何瓊，何建中，賴偉，邱艷飛

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院眼科，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

姜黃素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Ets-1表達的影響

何瓊，何建中，賴偉，邱艷飛

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院眼科，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

目的 觀察姜黃素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜E26轉(zhuǎn)錄因子-1（Ets-1）表達的影響，探討姜黃素治療抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變的可能機制。方法 采用腹腔注射鏈尿佐菌素（STZ）60mg/kg誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，將20只造模成功的動物隨機分成糖尿病組（10只），姜黃素治療組（10只），取等量正常大鼠作為空白對照組。治療組在大鼠出現(xiàn)糖尿病表現(xiàn)后按姜黃素200mg/(kg·d)灌胃，姜黃素用質(zhì)量分數(shù)1%羧甲基纖維素配成混懸液后給藥，共8周。糖尿病組及治療組同期給予等量的1%羧甲基纖維素灌胃，連用8周。8周后取大鼠眼球分別行免疫組化、用ELISA法測定Ets-1濃度。結(jié)果 ELISA法測得糖尿病組的Ets-1濃度比正常組增加（P＜0.05），治療組Ets-1濃度比糖尿病組低（P＜0.05），但比正常對照組高（P＜0.05）。免疫組化顯示正常對照組視網(wǎng)膜中Ets-1陽性細胞微量表達，糖尿病組及姜黃素治療組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ets-1陽性細胞大量表達，且姜黃素治療組大鼠視網(wǎng)膜組織中Ets-1陽性細胞表達程度低于糖尿病組。電鏡結(jié)果提示糖尿病組及姜黃素治療組均可看到糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理改變，但姜黃素治療組的病理改變程度比糖尿病組要輕。結(jié)論 姜黃素可抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ETS-1的表達，從而緩解其糖尿病視網(wǎng)膜病變進程。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；Ets-1；姜黃素

糖尿病視網(wǎng)膜病變 （diabetic retinopathy，DR）的致盲率極高，其發(fā)生機制可能是血-視網(wǎng)膜屏障((breakdown of blood-retinal barrier，BRB))損傷導(dǎo)致血管通透性增加，最終生成眼內(nèi)新生血管[1，2]，導(dǎo)致視力喪失。Ets家族作為作為轉(zhuǎn)錄因子，包括30多個家族成員，而Ets-1是其家族中研究較多的成員之一。Ets可以通過誘導(dǎo)降解基質(zhì)酶的表達發(fā)揮降解基質(zhì)的作用，促使基底膜分解，為血管生成作好準備[3]。國內(nèi)外眾多研究都表明Ets-1能促進血管生成，是血管形成過程中重要的調(diào)節(jié)因子。姜黃素是從姜科姜黃屬的草本植物中提取出來的活性成分，作為我國的傳統(tǒng)中草藥，其具有多種療效，研究表明姜黃素有抗氧化抗炎作用[4，5]、抗腫瘤作用[6，7]、抗微生物作用[8]、抑制血管生成[9]、保護肝腎[10]等多種作用。我們將其對大鼠糖尿病模型進行早期干預(yù)，觀察其對視網(wǎng)膜組織中Ets-1表達的影響，為臨床糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料鏈尿佐菌素（STZ）（Sigma公司）；血糖儀和標準試紙 （強生公司），純度99%姜黃素；Ets-1檢測試劑盒購自上海西塘科技生物有限公司。TACHICF 16RX低溫離心機，恒溫水浴儀，酶標儀。南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物部提供健康Sprague-Dawlay大鼠 40只，雌雄不限，體重 180～220g，經(jīng)眼部檢查無明顯異常。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組健康成年雄性SD大鼠40只，體重180～220g，眼部經(jīng)裂隙燈和檢眼鏡檢查屈光間質(zhì)清晰，眼底無病變.飼養(yǎng)于南大醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境符合醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施要求。大鼠隨機取對照組（10只）、剩余30只大鼠注射STZ誘導(dǎo)成糖尿病，取20造模成功的大鼠隨機分為糖尿病組（10只）、姜黃素治療組（10只）。

