王彩霞， 吳紹強(qiáng)**， 林祥梅， 王素華， 馮春燕， 徐 賡

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029； 2.浙江省溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 溫州 325027；3.山東省沂南縣畜牧獸醫(yī)局， 山東 沂南276300)

貝類(lèi)包納米蟲(chóng)病焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用*

王彩霞1， 吳紹強(qiáng)1**， 林祥梅1， 王素華2， 馮春燕1， 徐 賡3

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029； 2.浙江省溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 溫州 325027；3.山東省沂南縣畜牧獸醫(yī)局， 山東 沂南276300)

以焦磷酸測(cè)序技術(shù)為檢測(cè)平臺(tái)，在研究包納米蟲(chóng)基因特性的基礎(chǔ)上，選擇包納米蟲(chóng)(Bonamiaspp.)DNA序列的保守區(qū)域，利用焦磷酸測(cè)序軟件設(shè)計(jì)專(zhuān)用引物。以O(shè)IE推薦的PCR方法構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板，建立了包納米蟲(chóng)的PCR-焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法，確定測(cè)得序列為包納米蟲(chóng)序列，經(jīng)酶切位點(diǎn)分析可鑒別感染種類(lèi)。以建立的包納米蟲(chóng)PCR-焦磷酸測(cè)序方法對(duì)進(jìn)口牡蠣(Ostrea gigas thunberg)樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以O(shè)IE推薦的PCR-RFLP方法進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，本研究建立的PCR-焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法可以在基因序列水平上準(zhǔn)確鑒定樣品是否為包納米蟲(chóng)感染以及感染種類(lèi)，檢測(cè)結(jié)果與OIE推薦方法的檢測(cè)結(jié)果一致。研究結(jié)果表明，本研究建立的檢測(cè)方法可應(yīng)用于口岸包納米蟲(chóng)感染情況的檢測(cè)鑒定。

牡蠣；包納米蟲(chóng)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；焦磷酸測(cè)序；檢測(cè)；鑒定

牡蠣包納米蟲(chóng)病是由牡蠣包納米蟲(chóng)(Bonamiaostreae)、殺蠣包納米蟲(chóng)(B.exitiosa)等在牡蠣(Oyster)血細(xì)胞內(nèi)寄生或者游離在結(jié)締組織、鰓、內(nèi)臟或套膜上皮中而引起貝類(lèi)的一種嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的包納米蟲(chóng)包括5個(gè)種，除主要寄生在歐洲牡蠣體內(nèi)的牡蠣包納米蟲(chóng)(B.ostreae)、殺蠣包納米蟲(chóng)(B.exitiosa)[1]外，還有寄生在悉尼牡蠣體內(nèi)的魯?shù)婪虬{米蟲(chóng)(B.roughleyi)[2]、美國(guó)牡蠣體內(nèi)的成孢包納米蟲(chóng)(B.perspora)[3]和澳大利亞牡蠣體內(nèi)的包納米蟲(chóng)未定種(Bonamiasp.)[4]。目前，除牡蠣包納米蟲(chóng)、殺蠣包納米蟲(chóng)為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)規(guī)定的檢疫性疫病外，其它3種均為非檢疫性寄生蟲(chóng)[5]。1980年，Pichot等[6]指出，牡蠣包納米蟲(chóng)是造成歐洲牡蠣大量死亡的重要原因之一，此后，人們對(duì)牡蠣包納米蟲(chóng)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)牡蠣包納米蟲(chóng)是一種軟體動(dòng)物血液原蟲(chóng)。1987年愛(ài)爾蘭科克港(Cork)發(fā)生牡蠣包納米蟲(chóng)病，死亡率達(dá)90%；1989年，愛(ài)爾蘭戈?duì)栱f海峽(Galway)的牡蠣感染牡蠣包納米蟲(chóng)，死亡率達(dá)70%～80%[7]。1995年，牡蠣包納米蟲(chóng)與折光馬爾太蟲(chóng)(Marteiliarefringens)同時(shí)爆發(fā)，使法國(guó)貝類(lèi)產(chǎn)品從1970年的20 000 t下降至1 800 t[8]。阿根廷圣安東尼奧(San Andonio)海灣自1995年初次報(bào)道以來(lái)，1996年導(dǎo)致33%的牡蠣死亡，1997年的牡蠣累計(jì)死亡率高達(dá)95%，使得牡蠣養(yǎng)殖業(yè)遭到重創(chuàng)[9]，近十幾年來(lái)，牡蠣包納米蟲(chóng)病的流行趨于緩和，雖未出現(xiàn)重大的流行，但在美國(guó)、英國(guó)、愛(ài)爾蘭、加拿大等地時(shí)有發(fā)生，流行率從百分之零點(diǎn)幾到百分之三、四十不等。2004年英國(guó)大不列顛牡蠣養(yǎng)殖場(chǎng)牡蠣大量死亡[10]，經(jīng)證實(shí)，導(dǎo)致此次牡蠣大量死亡的原因正是牡蠣包納米蟲(chóng)，牡蠣包納米蟲(chóng)病已成為對(duì)歐洲和美國(guó)牡蠣養(yǎng)殖業(yè)影響重大的主要疾病之一。2008年3月13日，英國(guó)向OIE報(bào)告，本國(guó)自2007年11月以來(lái)，在北肯特(North Kent)海灣發(fā)生包納米蟲(chóng)感染，受感染貝類(lèi)數(shù)量達(dá)500萬(wàn)，其中發(fā)病10萬(wàn)[11]。2009年，挪威的東阿格德?tīng)柨?AUST-AGDER)在野生牡蠣中發(fā)生包納米蟲(chóng)病，這是挪威首次發(fā)生包納米蟲(chóng)病，感染來(lái)源尚不清楚。2016年澳大利亞首次發(fā)生殺蠣包納米蟲(chóng)病，這是OIE關(guān)于該病最近一次的疫情報(bào)道。

