照品色譜圖比較進(jìn)行川黃柏與關(guān)黃柏辨別.該方法不但可以鑒別川黃柏及關(guān)黃柏的真?zhèn)?，還能進(jìn)一步辨別川黃柏與關(guān)黃柏，且對人員設(shè)備要求低，具有前處理簡便快捷、成本低、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢，為川黃柏及關(guān)黃柏的質(zhì)量控制及市場監(jiān)管提供了有效手段.

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:146-147,305-306.

[2] 張冠英,董瑞娟,廉蓮.川黃柏、關(guān)黃柏的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,29(10):812-821.

[3] 薛娟,張宏偉,孫宜春,等.川黃柏與關(guān)黃柏中脂肪酸成分的組成及差異[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(8):220-222.

[4] 宋兵雙,謝昭明.HPLC法對黃柏不同期采收藥材不同部位的小粟堿含量比較研究[J].湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2000,6(l):38.

[5] 黃位猛.黃柏和關(guān)黃柏的鑒別[J].科教導(dǎo)刊,2014(7):191-202.

[6] 貢濟(jì)宇,趙躍剛,張皎月,等.不同產(chǎn)區(qū)關(guān)黃柏的質(zhì)量分析[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2003,31(4):26-27.

[7] 朱志明,賴瀟瀟,蘇慕霞.不同產(chǎn)地黃柏及關(guān)黃柏有效成分的含量測定[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2011,18(1):106-108.

[8] 方清茂,曹浩,舒光明.川黃柏中鹽酸小檗堿的含量及其道地性研究[J].華西藥學(xué)雜志,2004,19(4):275-276.

[9] 祝晨蔯,林朝展.黃柏藥材薄層色譜特征鑒別研究[J].廣東藥學(xué),2004,14(1):8-9.

[10] 孫毓慶,王延琮,林樂明,等.薄層掃描法及其在藥物分析中的應(yīng)用[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1990:27-30.

[11] 曾鎮(zhèn)廣.薄層色譜中展開劑的選擇[J].新課程學(xué)習(xí),2010(7):18.

[12] 何志昂,王權(quán).淺談TLC中展開劑的選擇[J].中國高新技術(shù)企業(yè),2009(7):44-45.

[13] 周同惠.紙色譜和薄層色譜[M].北京:科學(xué)出版社,1989:17.

[14] 陳巖.中華人民共和國藥典中藥薄層色譜彩色圖譜集[M].廣州:廣東科技出版社，1993:2-6.

[15] 劉琬暉,嚴(yán)銘銘,趙大慶.硅膠薄層層析展開劑構(gòu)成的變化對不同極性成分Rf值的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(3):20-21.

[16] Szaboles N,Dallenbach-Tolke K,Sticher O.The‘PRISMA’optimization system in planar chromatography[J].J.Planar.Chromatogr.,1988,1(4):336-342.

Rapid Distinguishment and Identification of Cortex Phellodendri Chinenseand Cortex PhellodendriAmurensis Based on TLC

LIANG FengLan1,ZHAO HaiZhou1,LIAN Yicheng2,HUANG ZhengGui3
(1.School of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China;2.School of Food and Pharmaceutical Engineering,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China;3.Zhanjiang Institute for Food and Drug Control,Zhanjiang,Guangdong 524022,China)

The method of grading expansion in TLC is used to establish a method for rapid distinguishment and identification ofCortex Phellodendri ChinenseandCortex Phellodendri amurensisascortex phellodendri amurensiscontains plenty of obacunone butcortex phellodendri chinensecontains a little,and bothcortex phellodendri chinenseandcortex phellodendri amurensiscontain berberine hydrochloride.Cortex phellodendri chinenseandcortex phellodendri amurensisare rapidly distinguished based on the significant differences comparing the two samples withobacunonestandard under the light.The identification of authenticity is achieved by comparing the samples withberberinehydrochloride standard under the UV lamp.This method is easy,effective and good at reproducibility of thin layer chromatography.TLC method can be used in the rapid distinguishment and identification ofcortex phellodendri chinenseand cortex phellodendri amurensis,benefiting the supervision and inspection of these Chinese medicinal materials.

Cortex Phellodendron;Cortex Phellodendron Amurensis;TLC;differential distinguishment;identification

R927

A

1009-8445（2017）05-0044-08

2017-02-26

梁鳳蘭（1982-），女，肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)師.

黃政貴（1982-），男，廣東省湛江市食品藥品檢驗(yàn)所.

（責(zé)任編輯：姜學(xué)霞，張寶杰）