任麗莉　劉超　王一曌

[摘要] 目的 研究活化的蛋白激酶C受體（Receptor for activated protein kinase C，RACK1）與蛋白激酶WEE1互作調(diào)控胃癌細胞株HGC27生長增殖及其作用機制。 方法 采用LipofectAMINE 2000在HGC27細胞中過表達RACK1，Western blotting檢測HGC27細胞中WEE1蛋白表達；免疫共沉淀驗證RACK1和WEE1在HGC27細胞內(nèi)存在相互作用；細胞內(nèi)免疫熒光觀測RACK1與WEE1在HGC27細胞中的表達定位情況。 結(jié)果 過表達RACK1后WEE1在胃癌細胞HGC27中的表達降低，RACK1與WEE1在HGC27細胞內(nèi)存在相互作用且共定位在細胞質(zhì)內(nèi)。結(jié)論 RACK1與WEE1共同作用調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，為RACK1成為臨床上胃癌治療的潛在靶點提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 活化的蛋白激酶C受體；WEE1；胃癌；HGC27細胞

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）23-0029-04

[Abstract] Objective To study the regulatory role of the interaction of scaffolding protein RACK1 with protein kinase WEE1 in the proliferation of gastric cancer cell line HGC27 and the mechanism. Methods RACK1 was overexpressed in HGC27 cells by LipofectAMINE 2000. Western blotting was used to detect the expression of WEE1 protein in HGC27 cells. Immunoprecipitation showed that RACK1 interacted with WEE1 in HGC27 cells. Immunofluorescence was used to observe the expression and positioning of RACK1 and WEE1 in HGC27 cells. Results After expression of RACK1， the expression of WEE1 in gastric cancer cells HGC27 was decreased， and RACK1 interacted with WEE1 in HGC27 cells， and they co-localized in cytoplasm. Conclusion The interaction of RACK1 with WEE1 regulates the development and progression of gastric cancer， and it provides the theoretical basis and experimental basis for RACK1 to be a potential target for clinical treatment of gastric cancer.

[Key words] Activated protein kinase C receptor； WEE1； Gastric cancer； HGC27 cells

胃癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一，在中國胃癌發(fā)病率位于惡性腫瘤第二名。尤其在中國的農(nóng)村地區(qū)，更位于各種惡性腫瘤之首[1]。因此，對胃癌進行早期診斷和治療十分必要。所以，尋找胃癌的分子標記物對研究胃癌發(fā)生發(fā)展就顯得非常有意義?；罨牡鞍准っ窩受體（Receptor for activated protein kinase C，RACK1）作為支架蛋白，可介導(dǎo)多種蛋白的性質(zhì)和功能。如和激活的PKC相互作用，調(diào)節(jié)其在細胞內(nèi)定位；作為JNK或HIF1α的錨定蛋白，調(diào)節(jié)其蛋白的穩(wěn)定性；和核糖體蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白的翻譯；結(jié)合并整合多種信號通路的蛋白分子，調(diào)節(jié)哺乳動物的發(fā)育[2]。因而RACK1可調(diào)節(jié)體內(nèi)各種生物學(xué)過程，包括信號傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細胞生長、遷移和分化以及MAPK活化、血管生成、腫瘤生長、神經(jīng)元反應(yīng)、細胞凋亡、染色質(zhì)重塑和生物鐘的正常功能[3-6]。最近研究表明，RACK1在細胞周期進程中起著重要調(diào)節(jié)作用，因而備受大家關(guān)注。酵母（S.pombe）遺傳學(xué)分析表明，RACK1/Cpc2調(diào)控細胞周期進程進而調(diào)節(jié)減數(shù)分裂，RACK1/Cpc2負調(diào)控WEE1蛋白水平進而正調(diào)控有絲分裂的進程[7]。很多研究證實，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程與RACK1在細胞內(nèi)的表達水平高低有著密切的聯(lián)系，例如RACK1可通過激活蛋白激酶C（PKC）進而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[8]；相關(guān)研究已表明RACK1在乳腺癌、肺癌、宮頸癌、口腔鱗癌、腸癌等多種腫瘤組織中高表達，并跟腫瘤的分期和預(yù)后有著密切的相關(guān)性[9]。雖然RACK1的高表達已經(jīng)在其他多種癌組織中被證實，但RACK1在胃癌中的表達情況及其對預(yù)后的影響還不清楚。本研究旨在通過過表達RACK1蛋白后檢測蛋白激酶WEE1的表達情況，并采用免疫共沉淀和免疫熒光方法檢測RACK1與WEE1在胃癌細胞中的定位與相互作用，進而分析RACK1與WEE1共同作用調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展，從而為RACK1作為胃癌臨床治療的靶點提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