包納米蟲(chóng)能直接在牡蠣間通過(guò)呼吸、食物而傳播，但其生活史尚不清晰，是否存在中間宿主或攜帶者尚未研究清楚。包納米蟲(chóng)的檢測(cè)方法主要包括一些形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)方法。形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法能直接觀察到蟲(chóng)體，操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單，檢測(cè)費(fèi)用低，但檢出率較低，主要有蟲(chóng)體濃縮法、病理切片技術(shù)、組織印記法、組織細(xì)胞學(xué)等；而分子生物學(xué)方法敏感性、特異性較高，能檢測(cè)到牡蠣包納米蟲(chóng)感染的潛伏期，目前主要有原位雜交法、PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[12]以及鑒別物種類(lèi)別的PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法(PCR-RFLP)技術(shù)。但是PCR技術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光PCR無(wú)法獲得基因的序列信息，不能從基因序列水平進(jìn)行鑒定，且容易造成假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，DNA測(cè)序技術(shù)雖然能解決基因序列水平上的檢測(cè)問(wèn)題，但是存在取樣、送樣、結(jié)果反饋等手續(xù)繁瑣以及檢測(cè)速度慢、成本高的缺點(diǎn)，不利于大規(guī)模樣本的快速檢測(cè)。相關(guān)報(bào)道指出，在實(shí)際工作中，如果引物對(duì)選擇得好，很短的一段保守/特異序列的測(cè)定就可滿(mǎn)足對(duì)病原分子診斷的需要[13]。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是1987年發(fā)展起來(lái)的一種能夠進(jìn)行定量序列測(cè)定的新型DNA測(cè)序技術(shù)[14]，具有高通量、快速、敏感等特點(diǎn)，該技術(shù)利于大批量樣本的檢測(cè)[15]。因此，本研究擬利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)建立包納米蟲(chóng)基因序列水平上的檢測(cè)方法，并應(yīng)用于進(jìn)口牡蠣樣品的包納米蟲(chóng)檢測(cè)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品 2016年3月，溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局從荷蘭和法國(guó)進(jìn)口的牡蠣樣品。

陽(yáng)性對(duì)照 牡蠣包納米蟲(chóng)(BonamiaOstreae)DNA由法國(guó)軟體動(dòng)物疾病參考實(shí)驗(yàn)室的Isabelle Arzul教授惠贈(zèng)。

陰性對(duì)照 實(shí)驗(yàn)室保存的采自中國(guó)東部沿海的牡蠣，已經(jīng)OIE方法[16]檢測(cè)確認(rèn)無(wú)包納米蟲(chóng)感染。

