厲金雷　蔡劍輝　任約翰

[摘要] 目的 研究Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與大腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系。 方法 隨機(jī)選擇我院2010年2月～2013年8月期間收治的240例大腸癌患者作為研究對(duì)象，取術(shù)后腫瘤組織標(biāo)本，檢測(cè)Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變并分析其與大腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。隨訪3年，分析Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與患者的3年生存率的關(guān)系。 結(jié)果 240例患者Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變分別占2.50%、7.92%、43.75%、4.17%。Kras突變合并Pik3ca突變占3.75%。Braf突變合并Pik3ca突變占0.42%。Kras突變合并Nras突變1例，占0.42%。Nras基因突變僅與患者的年齡有關(guān)（P<0.05）。Braf基因突變僅與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度以及術(shù)后是否復(fù)發(fā)有關(guān)（P<0.05）。Kras基因突變僅與患者的年齡和病灶大小有關(guān)（P<0.05）。Pik3ca基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度有關(guān)（P<0.05）。Nras、Braf、Kras和Pik3ca基因突變大腸癌患者的3年生存率均低于野生型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 對(duì)大腸癌患者行Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變檢測(cè)可以為靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 大腸癌；Nras基因；Braf基因；Kras基因；Pik3ca基因；靶向治療

[中圖分類號(hào)] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）23-0001-05

[Abstract] Objective To study the relationship between Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation and clinicopathological features of colorectal cancer. Methods A total of 240 patients with colorectal cancer who were treated in our hospital from February 2010 to August 2013 were selected. The tumor tissues were taken and the relationship between Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation and clinicopathological features of colorectal cancer were analyzed. The relationship between Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation and 3-year survival was analyzed for 3 years follow-up. Results 240 cases of Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation accounted for 2.50%， 7.92%， 43.75%， 4.17%. Kras mutations combined with Pik3ca mutations accounted for 3.75%. Braf mutation combined with Pik3ca mutation accounted for 0.42%. Kras mutation combined with Nras mutation in 1 case， accounting for 0.42%. The mutation of Nras gene was related to the age of the patient（P<0.05）. The mutations of Braf gene were related to the location of primary tumor， the degree of differentiation and postoperative recurrence（P<0.05）. Kras gene mutations were associated with age and lesion size（P<0.05）. Pik3ca gene mutation was associated with the primary site and differentiation of the tumor（P<0.05）. The 3-year survival rates of patients with Nras， Braf， Kras and Pik3ca mutations were lower than those of wild type， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Nras， Braf， Kras and Pik3ca mutations in patients with colorectal cancer can provide a scientific basis for targeted therapy.

[Key words] Colorectal cancer； Nras gene； Braf gene； Kras gene； Pik3ca gene； Targeted therapy

大腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居全球常見(jiàn)惡性腫瘤的第三位，死亡率位居第四位[1]。近年來(lái)其死亡率逐漸上升，傳統(tǒng)的手術(shù)治療和放化療已經(jīng)不能滿足日益增長(zhǎng)的發(fā)病現(xiàn)狀。近年來(lái)精準(zhǔn)醫(yī)療理念逐漸被接受，大腸癌的治療也迎來(lái)靶向治療的時(shí)代[2，3]。近年來(lái)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單抗藥物在大腸癌中得到廣泛應(yīng)用[4]，其適用對(duì)象主要是Kras基因突變的患者，研究顯示EGFR信號(hào)通路下游的相關(guān)基因也能影響單抗藥物的靶向治療效果，這些基因包括Nras、Braf和Pik3ca[5，6]。因此，對(duì)大腸癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因進(jìn)行檢測(cè)，研究Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與大腸癌的臨床病理特征之間的關(guān)系，對(duì)大腸癌的靶向治療和預(yù)后具有重要的意義。本研究通過(guò)Sanger測(cè)序的方法對(duì)大腸癌患者Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變進(jìn)行檢測(cè)，并分析了Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2010年2月～2013年8月期間經(jīng)手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本240例，其中男142例，女98例?；颊叩脑\斷參考2010年第三版世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）關(guān)于消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)中大腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。所有切除的標(biāo)本組織采用10%甲醛固定后石蠟包埋，然后HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察患者腫瘤的病理學(xué)特征，記錄腫瘤的原發(fā)部位、腫瘤類型、分化程度、TNM（Tumor Node Metastasis）分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況、腫塊大小。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物序列設(shè)計(jì)的擴(kuò)增 Nras基因的引物序列有：exon 2：F-5-GAACCAAATGGAAGGTCACACT-3；R：5-CCTCACCTCTATGGTGGGATC-3；exon 3：F-5-TAGCATTGCATTCCCTGTGGTT-3；R：5-CCTGTAGAGGTTAATATCCGCAA-3；exon 4：F-5-GCCACTGTACCCAGCTAATCTTG-3；R：5-CACATCTCTACCAGAGTTAATCAACTGATGC-3。設(shè)計(jì)的擴(kuò)增Kras基因的引物序列有：exon 2：F-5-TACTGGTGGAGTATTTGATAG-3；R：5-TGGTCCTGCACCAGTAATATG-3；exon 3：F-5-GCACTGTAA-TAATCCAGACTGTG-3；R：5-CCCACCTATAATGG-TGAATATCTTC-3；exon 4：F-5-ATGACAAAAGTT-GTGGACAGGTTTTGA-3；R：5-ATGATTTTGCAGA-AAACAGATCTGTATTTATTTCAG-3。設(shè)計(jì)的擴(kuò)增Braf基因的序列有：exon 15：F-5-CCTAAACTCTTCA-TAATGCTTGCTC-3；R：5-GTGGAAAAATAGCCTC-AATTCTTACC-3。設(shè)計(jì)的擴(kuò)增Pik3ca基因的引物序列有：exon 9：F-5-TGTAATCATCTGTGAATCCAG-AGG-3；R：5-TGCTGAGATCAGCCAAATTCAG-3；exon 20：F-5-CAGGAGATGTGTTACAAGGCTTATC-3；R：5-ATGCTGTTTAATTGTGTGGAAGATC-3。引物序列參考李艷艷等[8]。

