鄭恩惠 ，林杰 ，李曲文 ，楊勁松 ，陳愛平 ，2

(1、福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001；2、福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001)

2016年福建省永安及南平監(jiān)測(cè)點(diǎn)五種致瀉性大腸埃希菌監(jiān)測(cè)分析

鄭恩惠1，林杰1，李曲文1，楊勁松1，陳愛平1，2

(1、福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001；2、福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001)

目的 對(duì)福建永安及南平兩個(gè)檢測(cè)哨點(diǎn)2016年的281份腹瀉病例進(jìn)行5種致瀉性大腸埃希菌病原檢測(cè)，為病例的確診及致瀉性大腸埃希菌流行病學(xué)的提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法收集281份其他感染性腹瀉病例(排除霍亂、菌痢、傷寒副傷寒)的糞便標(biāo)本，接種麥康凱平板，選取初步生化符合大腸桿菌的菌落，然后用致瀉性大腸埃希菌多重PCR和單重PCR檢測(cè)方法確定其致病型別。結(jié)果 281份腹瀉病例糞便標(biāo)本共檢出致瀉性大腸埃希菌17株，檢出率6.05%，其中aEPEC 4株，ETEC 6株，EAEC 7株，其他型別未檢出。結(jié)論 福建地區(qū)致瀉性大腸埃希菌致病型別以aEPEC，ETEC，EAEC為主，多重PCR檢測(cè)方法能有效的對(duì)致瀉性大腸埃希菌病進(jìn)行確診及了解菌株的毒力基因攜帶情況，并為我省的致瀉性大腸埃希菌的流行病學(xué)資料的積累及疾病防控提供快速客觀的依據(jù)。

感染性腹瀉；致瀉性大腸埃希菌；毒力基因

感染性腹瀉是臨床常見的一種癥狀，常見的病因有細(xì)菌、病毒、寄生蟲等不同病原體引起[1]，在細(xì)菌感染性腹瀉中，致瀉性大腸埃希菌也是其中的一種。大腸埃希菌(Escherichia coli，E coli)是人腸道中正常菌群，只有少數(shù)具有致病性，其致瀉性主要取決是否攜帶有相應(yīng)的毒力基因，根據(jù)毒力、致病性及流行病學(xué)等可將致瀉性大腸埃希菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）可分為 5 類，即腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌（ETEC）、腸致病性大腸埃希菌（EPEC）、腸出血性大腸埃希菌（EHEC）、腸侵襲性大腸埃希菌 （EIEC）及腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）[2]。由于致瀉性大腸埃希菌可通過食物、水源等方式傳播，有可能導(dǎo)致疫情暴發(fā)，為此開展腹瀉病例中5種致瀉性大腸埃希菌的監(jiān)測(cè)工作，對(duì)于了解其流行病學(xué)特征、臨床研究及疾病防控具有一定的研究意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來源根據(jù)2016年福建省其他感染性腹瀉(排除霍亂、菌痢、傷寒副傷寒)監(jiān)測(cè)方案采集了281份腹瀉病例糞便，其中福建省南平市延平區(qū)疾病預(yù)防控制中心156份和福建省永安市疾病預(yù)防控制中心125份，初步鑒定均為大腸埃希菌的菌株。

1.2 試劑和儀器五種致瀉大腸埃希菌多重PCR檢測(cè)試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖為BioAsia進(jìn)口分裝品，DL2000 DNA Marker（批號(hào)：B7501A）購自寶生物工程 （大連）有限公司；PCR擴(kuò)增儀為G-Storm（英國 Gene Technologies公司），Basic電泳儀，凝膠成像分析系統(tǒng)為Molecular Imager Gel Doc XR System（美國Bio-Rad公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法將分離的菌株接種在普通營養(yǎng)瓊脂上37℃，培養(yǎng)18～24h，每個(gè)平板挑起3個(gè)單克隆菌落加100μl滅菌雙蒸水中混勻，煮沸10min，10000r/min離心5min，取上清做為PCR檢測(cè)的DNA模板，多重及單重PCR的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 菌株的多重PCR圖譜結(jié)果 見圖1。

