阿布力米提·阿布來提

【中圖分類號】R734.2 【文獻標識碼】B 【文章編號】2095-6851（2017）10-00-01

相關研究結果[1]顯示肺泡上皮細胞向間質細胞轉化（EMT）是A549細胞上皮間葉轉型的重要機制之一，在眾多的參與EMT的細胞因子中，轉化生長因子發(fā)揮著重要的作用，現(xiàn)已有文獻研究結果[2]顯示了蜂毒肽對肺癌（A549細胞）EMT（上皮間葉轉型）過程有一定的影響，可能成為未來治療的研究方向。為了進一步探討蜂毒肽對肺癌（A549細胞）EMT（上皮間葉轉型）過程的影響，筆者總結相關研究資料，現(xiàn)將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 試驗材料 （試劑里加入N-cad，E-cad，Vimentin的有關信息）主要實驗材料包括：蜂毒肽（來源于浙江中醫(yī)藥大學藥學院）；肺腺癌細胞株A549（購自中國醫(yī)學科學院基礎研究所細胞庫）；Ham'F12培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Life Technologies 公司），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Trizol Reagent（美國Invitrogen生命技術有限公司）。

1.2 實驗方法 先進行細胞分組，在進行細胞培養(yǎng)，分組方法為檔細胞當細胞生長融合至70%～80%，用無血清培養(yǎng)基饑餓24h，使細胞靜止于同步期，隨機將細胞分為空白對照組和蜂毒肽組，分別作用24小時、48小時和72小時。分別在24、48、72h時間點收集各組細胞，按試劑盒說明書提取細胞總蛋白：棄培養(yǎng)液，加入細胞蛋白裂解液，BCA試劑盒蛋白定量。各組標本加入蛋白上樣緩沖液行SDS-PAGE電泳，電轉移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1h，兔抗人一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（二抗）室溫2h，ECL發(fā)光顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，利用圖像分析軟件進行分析，以GAPDH為內參，計算目的蛋白與內參灰度的相對比值。Vimentin測定方法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝基纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

1.3 統(tǒng)計指標 空白對照組和蜂毒肽組在72h時間點時統(tǒng)計72小時時間點的E-cad，N-cad，Vimentin蛋白表達統(tǒng)計結果，并以組別為單位計算平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法 選擇spss21.0統(tǒng)計學軟件包進行數(shù)據(jù)分析，對E-cad蛋白表達統(tǒng)計數(shù)據(jù)的分析方法選擇t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。

2 結果

蜂毒肽組在72h時間點時的E-cad蛋白表達均值為（5.65±0.09），明顯高于空白對照組E-cad蛋白表達水平；蜂毒肽組在72h時間點時的N-cad蛋白表達均值為（2.68±0.16）、72小時的Vimentin蛋白表達均值為（1.67±0.22），均明顯低于空白對照組相應數(shù)據(jù)結果（P<0.05），具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果如下表1：

3 討論

由本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果可以看出：蜂毒肽能在蛋白和基因水平增加E-cad的表達，且呈濃度依賴性和時間依賴性，說明洋金花總堿能在一定程度上抑制A549細胞的EMT過程，從而延緩A549細胞上皮間葉轉型進程，具有明顯的臨床作用特點。A549細胞上皮間葉轉型發(fā)病多從肺泡炎開始，作為病變開始的靶細胞除了血管內皮細胞外，還有相當數(shù)量的肺泡細胞，特別是Ⅱ型肺泡上皮細胞。A549細胞與來源于人的原代Ⅱ型肺泡細胞，在病毒誘發(fā)的損傷中TGF-β1mRNA的表達水平、凋亡相關因子Caspse3/7的活性及細胞增殖能力均接近，誘導它增殖和EMT可以模擬Ⅱ型肺泡上皮細胞在病理狀態(tài)下參與體內A549細胞上皮間葉轉型形成過程。蜂毒肽能夠殺傷腫瘤細胞并阻止腫瘤細胞的生長，對正常細胞的生長無明顯的影響。蜂毒素能夠插入K562細胞的細胞膜中，形成孔道，促進Ca2+內流，使細胞內的Ca2+濃度升高，造成細胞裂解，起到直接殺傷K562細胞的作用。普遍認為蜂毒素使細胞線粒體膜溶解，導致腫瘤細胞正常呼吸功能受到抑制，破壞其有氧呼吸的能力，使得腫瘤組織生長受到抑制，起到直接殺傷腫瘤細胞的作用。