1.2.2 基因突變檢測(cè) 采用Qiagen公司的DAN FFPE Tissue Kit（Cat No：56404）抽提患者的腫瘤組織石蠟切片，具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。抽提DNA（deoxyribonucleic acid）后采用PCR擴(kuò)增后直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的方法檢測(cè)Nras、Kras、Braf和Pik3ca基因突變，PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 mmol/L的上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，無(wú)酶水13 μL，LA Taq酶 0.1 μL，總體積20 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95℃，5 min；95℃，30 s，56℃，45 s，72℃，20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR完成后將PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Chromas軟件和Vector NTI 8.0軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，各基因突變與患者的一般資料之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變與患者的生存率之間的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存分析繪制生存曲線，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各基因突變與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

本研究中240例患者共檢測(cè)到6例Nras基因突變，占2.50%；19例Braf基因突變，占7.92%；105例Kras基因突變，占43.75%；10例Pik3ca基因突變，占4.17%。Nras和Kras基因突變與患者的年齡有關(guān)，年齡≥65歲患者的突變明顯低于年齡<65歲的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Braf基因突變與患者的癌癥原發(fā)部位、分化程度及術(shù)后是否復(fù)發(fā)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Kras基因突變與患者的病灶大小有關(guān)，病灶≥3 cm的患者突變顯著高于病灶<3 cm的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pik3ca基因突變與患者的原發(fā)部位、分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），患者的臨床病理特征與各基因突變情況之間的關(guān)系見(jiàn)表1。

2.2 Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變的類型和頻率

6例Nras基因突變中，G12D突變3例，占1.25%；G12C、Q61H、Q61K突變各1例，分別占0.42%。19例Braf基因突變中均為V600E型，占7.92%。105例Kras基因突變中，G12D突變63例，占26.25%；G12V突變10例，占4.17%；G12C突變6例，占2.50%；G12S突變5例，占2.08%；G12A突變4例，占1.67%；G13D突變8例，占3.33%；Q16H突變、Q16L突變、A146T突變各2例，分別占0.83%；K117N突變、A146P突變、A146V突變各1例，分別占0.42%。10例Pik3ca基因突變中E542K突變6例，占2.50%；E545K突變和H1047R突變各2例，分別占0.83%。見(jiàn)表2。endprint

2.3 雙基因突變情況統(tǒng)計(jì)

本次檢測(cè)中，Kras突變合并Pik3ca突變9例，分別為G12C/E542K突變、G12D/E542K突變、G12D/E545K突變、G12V/E542K突變、G12V/E545K突變、G13D/E542K突變、G13D/H1047R突變、Q61H/E542K突變、Q61H/H1047R突變各1例，各占0.42%。Braf突變合并Pik3ca突變1例，為V600E/E542K突變，占0.42%。Kras突變合并Nras突變1例，為Q61H/A146T突變，占0.42%。見(jiàn)表3。

2.4 大腸癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變的生存分析

240例大腸癌患者均獲得了3年的隨訪，對(duì)隨訪結(jié)構(gòu)進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示Nras基因突變大腸癌患者的3年生存率為45.5%，野生型大腸癌患者3年生存率為96.3%，突變型低于野生型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.41，P=0.00）。Braf基因突變大腸癌患者的3年生存率為49.8%，野生型大腸癌患者3年生存率為94.2%，突變型低于野生型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.97，P=0.00）。Kras基因突變大腸癌患者的3年生存率為64.3%，野生型大腸癌患者3年生存率為93.3%，突變型低于野生型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.11，P=0.00）。Pik3ca基因突變大腸癌患者的3年生存率為49.0%，野生型大腸癌患者3年生存率為92.0%，突變型低于野生型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.14，P=0.00），見(jiàn)封三圖1。