1.2.2 造模與取材造模：糖尿病和姜黃素治療組大鼠空腹12h，0.1%枸櫞酸鹽緩沖液配制成濃度為1%的STZ溶液，30只造模大鼠按60mg/kg劑量左下腹內(nèi)注射，72h后尾靜脈取血測血糖，血糖≥l6.7 mmol/L者確定為糖尿病實驗對象。正常對照組腹腔注射等量枸櫞酸鹽緩沖液。成模當天作為實驗開始時間，治療組將姜黃素200mg/(kg·d)灌胃，共8周。同期將正常對照組和糖尿病組大鼠給予等量的1%羧甲基纖維素灌胃，連續(xù)8周。

取材：各組大鼠分別在喂養(yǎng)8周后，以頸椎脫臼法猝死大鼠，立即取大鼠右側(cè)眼球行ELISA測定，左側(cè)眼球置福爾馬林固定用以免疫組化及電鏡切片。

1.2.3 各組視網(wǎng)膜組織均經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，經(jīng)DAB顯色后蘇木精復(fù)染，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜Ets-1陽性細胞表達情況。

1.2.4 ELISA實驗方法及結(jié)果分析取視網(wǎng)膜組織勻漿離心，取上清液。每孔中各加入標準品或上清液樣品 100μl，置 37℃ 120min，洗板，每孔中加入一抗 100μl，置 37℃ 60min，洗板，每孔加入酶標抗體 100μl，置 37℃ 30min，洗板，加入底物工作液100μl，置 37℃ 15min，加入終止液 100μl，30min 內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。根據(jù)樣品吸光值在曲線圖上查出相應(yīng)Ets-1濃度。

1.2.5 電鏡檢查各實驗組大鼠處死后迅速摘除眼球，2.5%戊二醛固定2h，切取小塊視網(wǎng)膜組織，經(jīng)梯度乙醇脫水、滲透、包埋等處理，超薄切片，再以質(zhì)量分數(shù)2%醋酸鈾和枸椽酸鉛雙重電子染色后，在透射電鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 Ets-1濃度測定正常大鼠視網(wǎng)膜就有Ets-1的表達，糖尿病組比正常對照組表達濃度顯著增加，姜黃素治療組較糖尿病組表達濃度降低，但比正常對照組高。組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（見表 1）。

表1 大鼠視網(wǎng)膜Ets-1表達（x±s）

2.2 免疫組化情況正常對照組大鼠視網(wǎng)膜中Ets-1陽性細胞少量表達于視網(wǎng)膜組織中的內(nèi)核層、神經(jīng)節(jié)細胞層以及色素上皮層。糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜中Ets-1陽性細胞大量表達于視網(wǎng)膜組織中，其表達位置層次與正常對照組相同。姜黃素治療組中Ets-1陽性細胞大量表達于大鼠視網(wǎng)膜組織，其表達位置層次與正常對照組相同，但陽性反應(yīng)程度較糖尿病組輕（見圖1A-1C）。

2.3 電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果正常對照組大鼠視網(wǎng)膜膜盤結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，光感受器細胞排列整齊形態(tài)規(guī)則，核染色質(zhì)均勻。糖尿病大鼠視網(wǎng)膜膜盤結(jié)構(gòu)分離，排列紊亂。光感受器細胞腫脹，核形態(tài)不規(guī)則，吞飲小泡增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體腫脹，呈空泡狀，姜黃素治療組視網(wǎng)膜細胞超微改變較糖尿病組改變程度減輕，但與正常對照組比較仍有病理改變（見圖2A-2C）。