1.2 方法

1.2.1 包納米蟲(chóng)焦磷酸測(cè)序方法的建立

1.2.1.1 陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 以法國(guó)軟體動(dòng)物疾病參考實(shí)驗(yàn)室Isabelle Arzul教授惠贈(zèng)的牡蠣包納米蟲(chóng)DNA為模板，采用OIE發(fā)表的根據(jù)牡蠣包納米蟲(chóng)核糖體DNA(rDNA)設(shè)計(jì)的特異性引物Bo：5’-CATTTAATTGGTCGGGCCGC-3’， Boas：5’-CTGATCGTC TTCGATCCCCC-3’，按照OIE推薦的反應(yīng)條件進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為300bp[16]。PCR產(chǎn)物電泳后，采用Agarose Gel DNA Purification Kit(OMEGA)切膠回收目的條帶，并克隆到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR鑒定獲得含有目的基因片段的重組質(zhì)粒并純化，測(cè)濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中包納米蟲(chóng)基因組DNA序列AF262995.1的保守區(qū)域片段，利用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)系統(tǒng)的自帶軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物BoF：5’-CGCTGGTCCTGATCCTTTACT-3’；下游引物BoR：5’-Biotin-TACTAGCACCCCCAATTGTTTC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為168 bp，測(cè)序引物BoS：5’-GAATGCATTAGCATGG-3’。引物由上海英維捷基生物技術(shù)有限公司合成。滅菌水稀釋引物為10μmol/L，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 焦磷酸測(cè)序——PCR擴(kuò)增 以構(gòu)建的包納米蟲(chóng)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，以焦磷酸測(cè)序引物(BoF/BoR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL的PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，10 μmol/L BoF 1 μL，10 μmol/L BoR 1 μL，5 U/μL rTaq 0.5 μL，質(zhì)粒DNA1 μL，ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)；最后72 ℃補(bǔ)充延伸5 min。擴(kuò)增完畢取5 μL PCR產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.1.4 單鏈模板制備及焦磷酸測(cè)序 取PCR產(chǎn)物10 μL加ddH2O補(bǔ)至50 μL，在產(chǎn)物中分別加入磁珠3 μL和結(jié)合緩沖液47 μL，常溫震蕩混勻10 min；打開(kāi)真空泵，將真空預(yù)裝工具在超純水中清洗30 s后抓取磁珠，分別在70%乙醇、變性緩沖液、洗滌緩沖液中清洗5～10 s，將磁珠移至預(yù)先加入0.3 μmol/L測(cè)序引物BoS和退火緩沖液的PSQ96孔板中；將此PSQ 96板放在ThermoPlate上在80 ℃放置3 min，取出自然冷卻至室溫；設(shè)定測(cè)序程序及堿基投放順序和循環(huán)數(shù)，根據(jù)程序給定的劑量，在試劑艙中相應(yīng)的孔中加入酶混合物、底物混合物以及4種堿基，將試劑艙和96孔測(cè)序板放入機(jī)箱進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。反應(yīng)完畢，儀器自動(dòng)給出測(cè)序結(jié)果，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線(xiàn)Blast分析。

1.2.1.5 包納米蟲(chóng)種類(lèi)的確定 根據(jù)OIE手冊(cè)[16]，B.ostreae和B.exitiosa能被限制性?xún)?nèi)切酶HaeII酶切為115和189bp，B.roughleyi不能被酶切；B.ostreae被限制性?xún)?nèi)切酶BglI酶切為120和180bp，B.exitiosa和B.roughleyi不被酶切。對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，如果測(cè)得序列中同時(shí)含有HaeII和BglI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，則可以判斷感染的包納米蟲(chóng)種類(lèi)為B.ostreae；如果測(cè)得序列中只含有HaeII酶切位點(diǎn)，不含有BglI酶切位點(diǎn)，則可以判斷感染的包納米蟲(chóng)種類(lèi)為B.exitiosa；如果測(cè)得序列中不含有HaeII和BglI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，則可以判斷感染種類(lèi)為B.roughleyi或其他非檢疫性包納米蟲(chóng)。