胃癌細胞株HGC-27由中國醫(yī)科大學(xué)李豐教授惠贈。重組質(zhì)粒pcDNA3.1A-flag-rack1由本實驗室構(gòu)建保存。LipofectAMINE 2000（Invitrogen公司，美國），Protein A/G Plus beads（Santa Cruz公司，美國），RACK1抗體（BD公司，美國），WEE1抗體（Abcam公司，美國），F(xiàn)ITC和TRITC標記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物公司），HRP標記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗，RIPA Buffer Western細胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑及BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京碧云天生物公司）。BB16UV CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus），水浴式電轉(zhuǎn)印槽DYY-Ⅲ 40B型（北京六一儀器廠），凝膠自動成像儀（UVP，美國），電泳儀及電泳槽（Bio-Rad公司，美國），激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica公司，德國）。endprint

1.2 HGC27細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HGC27細胞生長于含有10%滅活胎牛血清的1640培養(yǎng)基中（含有100 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素），37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。實驗分為未處理組、pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1A-flag-RACK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組三組。細胞培養(yǎng)48 h后收集，進行后續(xù)實驗。

1.3 Western-blotting檢測HGC27細胞中WEE1蛋白表達

收集并提取各組細胞總蛋白，測蛋白濃度后煮沸，冷卻離心，10% SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，3%BSA的TBS（pH7.4）封閉2 h，分別與anti-WEE1抗體（1∶500稀釋）和β-Actin（1∶1000稀釋）4℃過夜溫育。TTBS洗膜3次，HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG（1∶5000稀釋）室溫溫育2 h，洗膜3次，ECL發(fā)光法進行顯色，實驗重復(fù)3次。

1.4 免疫共沉淀驗證在HGC27細胞內(nèi)RACK1和WEE1存在相互作用

收集培養(yǎng)48 h后HGC27細胞，加入預(yù)冷的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑）離心后，取上清進行蛋白定量，取等量蛋白沉淀煮沸，-20℃保存。取適量預(yù)冷混懸的蛋白A/G瓊脂糖珠子，加入細胞上清液孵育后離心，取上清，一部分加入l μg RACK1抗體，另一部分加入1 μg IgG后，4℃孵育2 h后，加蛋白A/G瓊脂糖珠子繼續(xù)孵育過夜，離心棄上清，PBS清洗剩余的珠子后離心，重復(fù)5次，保留沉淀，煮沸，離心，取上清進行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，以下方法同1.4，實驗重復(fù)2次。

1.5 細胞間接免疫熒光觀察HGC27細胞RACK1和WEE1共定位情況

接種適量HGC27細胞于6孔培養(yǎng)板中，內(nèi)放蓋玻片，培養(yǎng)48 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，PBS清洗3次，0.2%TritonX-100打孔，1%BSA室溫封閉l h，PBS清洗3次，RACK1和WEE1抗體4℃過夜，PBS洗滌清洗，F(xiàn)ITC和TRITC標記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（1∶100）37℃避光孵育45 min，PBS清洗后，加DAPI室溫復(fù)染細胞核10 min，甘油封片后，激光共聚焦顯微鏡下觀察、成像。本組實驗重復(fù)2次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Graphpad prism 5統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，WEE1蛋白表達量的變化情況以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。每組實驗重復(fù)2～3次。

2 結(jié)果

2.1 過表達RACK1后WEE1在胃癌細胞HGC27中表達降低

轉(zhuǎn)染后提取蛋白進行免疫印跡檢測，與未轉(zhuǎn)染組（0.35±0.06）的蛋白表達量相比，pcDNA3.1空載轉(zhuǎn)染組WEE1的蛋白表達量（0.38±0.07）無明顯區(qū)別，pcDNA3.1-flag-Rack1轉(zhuǎn)染組WEE1蛋白表達量（0.14±0.02）明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見封三圖6。

2.2 免疫共沉淀證實RACK1與WEE1在胃癌細胞HGC27內(nèi)存在相互作用

HGC27細胞裂解提取蛋白，加入beads與RACK1抗體共孵育后，洗脫beads結(jié)合的蛋白，再用WEE1抗體進行免疫沉淀檢測，結(jié)果Input組與IP組在90 kDa附近檢測到條帶，IgG組沒有檢測到條帶，并且IP組Wee1蛋白的表達量明顯低于Input組。見封三圖7。