2.2 檢出的致瀉性大腸埃希菌情況 281份糞便標(biāo)本的檢出17株致瀉性大腸埃希菌，陽性率為6.05%，其中aEPEC 4株，ETEC 6株，EAEC 7株。（見表 1）。

3 討論

致瀉性大腸埃希菌(DEC)是一類能引起腹瀉的重要病原菌，近年來由致瀉大腸埃希菌(DEC)引發(fā)的食物安全成為人們關(guān)心一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題。因此對(duì)DEC的快速診斷顯得尤為重要，但由于DEC與普通大腸埃希菌在表型上無明顯差異，用傳統(tǒng)的培養(yǎng)和生化分型方法無法有效進(jìn)行區(qū)分鑒別是否為DEC。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用多重PCR對(duì)致瀉性大腸埃希菌種屬鑒定（uidA 基因）和毒力基因（escV、bfpB、stx1、stx2、estⅠa、estⅠb、elt、invE、astA、aggR、pic）進(jìn)行檢測(cè)，能有效提高DEC的確診。本文對(duì)281份糞便標(biāo)本分離的大腸埃希菌進(jìn)行致瀉性大腸埃希菌檢測(cè)，共檢出17株DEC，陽性率為6.05%，其中aEPEC 4株，ETEC 6株，EAEC 7株，EHEC和EIEC未檢出。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道DEC陽性分離率為4.06%-12.0%不等[3-6]。優(yōu)勢(shì)菌群也不完全一樣，如北京和山西以EPEC為主，而浙江地區(qū)主要為EAEC，墨西哥和巴西以EAEC為主，秘魯以EHEC為主，不同國家不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌型不盡相同，可能與環(huán)境衛(wèi)生條件、經(jīng)濟(jì)狀況以及飲食結(jié)構(gòu)不同有關(guān)[7-9]。

圖1 多重PCR圖譜結(jié)果

表1 檢出的致瀉性大腸埃希菌情況

致瀉性大腸埃希菌(DEC)多重PCR主要根據(jù)毒力基因進(jìn)行鑒別，其設(shè)計(jì)引物的同時(shí)加入了uidA基因，是大腸埃希菌的屬共同基因，然后再根據(jù)EPEC （escV和bfpB同時(shí)陽性為典型EPEC，escV陽性但bfpB陰性為不典型EPEC，但stx1、stx2均為陰性結(jié)果）、EHEC(escV、stx1、stx2 中有一條或者一條以上陽性）、ETEC(estⅠa、estⅠb、elt中有一條或者一條以上陽性)、EIEC(invE)、EAEC(astA、aggR、pic中有一條或者一條以上陽性)，若毒力基因陽性，判斷為致瀉性大腸埃希菌(DEC)。本文中分離到4株 aEPEC 即非典型 EPEC （escV+、bfpB-、stx1-、stx2-），而典型 EPEC（escV+、bfpB+、stx1-、stx2-）沒有分離到，非典型EPEC也是近年來我省分離到比較多的 DEC 型別[4，9，13]，4 株 aEPEC 中有 3 株來自于小于1歲的嬰幼兒。6株ETEC均為毒力基因elt陽性，以成年人為主要感染者。而7株EAEC中各有3株分別為毒力基因aggR和pic單獨(dú)陽性，有1株為aggR和pic混合陽性，毒力基因的陽性分布差異是否與臨床癥狀相關(guān)，值得在今后進(jìn)一步加大樣本量深入研究[10-12]。

本次監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示17例致瀉性大腸埃希菌(DEC)感染中，年齡分布中最小為4個(gè)月，最大為80歲，其中有8例為小于3歲的嬰幼兒腹瀉感染者，有3例大于60歲感染者，表明嬰幼兒及老年人是DEC易感人群，應(yīng)該加強(qiáng)健康教育及成為重要監(jiān)測(cè)對(duì)象。17例病例均為6-9月份發(fā)現(xiàn)，表明夏秋季節(jié)是加強(qiáng)致瀉性大腸埃希菌監(jiān)控的時(shí)期[14-16]。