圖1 免疫組化結(jié)果

圖2 電鏡視察結(jié)果

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)引起的全身各組織器官微血管病變中最嚴重的并發(fā)癥，其發(fā)生機制目前尚未完全闡明，新生血管的形成是DR的主要致盲原因。血管的形成中主要包含5個階段：⑴血管基底膜的降解；⑵血管內(nèi)皮細胞的遷移；⑶血管內(nèi)皮細胞的增殖、粘附并連接；⑷管腔樣結(jié)構(gòu)的形成；⑸基質(zhì)重塑、平滑肌細胞包繞以及血管的相互吻合，最終形成血管網(wǎng)[11]。越來越多的研究成果證實Ets家族在血管生成過程中起著尤為重要的作用。Ets基因最早是在美國馬里蘭的Frederick國家癌癥研究所分子腫瘤學(xué)實驗室發(fā)現(xiàn)的[12]，在研究禽類反轉(zhuǎn)錄病毒E26時發(fā)現(xiàn)了v-ets[13]，E26是禽類白血病病毒，是一個復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒，因而根據(jù)z26(E-Twenty-Six)英文縮寫而將此基因命名為Ets。Ets-1是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族中的第一個亞族，同時也是研究得最多的一個亞族，Ets-1位于染色體的位置為11q23-24，分子質(zhì)量54KD，含有450個氨基酸，包含多個功能區(qū)。Hashiya等使用HVJ-轉(zhuǎn)染方法證實了體內(nèi)Ets-1的促血管生成作用，這種作用是通過Ets-1作為轉(zhuǎn)錄因子過表達上調(diào)血管生成因子如血管內(nèi)皮生長因子 （VEGF）和肝細胞生長因子（HGF）實現(xiàn)的[14]。Ets-1誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP1，MMP3，MMP9）的表達，從而促進血管內(nèi)皮細胞遷移游走。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的特異性受體Flt-1和Flk-2的啟動子區(qū)含有Ets結(jié)合位點。Ets-1的表達增加了內(nèi)皮細胞的粘附并且刺激它們變成類毛細血管結(jié)構(gòu)[15]。

姜黃素是從姜黃的根莖中提取的一種橙黃色的略帶酸性的酚類物質(zhì)，是姜黃發(fā)揮藥理作用的主要成分。姜黃素不溶于水對熱穩(wěn)定，但在光照以及堿性溶液中不穩(wěn)定。國內(nèi)對姜黃素在腫瘤方面研究較多，但在眼科的應(yīng)用尚少，隨著對姜黃素藥理作用研究的深入，其應(yīng)用也隨之廣泛，正越來越多的應(yīng)用于眼科領(lǐng)域，目前已成為國內(nèi)外研究熱點。Mrudula T等研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜新生血管生長[16]，近年來已有關(guān)于姜黃素抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中巨噬細胞游走抑制因子[17]及低氧誘導(dǎo)因子表達[18]的報導(dǎo)，但姜黃素在眼科的臨床應(yīng)用尚需更多的實驗依據(jù)，本實驗通過對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Ets-1表達的研究進一步探討姜黃素對糖尿病視網(wǎng)膜病變進程的延緩機制，為姜黃素應(yīng)用于臨床進一步提供佐證。

本實驗表明，姜黃素可以下調(diào)Ets-1的表達，在組織病理學(xué)上減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變的病變程度，從而證實姜黃素對糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療效果。但因本實驗樣本量尚小，還需大量的臨床隨機對照研究，使得實驗結(jié)果更加可靠。

[1]岳嵩，胡悅東，王馨鶴，等．線粒體功能障礙及氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變關(guān)系的研究[J]．國際眼科雜志，2014，14（12）：2176-2178.

[2]朱冬青，鄭志，顧青，等．視網(wǎng)膜酸化誘導(dǎo)VEGF與PEDF表達及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系[J]．中華實驗眼科雜志，2012，30(4)：326-330.

[3]趙煥，馬鴻達.Ets-1在腫瘤血管生成中作用的研究進展[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2005，15（4）：103-104.

[4]趙萱，傅超美，甘彥雄，等．基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的姜黃素抗炎作用機制研究[J].中藥與臨床雜志，2015，6（4）：58-62.

[5]狄建彬，顧振綸，趙笑東，等．姜黃素的抗氧化和抗炎作用研究進展[J].中草藥雜志，2010，41（5）：18-21.

[6]Bush JA，Cheung KJ Jr，Li G．Curcumin induces apoptosis in human melanoma cells through a fas receptor/caspase-8 pathway in-dependent of p53[J]．Exp Cell Res，2001，271(2)：305-314．

[7]趙毅輝，李德俊，王順金.姜黃素對SMMC-7721人肝癌細胞凋亡和細胞周期的影響 [J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，28（2）：130-133.

[8]黃敏芳，劉端勇，徐榮，等．姜黃素藥理作用之回顧及解析[J].江西中醫(yī)藥雜志，2015，46（5）：60-63.