1.2.2 DNA的提取 按照試劑盒DNeasy Blood and Tissue kit(QIAGEN)操作步驟提取荷蘭、法國(guó)以及陰性牡蠣鰓組織樣品的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)進(jìn)口牡蠣樣品 以所建立的包納米蟲(chóng)焦磷酸測(cè)序方法對(duì)荷蘭和法國(guó)進(jìn)口牡蠣樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 PCR-RFLP方法檢測(cè)進(jìn)口牡蠣樣品 以O(shè)IE推薦的PCR-RFLP方法[16]對(duì)荷蘭和法國(guó)進(jìn)口牡蠣樣品進(jìn)行檢測(cè)，并比較焦磷酸測(cè)序方法和PCR-RFLP方法的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1克隆及測(cè)序結(jié)果

將克隆的陽(yáng)性質(zhì)粒送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，結(jié)果經(jīng)在線(xiàn)BLAST分析，與B.ostreae相關(guān)基因的序列一致性達(dá)100%、Bonamiasp.相關(guān)基因的序列一致性達(dá)99%。提取質(zhì)粒，用核酸蛋白測(cè)定儀(NanoDrop ND-100)進(jìn)行測(cè)定，拷貝數(shù)為1.13×1011拷貝/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 包納米蟲(chóng)焦磷酸測(cè)序方法的建立

(M：DL-2000 DNA Marker；1、2：B.ostreae陽(yáng)性重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M：DL-2000 DNA Marker；1、2：The PCR products ofB.ostreaerecombinant plasmid.)

圖1 重組質(zhì)粒焦磷酸測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果
Fig.1 The PCR products electrophoresis result of recombinant plasmid

圖2 重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序結(jié)果

以構(gòu)建的包納米蟲(chóng)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，以焦磷酸測(cè)序引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。取適量PCR產(chǎn)物按照焦磷酸測(cè)序的具體操作說(shuō)明進(jìn)行試驗(yàn)，可很好的測(cè)得重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物的序列，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2，測(cè)得的序列為：AATAATAAGACACGACTTCGGCGCCGCCT-CGGCGGTTGTTTT。將此序列在網(wǎng)上進(jìn)行Balst比對(duì)分析結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖中可以看出序列一致性在66%以上的均為包納米蟲(chóng)的序列，而且與參照序列的一致性可達(dá)100%，因此可以通過(guò)此方法來(lái)確定樣品是否為包納米蟲(chóng)感染。對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，該段測(cè)得序列中既含有BglI酶切位點(diǎn)，又含有HaeII酶切位點(diǎn)，由此可以判定感染種類(lèi)為B.ostreae。

圖3 測(cè)得序列在線(xiàn)Blast分析結(jié)果

2.3 包納米蟲(chóng)PCR-焦磷酸測(cè)序方法的樣品檢測(cè)結(jié)果

采用包納米蟲(chóng)焦磷酸測(cè)序PCR方法對(duì)荷蘭和法國(guó)牡蠣樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行電泳檢測(cè)(見(jiàn)圖4，法國(guó)牡蠣未見(jiàn)擴(kuò)增條帶電泳圖省略)。抽取有目的條帶的樣品和幾個(gè)沒(méi)有目的條帶的樣品進(jìn)行焦磷酸測(cè)序試驗(yàn)。有目的條帶的樣品測(cè)得序列均為：AATAATAAGACACGACTTCGGCGCCGCCTCGGCGGTTGT-TTT；而沒(méi)有目的條帶的樣品則沒(méi)有測(cè)到序列。經(jīng)焦磷酸測(cè)序檢測(cè)，所檢樣品中有6個(gè)樣品有目的條帶，測(cè)序后進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，可見(jiàn)測(cè)得序列中均含有BglI和HaeII兩個(gè)酶切位點(diǎn)，由此可判定6個(gè)樣品均為B.ostreae感染。

2.4 樣品的包納米蟲(chóng)PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果

(1～12為12個(gè)荷蘭牡蠣樣品；M：DL-2000 DNA Marker；陽(yáng)性：B.ostreaeDNA；陰性：無(wú)B.ostreae感染的牡蠣DNA。1～12:12 oysters from Netherlands；M：DL-2000 DNA Marker；Positive control:B.ostreaeDNA; Negative control: oyster DNA withoutB.ostreaeinfection.)

圖4 荷蘭牡蠣的焦磷酸測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.4 The electrophoresis result of pyrosequencing PCR products of oysters from Netherlands

(1～12為12個(gè)荷蘭牡蠣樣品；M：DL-2000 DNA Marker；陽(yáng)性：B.ostreaeDNA；陰性：無(wú)B.ostreae感染的牡蠣DNA；空白：雙蒸水。1～12:12 oysters from Netherlands; M：DL-2000 DNA Marker; Positive control:B.ostreaeDNA; Negative control: oyster DNA withoutB.ostreaeinfection; Blank control: ddH2O.)