利用多重PCR能有效的監(jiān)測(cè)其他感染性腹瀉病例中致瀉性大腸埃希菌感染情況，能快速檢測(cè)其菌型分布及毒力基因攜帶情況，為掌握流行菌型變遷，為防控致瀉性大腸埃希菌疫情提供快速客觀的依據(jù)。

[1]Mosquito S，Ruiz J，PonsMJ，et al.Molecularmechanisms of antibiotic resistance in diarrhoeagenic Escherichia coli isolated from children[J].Int JAntimicrob Agents，2012，40(6)：544-548.

[2]趙嘉詠，朱敏，謝志強(qiáng)，等.河南省5種致瀉性大腸埃希菌病原學(xué)監(jiān)測(cè)[J].中國病原生物學(xué)雜志，2015，10(10)：924-926.

[3]林杰，陳愛平，陳建輝，等.2010年福建南平及永安監(jiān)測(cè)點(diǎn)致瀉大腸桿菌的監(jiān)測(cè)報(bào)告 [J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21(11)：3722-3725.

[4]林杰，陳愛平，楊勁松，等.檢測(cè)致瀉大腸桿菌的多重PCR方法的建立與應(yīng)用[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2012，18(12)：881-884.

[5]趙愛蘭，熊衍文，白雪梅，等.鑒定五類致瀉性大腸埃希菌和志賀菌的多重 PCR 方法[J].疾病監(jiān)測(cè)，2011，26(1)：65-67.

[6]李迎慧，邱亞群，洗慧霞，等.深圳市腹瀉人群致瀉性大腸埃希菌流行及病原特征研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2016，37(1)：115-118.

[7]孔海深.致瀉性大腸埃希菌的分子分型和流行病學(xué)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2011：4.

[8]張菊玲，崔恩博.致瀉大腸埃希菌的分布及耐藥性研究[J].傳染病信息，2012，25(3)：180-182.

[9]楊勁松，李玉燕，廖慧，等.2010-2012年福建省致瀉性大腸桿菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2014，3(20)：162-165.

[10]Bisi-Johnson MA，Obi CL，Vasaikar SD，et al.Molecular basis of virulence in clinical isolates of Escherichia coli and Salmonella species from a tertiary hospital in the Eastern Cape，South Africa[J].Gut Pathog，2011，3(1)：9-10.

[11]Ochoa TJ，Mercado EH，Durand D，et al.Frequency and pathotypes of diarrheagenic Escherichis coli in peruvian children with and without diarrhea[J].Rev Peru Med Exp Salud Public，2011，28(1)：13-20.

[12]王金良.新型腸出血性大腸埃希菌感染的檢驗(yàn)診斷與防治[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，29(4)：337-338.

[13]陳愛平.一種新的致病菌：非典型腸致病性大腸桿菌[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，17(6)：20-23.

[14]鄧艷華.食品和公共場(chǎng)所從業(yè)人員致瀉性大腸埃希菌攜帶情況分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，33(2)：161-162.

[15]鄭恩惠，李曲文，林杰，等.146株致瀉性大腸埃希菌多重PCR結(jié)果分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2017，23（3）：174-175.

[16]韋小瑜，游旅，田克誠，等.貴陽地區(qū)2013年腹瀉病例中致瀉性大腸桿菌的病原監(jiān)測(cè)分析 [J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2015，31（9）：881-882.

R446.5，R378.2+1

A

1674-1129(2017)05-0671-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.011

福建省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題（2011-CXB-19)

鄭恩惠，1987年生，檢驗(yàn)技師，本科，從事病原微生物檢驗(yàn)，郵箱：450279983@qq.com

陳愛平，副主任醫(yī)師，Email：cap2006@live.cn

2017-03-02；

2017-08-04)