維持細胞結構和形態(tài)的細胞骨架由一系列復雜的結構蛋白組成，包括微管（micro tubules）、微絲（micro filaments）和中問絲（intermediate filament，IF）。波形蛋白（vimentin）屬于III型IF，表達在間充質細胞和一些外胚層細胞，如成纖維細胞和內皮細胞高豐度表達，常在分化特異性的中間絲蛋白，如肌間線蛋白（desmin）和神經絲蛋白（neuro filament proteins）表達和整合前形成支撐網(wǎng)絡[5]。IF是細胞骨架結構組成中微絲和微管之外的另一類主要的結構成分，從核到膜呈放射狀分布，在維持和調節(jié)細胞功能中起重要作用，如細胞收縮、遷移、增殖、蛋白合成、基因表達、細胞凋亡和機械力傳導。目前對于中間絲蛋白vimentin在人類惡性腫瘤中的研究也顯示出vimentin參與腫瘤轉移復雜的過程，在腫瘤細胞和內皮細胞的遷移、粘附和上皮癌的上皮問質化（epithelial—mesenchymal transition，EMT）及腫瘤細胞凋亡中均起一定的作用。雖然早期研究認為vimentin的功能不十分重要，因為一些實驗研究發(fā)現(xiàn)vimentin的破損不會影響細胞形狀。應用vimentin抗體后，也不影響細胞的運動和有絲分裂能力，而且vimentin缺陷細胞的生長增殖能力不受影響，在整體動物和組織水平，vimentin缺陷小鼠未顯示明顯的發(fā)育、繁殖、結構和生理學特性差異。然而，最近的研究顯示[6]，vimentin在細胞的許多重要功能中必不可少。近幾年研究顯示，vimentin在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中參與細胞的粘附、遷移和細胞凋亡等過程，在腫瘤轉移過程中起重要作用。研究顯示，雖然細胞形狀沒有明顯改變，但細胞粘著斑的空間結構發(fā)生了改變，因此不能僅從細胞形狀來反映vimentin的功能；vimentin缺陷細胞由于DNA合成減少，增殖速度明顯減慢引。抑制70%的vimentin表達將有效地削弱腫瘤的侵襲和遷移能力J。闡明其在腫瘤侵襲、遷移和轉移過程中細胞骨架分子間的作用（如plectin這個細胞骨架連接蛋白連接vimentin與其他細胞骨架及通過其N末端的剪接變異體連接vimentin與粘著斑）和分子調節(jié)機制，將有助于闡明腫瘤轉移的復雜過程并將其有望作為抗腫瘤轉移治療的新靶點。endprint

參考文獻

Wiedman，G.，Herman，K.，Searson，P. et al.The electrical response of bilayers to the bee venom toxin melittin：Evidence for transient bilayer permeabilization[J].Biochimica et biophysica acta. Biomembranes，2013，1828（5）：1357-1364.

Jason S. Buhrman，Jamie E. Rayahin，Laura C. Cook et al.Active， Soluble Recombinant Melittin Purified by Extracting Insoluble Lysate of Escherichia coli Without Denaturation[J].Biotechnology Progress，2013，29（5）：1150-1157.

Sugihara， K.，Delai， M.，Szendro， I. et al.Simultaneous OWLS and EIS monitoring of supported lipid bilayers with the pore forming peptide melittin[J].Sensors and Actuators， B. Chemical，2012，161（1）：600-606.

Stromstedt AA，Wessman P，Ringstad L et al.Effect of lipid headgroup composition on the interaction between melittin and lipid bilayers[J].Journal of Colloid and Interface Science，2007，311（1）：59-69.

Majumder， A，Kirabo， A，Karrupiah， K et al.Cell Death Induced by the Jak2 Inhibitor， G6， Correlates with Cleavage of Vimentin Filaments[J].Biochemistry，2011，50（36）：7774-7786.

Icenogle，L.M.，Hengel，S.M.，Coye，L.H. et al.Molecular and biological characterization of streptococcal SpyA-mediated ADP-ribosylation of intermediate filament protein vimentin[J].The Journal of biological chemistry，2012，287（25）：21481-21491.endprint