圖5 荷蘭牡蠣的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

Fig.5 The electrophoresis result of PCR products of oysters from Netherland

經(jīng)檢測(cè)，荷蘭牡蠣有6份樣品出現(xiàn)了300bp的陽(yáng)性條帶(見(jiàn)圖5)，而法國(guó)牡蠣的17個(gè)樣品均未見(jiàn)預(yù)期大小的目的條帶(圖略)。6份出現(xiàn)目的條帶的荷蘭樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用限制性?xún)?nèi)切酶BglI和HaeII進(jìn)行酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明：目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物可同時(shí)被限制性?xún)?nèi)切酶BglI和HaeII酶切，產(chǎn)生特異的酶切片段(見(jiàn)圖6)。根據(jù)OIE手冊(cè)中的描述[16]可將目的基因鑒定為B.ostreae，該檢測(cè)結(jié)果與焦磷酸測(cè)序結(jié)果一致，2種方法的樣品檢測(cè)結(jié)果均顯示4、5、6、7、8、9號(hào)樣品為牡蠣包納米蟲(chóng)感染陽(yáng)性。

(M：DL-2000 DNA Marker； 4B：4號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的BglI酶切結(jié)果；4H：4號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的HaeII酶切結(jié)果；5B：5號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的BglI酶切結(jié)果；5H：5號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的HaeII酶切結(jié)果；6B：6號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的BglI酶切結(jié)果；6H：6號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的HaeII酶切結(jié)果；7B：7號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的BglI酶切結(jié)果；7H：7號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的HaeII酶切結(jié)果；8B：8號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的BglI酶切結(jié)果；8H：8號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的HaeII酶切結(jié)果；9B：9號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的BglI酶切結(jié)果；9H：9號(hào)樣品PCR產(chǎn)物的HaeII酶切結(jié)果。M: DL-2000 DNA Marker; 4B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.4; 4H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.4; 5B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.5; 5H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.5; 6B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.6; 6H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.6; 7B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.7; 7H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.7; 8B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.8; 8H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.8; 9B: TheBglI enzyme digestion result of the PCR product No.9; 9H: TheHaeII enzyme digestion result of the PCR product No.9.)

圖6 4-9號(hào)荷蘭牡蠣樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切分析結(jié)果
Fig.6 The enzyme digestion result of PCR products of positive oysters from Netherlands

3 討論

Cochennec等[17]報(bào)道被牡蠣包納米蟲(chóng)感染的牡蠣大部分表現(xiàn)正常，一般不出現(xiàn)臨床癥狀，但影響貝類(lèi)的生長(zhǎng)速度。我國(guó)是世界最大的水產(chǎn)貝類(lèi)養(yǎng)殖國(guó)和出口國(guó)，雖然目前尚未報(bào)道有牡蠣包納米蟲(chóng)病的發(fā)生，但其一旦發(fā)生，無(wú)法用藥物根除，在感染的前6年，會(huì)造成很高的流行率和死亡率，將會(huì)對(duì)我國(guó)的貝類(lèi)養(yǎng)殖造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，而且我國(guó)對(duì)牡蠣包納米蟲(chóng)的研究尚處于初級(jí)階段，存在著包納米蟲(chóng)潛在入侵的極大風(fēng)險(xiǎn)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種能夠進(jìn)行定量序列測(cè)定的新技術(shù)，其基本原理是通過(guò)PCR制備待測(cè)序DNA模板，其中PCR的一條引物用生物素標(biāo)記。PCR產(chǎn)物和偶聯(lián)抗生物素蛋白的磁珠孵育，DNA雙鏈經(jīng)堿性分開(kāi)，純化得到含生物素標(biāo)記引物的待測(cè)序單鏈，并和測(cè)序引物結(jié)合成雜交體，然后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序[18]。為做到防患于未然，本研究根據(jù)焦磷酸測(cè)序的原理，根據(jù)GenBank中包納米蟲(chóng)的保守序列利用焦磷酸測(cè)序儀攜帶的引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)測(cè)序?qū)Ｓ玫腜CR擴(kuò)增引物(生物素標(biāo)記)和測(cè)序引物，對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈分離、上機(jī)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，結(jié)果顯示，測(cè)得序列為AATAATAAGA CACGACTTCG GCGCCGCCTC GGCGGTTGTT TT的42個(gè)堿基，網(wǎng)上Blast分析比對(duì)，序列一致性在66%以上的均為包納米蟲(chóng)序列，可以確定這42個(gè)堿基為包納米蟲(chóng)序列，因此可以此判斷是否為包納米蟲(chóng)感染，進(jìn)一步分析測(cè)得序列中是否含有BglI和HaeⅡ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，根據(jù)OIE標(biāo)準(zhǔn)[16]可以區(qū)分包納米蟲(chóng)的感染種類(lèi)。因此，本研究首次建立了包納米蟲(chóng)的PCR-焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法。