2.3 免疫熒光檢測RACK1與WEE1在胃癌細胞HGC27中共定位

細胞用相應(yīng)抗體標記后，熒光顯微鏡觀察，RACKI與WEE1主要共定位于HGC27細胞的胞質(zhì)內(nèi)。見封三圖8。

3 討論

支架蛋白RACK1是因為與有活性的蛋白激酶C（PKC β Ⅱ）相互作用而得名，具有七個螺旋槳結(jié)構(gòu)的Trp-Asp（WD）重復(fù)序列，與G蛋白β亞單位具有同源性，又名GNB2L1[guanine nucleotide binding protein（G protein），beta polypeptide 2-like 1]，在真核生物間高度保守[10]。RACK1是細胞內(nèi)的穿梭蛋白，可位于胞漿、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核內(nèi)。RACK1可通過與PKC結(jié)合調(diào)控核糖體翻譯，來促進與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達。實驗室前期的實驗結(jié)果已表明，RACK1在胃癌組織中的表達水平要明顯低于癌旁組織，且與胃癌分期緊密相關(guān)[11]，RACK1的mRNA及蛋白在胃癌細胞HGC27中的表達顯著低于正常胃黏膜細胞GESY，過表達RACK1可明顯抑制HGC27細胞生長增殖。

為探討RACK1表達上調(diào)抑制胃癌細胞生長和增殖的可能機制，本研究首先通過Western bloting檢測在HGC27細胞中過表達RACK1后細胞周期蛋白WEE1的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組WEE1的表達水平明顯降低，顯著低于未轉(zhuǎn)染組和空載對照組。MPF是細胞周期中極其關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。在細胞分裂間期，直到G2期結(jié)束時，WEE1蛋白激酶可通過磷酸化MPF的重要組分-Cdc2上的Thr14和Tyr15殘基使MPF處于失活狀態(tài)。WEE1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與末端磷酸化，還可失活細胞周期蛋白依賴性激酶1（Cyclin dependent kinase 1，CDK1），從而導(dǎo)致DNA損傷應(yīng)答而阻滯G2期細胞周期，負性調(diào)控細胞有絲分裂的進行[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，WEE1在惡性黑色素瘤、乳腺癌、骨肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等一些腫瘤中高表達[13-16]，但在胃癌中如何表達還不清楚。

目前僅有Kim HY等[12]報道WEE1在胃癌組織中高表達且與伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的男性胃癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)，同時檢測WEE1在12種胃癌細胞株中的表達，7株高表達，5株表達很少或不表達，文中沒有檢測WEE1在HGC27細胞中的表達情況。實驗室前期的研究中已發(fā)現(xiàn)WEE1在HGC27細胞中的表達水平要明顯低于正常胃黏膜細胞GESY，本研究中過表達RACK1抑制WEE1蛋白的表達，具體的機制還不清楚。正常細胞修復(fù)損傷的DNA主要在G1期阻滯，然而癌細胞經(jīng)常在G1期阻滯有缺陷，很大程度上取決于G2期阻滯，因此，與正常細胞相比，癌細胞在G2期檢查點增加了DNA損傷的程度[12]，本研究中在HGC27細胞中過表達RACK1可能破壞了G2/M期檢查點的平衡，抑制了細胞增殖。既然RACK1的改變影響了WEE1蛋白的表達，兩者是如何相互作用的呢？我們又應(yīng)用免疫共沉淀實驗來驗證在胃癌HGC27細胞中RACK1與WEE1存在相互作用。endprint

為了進一步研究RACK1與WEE1在胃癌細胞中的關(guān)系，我們進行了免疫熒光共定位觀察到了這兩個蛋白在胃癌的亞細胞結(jié)構(gòu)中的共定位情況，證實二者共定位于HGC27細胞胞質(zhì)中。這些實驗結(jié)果充分說明RACK1與WEE1在胃癌細胞HGC27中能夠共定位，有著十分緊密的互作關(guān)系，對胃癌的發(fā)生發(fā)展有著一定的影響作用。由此可推測，RACK1與WEE1在細胞中的相互作用可能是調(diào)控胃癌細胞生長增殖的主要機制之一。但RACK1與WEE1是如何互作以及如何調(diào)控胃癌發(fā)生的具體機制還需進一步的研究探討。

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（收稿日期：2017-05-06）endprint