3 討論

大腸癌的發(fā)生和發(fā)展是受多基因調(diào)控的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，EGFR基因是治療大腸癌的主要靶點(diǎn)之一[9，10]。研究顯示在EGFR信號(hào)通路中，除Kras基因外，還存在其他的耐藥機(jī)制發(fā)揮作用，如Braf基因突變、配體表達(dá)以及其他信號(hào)通路被激活等因素[11，12]。相關(guān)研究顯示，Kras的第二外顯子以外的基因突變能夠影響靶向治療的效果[13]，因此本研究的檢測(cè)范圍包含了Nras基因的第二和第三個(gè)外顯子、Braf基因的第15外顯子、Kras基因的第二、第三、第四外顯子以及Pik3ca基因的第九和第二十外顯子。相關(guān)研究顯示[14]，在Ras基因突變中，Kras占大多數(shù)，本研究結(jié)果顯示，Kras基因突變占43.75%（105/240），主要檢測(cè)到的突變類型為G12D、G12V、G12C、G12S、G12A、G13D、Q61H、Q61L、K117N、A146T、A146P、A146V，與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]，其中第二外顯子的突變占總突變的91.43%（96/105），略高于相關(guān)研究結(jié)果[16]，

本研究認(rèn)為樣本量是造成該差異的主要因素之一，但是也不排除地域差異的影響。另外，本研究結(jié)果顯示，Kras基因突變與患者的年齡和病灶大小有關(guān)（P<0.05），與其他病理特征無(wú)關(guān)（P>0.05），患者年齡≥60歲、病灶≥3 cm時(shí)Kras基因突變率較高，對(duì)于臨床大腸癌患者的治療具有一定的指導(dǎo)意義，相關(guān)研究顯示，Kras基因突變與患者的性別、年齡、腫瘤的部位及腫瘤的分化程度等因素有關(guān)[17]，分析研究結(jié)果的差異，一方面可能是樣本數(shù)差異導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果誤差，另一方面可能是地域差異等因素。

據(jù)相關(guān)研究結(jié)果顯示[18]，Nras基因突變?cè)谘耗[瘤中比較常見(jiàn)，在羅馬尼亞人種中Nras基因突變的頻率為9.0%～10.21%，明顯高于本研究的2.50%，國(guó)內(nèi)有研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致[8]，本研究中也未能檢測(cè)到第四外顯子突變，與相關(guān)研究結(jié)果一致[8]，說(shuō)明我國(guó)大腸癌患者中Nras基因的第四外顯子突變率很低。Nras基因突變與患者的年齡有關(guān)（P<0.05），與其他病理特征無(wú)關(guān)（P>0.05），分析原因可能是由于樣本量限制使檢出的Nras基因突變較少。本研究檢測(cè)到7.92%（19/240）的Braf基因突變，與相關(guān)研究報(bào)道的Braf突變范圍一致[19]，本研究結(jié)果顯示，Braf基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度以及術(shù)后是否復(fù)發(fā)有關(guān)（P<0.05），與相關(guān)研究結(jié)果一致[20]，但是與有關(guān)研究不同的是本研究并未發(fā)現(xiàn)不同性別的大腸癌患者Braf基因突變概率之間存在明顯差異。另外，本研究發(fā)現(xiàn)Braf突變的患者術(shù)后更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，推測(cè)Braf基因突變可能是大腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。近年來(lái)，Pik3ca基因突變成為大腸癌患者研究的熱點(diǎn)之一并受到廣泛關(guān)注[21]。本研究結(jié)果顯示，Pik3ca基因突變率為4.17%，與國(guó)內(nèi)有關(guān)研究結(jié)果一致[8]，明顯低于國(guó)外有關(guān)研究結(jié)果[22]，分析原因可能是Pik3ca基因突變與人種差異有關(guān)，不同人種之間Pik3ca基因突變的位點(diǎn)不一致，本研究?jī)H檢測(cè)到E542K、E545K和H1047R三個(gè)突變位點(diǎn)，是否還存在其他位點(diǎn)突變可能是影響該基因突變率不同的因素，本文不作深入討論。從本研究結(jié)果可以看出，Pik3ca基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度有關(guān)（P<0.05），與其他病理特征無(wú)關(guān)（P>0.05），右半結(jié)腸癌、分化程度高的患者Pik3ca基因突變率較高。有關(guān)研究顯示，Pik3ca基因突變與大腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[23]。有研究顯示，Pik3ca基因突變可能導(dǎo)致Kras野生型大腸癌患者對(duì)于EGFR單抗藥物不敏感[24]，因此推測(cè)Pik3ca基因突變可能解開EGFR耐藥機(jī)制的謎團(tuán)，成為治療大腸癌的新靶點(diǎn)。另外，本研究結(jié)果顯示，大腸癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變后其生存率均明顯下降，顯示大腸癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變篩查具有顯著的臨床意義，可以作為轉(zhuǎn)移性大腸癌治療和預(yù)后的重要指標(biāo)進(jìn)行臨床檢測(cè)從而指導(dǎo)臨床靶向治療。

綜上所述，Nras基因突變與患者的年齡有關(guān)，Braf基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度及術(shù)后是否復(fù)發(fā)有關(guān)，Kras基因突變與患者的年齡和病灶大小有關(guān)，Pik3ca基因突變與患者的腫瘤原發(fā)部位、分化程度有關(guān)，對(duì)大腸癌患者行Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突變檢測(cè)可以為靶向治療提供指導(dǎo)。endprint

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（收稿日期：2017-05-18）endprint