本研究采用新建立的包納米蟲(chóng)PCR-焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法對(duì)溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局提供的荷蘭和法國(guó)進(jìn)口牡蠣樣品進(jìn)行包納米蟲(chóng)檢測(cè)，同時(shí)輔以O(shè)IE推薦的PCR-RFLP方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后對(duì)比2種方法的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法均在荷蘭牡蠣中檢測(cè)到了包納米蟲(chóng)感染，而法國(guó)牡蠣中未檢測(cè)到包納米蟲(chóng)感染。焦磷酸測(cè)序方法通過(guò)對(duì)測(cè)得序列的酶切位點(diǎn)分析可以確定感染種類(lèi)為牡蠣包納米蟲(chóng)，同時(shí)PCR-RFLP方法也證實(shí)感染種類(lèi)為牡蠣包納米蟲(chóng)，2種方法的檢測(cè)結(jié)果一致。

綜上，本研究將焦磷酸測(cè)序原理應(yīng)用到水產(chǎn)寄生蟲(chóng)病的檢測(cè)研究中，建立了包納米蟲(chóng)的PCR-焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法，并應(yīng)用于口岸疫病的監(jiān)測(cè)中，不但為水產(chǎn)寄生蟲(chóng)的研究提供了一個(gè)新思路，而且為口岸疫病的高通量檢測(cè)提供了新技術(shù),相信隨著不斷的研究與完善,焦磷酸測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛,該方法的高通量和簡(jiǎn)便快速將會(huì)為日益紛繁復(fù)雜的檢測(cè)業(yè)務(wù)提供很大幫助。

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DevelopmentandApplicationofPyrosequencingMethodDetectingBonamiaspp.CausedDiseaseofBivalves

WANG Cai-Xia1, WU Shao-Qiang1, LIN Xiang-Mei1, WANG Su-Hua2, FENG Chun-Yan1，XU Geng3

(1.The Institute of Animal Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China; 2.Wenzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Wenzhou 325027, China; 3. Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Yinan County of Shandong Province，Yinan 276300, China)

One pair of specific primers were designed and used to pyrosequencing the conserved region ofBonamiaDNA with PyroMark software basing on pyrosequencing platform andBonamiagene characteristics. PCR-pyrosequencing method was established with the recombinant plasmid ofBonamiaspp. constructed with OIE PCR method as the template. The obtained sequence can be identified as the sequence ofBonamiaspp. through Blast analysis, and enzyme digestion site analysis identified the specie asBonamiaspp..The imported oysters were detected with the newly developed method and PCR-RFLP as well as was recommended by OIE. The result showed that the developed PCR-pyrosequencing method can be used to correctly identifyingBonamiaspp. infection and species. The detection results were consistent with that yielded with OIE method. Therefore, this method can be applied to the detection and identification ofBonamiaspp. infection in port.

Oyster;Bonamiaspp.; PCR; pyrosequencing; detection; identification

S944

A

1672-5174(2017)12-053-06

責(zé)任編輯 朱寶象

10.16441/j.cnki.hdxb. 20160408

王彩霞， 吳紹強(qiáng)， 林祥梅, 等. 貝類(lèi)包納米蟲(chóng)病焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 47(12)： 53-58.

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國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD12B02)資助

Supported by National Key Technologies R&D Program(2013BAD12B02)

2016-12-11；

2017-03-08

王彩霞(1982-)，女，助理研究員。E-mail：friday128@sina.com

** 通訊作者：E-mail：sqwu@sina.com