[9]鄭海生，藍育青.姜黃素在眼科應(yīng)用的研究和進展[J].中國實用眼科雜志，2010，28（3）：213-215.

[10]Nanji AA，Jokelainen K，Tipoe GL，et al.Curcumin prevents alcohol-induced liver disease in rats by inhibiting the expression of NF-kappa B-dependent genes[J].Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2003，284(2)：G321-327．

[11]劉玉琴．腫瘤血管形成機理研究進展[J]．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床雜志，2004，24(3)：239-243．

[12]張蕾，楊永秀.E26轉(zhuǎn)錄因子-1(Ets-1)與婦科惡性腫瘤的研究進展[J].中國腫瘤雜志，2009，18(2)：131-135.

[13]Murumagi A，Silvennoinen O，Peterson P.Ets transcription factors regulate AIRE gene promoter[J]．Biochem Biophys Res Commun，2006，348(2)：768-774.

[14]Hashiya N，Jo N，Aoki M，et al.In vivo evidence of angiogenesis induced by transcription factor Ets-1：Ets-1 is located upstream of angiogenesis cascade[J].Circulation，2004，109(24)：3035-3041.

[15]Naito S，Shimizu S，Matsuu M，et al．Ets-1 upregulates matrix metalloproteinase-1 expression through extracellular matrix adhesion in vascular endothelial cells[J]．Biochem Biophys Res Commun，2002，291(1)：130-138.

[16]Mrudula T，Suryanarayana P，Srinivas PN，et al．Effect of curcumin on hyperglycemia-induced vascular endothelial growth factor expressioninstreptozotocin-induceddiabeticrat retina[J]．Biochem Biophys Res Commun，2007，361(2)：528-532．

[17]劉娟，游志鵬.姜黃素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中巨噬細胞游走抑制因子表達的影響[J].眼科研究，2010，28（12）：1139-1143.

[18]毛新幫，游志鵬，吳宏禧.姜黃素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中低氧誘導(dǎo)因子-lα 表達的影響[J].南昌大學(xué)學(xué)報，2015，55（6）：29-32.

The effect of Curcum in on the expression of E26 transformation Specific-1(Ets-1)in Diabetic Rats

HE Qiong，HE Jianzhong，LAIWei，QIU Yanfei.
Department of Ophthalmology，The People’S Hospital of Pingxiang City in Jiangxi Province，Pingxiang Jiangxi337000，China.

Objective To observe the effects of Curcumin on the expression of E26 transformation specific-1(Ets-1)in the retina of diabetic rats.Methods 20 SD rats of successful diabeticmodelswere randomly divided into diabetes group and Curcumin treatment group，which were induced into diabetes by streptozotocin(60mg·kg-1)intraperitoneal injection each group 10 rats.Another 10 normal rats were recruited as normal control group.Cureumin 200mg/(kg·d)containing carhoxymethylcellulose was administered intragastrically last for 8 weeks after themodels formed in Curcumin treatment group.And only oarboxymethylcellulose was given at the same way in diabetes group and normal control group for 8 weeks.After 8 weeks，the eyes of 10 rats in each group were removed，and used to detected the expression of Ets-1 in the retinas by ELISA and immunohisochemistry.Results The results of ELISA showed that the expression level of Ets-1 in retina in diabetes group was significantly higher than normal control group(P＜0.05).The Curcumin treatment group was lower than diabetes group(P＜0.05)，buthigher than control group(P＜0.05).The results of immunohisochemistry showed that the expression of Ets-1 positive cells in retina was trace expressed in control group，but strongly expressed in diabetes group and Curcumin treatment group，and especially the diabetes group.The pathological changes of diabetic retinopath were observed by electron microscopy in diabetes group and Curcumin treatment group.The degree of pathological changes in Curcumin treatment group was lower than those in diabetes group.Conclusion Curcumin could inhibits the expression of Ets-1 in retina of diabetic rats and alleviates the progression of diabetic retinopathy.

Diabetic retinopathy；Ets-1；Curcumin

R587.1，R-332

A

1674-1129(2017)05-0677-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.013

何瓊，女，1982年生，碩士研究生，主治醫(yī)師，眼科學(xué)，研究方向：主要從事眼底病診治方面工作。Email：heqiong1221@sina.com。

2017-01-13；

2017-08-05)