尚鵬超 ，常艷珍 ，張曉飐 ，王俊杰 ，趙春 ，武娟 ，王敏

(1、周口市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 周口 466000；2、金域檢驗(yàn)鄭州實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000；3、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000)

胎兒染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)在周口市的臨床應(yīng)用分析

尚鵬超1，常艷珍2，張曉飐3，王俊杰1，趙春1，武娟1，王敏1

(1、周口市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 周口 466000；2、金域檢驗(yàn)鄭州實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000；3、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000)

目的 探討胎兒染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（non-invasive prenatal testing，NIPT）技術(shù)在周口市胎兒染色體非整倍體疾病篩查中的臨床應(yīng)用。方法 選取2014年1月-2015年11月間，在周口市中心醫(yī)院進(jìn)行唐氏綜合征篩查結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)（RISK＞1/275）、高齡孕婦(孕齡≥35歲)、有既往不良孕產(chǎn)史以及超聲檢查提示胎兒異常的共計(jì)829例孕婦，進(jìn)行胎兒染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因高通量測(cè)序分析，結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦手術(shù)抽取羊水后核型分析。結(jié)果 612例唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦組經(jīng)外周血胎兒游離DNA檢測(cè)結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)者共計(jì)7例（6例21-三體、1例18-三體）；169例高齡孕婦組共檢出1例18-三體結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)者；7例既往不良孕產(chǎn)史孕婦組檢出1例21-三體結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)者；41例超聲檢查提示胎兒異常孕婦組共檢出2例結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)（1例21-三體、1例13-三體）。NIPT結(jié)果提示21、18、13-三體異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦分別為8例、2例、1例，進(jìn)一步行染色體核型分析的確診例數(shù)分別為：8例、2例、1例，結(jié)果證實(shí)NIPT用于檢測(cè)胎兒21-三體、18-三體、13-三體的敏感度為100%，特異度為100%，準(zhǔn)確率100%，與染色體核型分析結(jié)果一致。結(jié)論 周口市孕婦外周血游離胎兒DNA高通量測(cè)序分析可用于胎兒常見染色體非整倍體疾病的篩查，敏感度高、特異度強(qiáng)、準(zhǔn)確率高應(yīng)推廣臨床應(yīng)用。

NIPT；無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)；非整倍體；游離胎兒DNA；染色體

中國(guó)是出生缺陷高發(fā)國(guó)家，每年新增缺陷兒高達(dá)120萬(wàn)，約占每年出生人口的4%-6%。胎兒染色體異常是臨床最常見的出生缺陷類型之一，95%為非整倍體異常，常見類型有21-三體、18-三體、13-三體以及性染色體綜合征等[1]，由于染色體異常所致疾病治療困難、效果不滿意，可靠的產(chǎn)前篩查診斷是目前避免此類病患兒出生、提高人口質(zhì)量的有效方法。Lo YM[2]、湯冬玲[3]文獻(xiàn)報(bào)道了孕婦外周血游離胎兒DNA的發(fā)現(xiàn)，為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)提供了新的可靠方法，基于孕婦外周血游離胎兒DNA測(cè)序技術(shù)的NIPT技術(shù)主要針對(duì)13、18和21號(hào)染色體非整倍體進(jìn)行測(cè)定，可避免有創(chuàng)性產(chǎn)前篩查帶來(lái)的胎兒丟失、宮內(nèi)感染等并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)[4]，并且有高通量以及周期短等優(yōu)勢(shì)；同時(shí)與傳統(tǒng)母體血清學(xué)產(chǎn)前篩查有著較高的假陽(yáng)性率[5]相比，有著敏感度高、特異度強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；臨床應(yīng)用前景樂(lè)觀。現(xiàn)對(duì)周口市829例接受高通量基因測(cè)序技術(shù)NIPT實(shí)驗(yàn)的孕婦結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，探討NIPT技術(shù)用于篩查胎兒常見非整倍體染色體疾病的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇周口市中心醫(yī)院2014年1月-2015年11月經(jīng)唐氏綜合征篩查 （孕婦血清AFP、β-HCG、二聯(lián)指標(biāo)檢測(cè)）提示高風(fēng)險(xiǎn)（RISK＞1/275）的612例孕婦、169例高齡孕婦(預(yù)計(jì)孕齡≥35歲)、7例既往不良孕產(chǎn)史孕婦以及41例超聲檢查提示胎兒異常孕婦，共計(jì)829例，年齡24～41（32±1.7）歲，孕 12～24 周。

1.2 方法

1.2.1 孕婦外周血NIPT實(shí)驗(yàn)孕婦外周血NIPT實(shí)驗(yàn)與廣州達(dá)安基因臨床檢驗(yàn)中心合作，采集孕婦外周血 5ml EDTA抗凝，4h內(nèi) 4°C 1600r/min 10min分離血漿，提取血漿后-80°C保存送檢，高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析服務(wù)由廣州達(dá)安基因臨床檢驗(yàn)中心完成。

1.2.2 羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析NIPT結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)者行羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析證實(shí)。孕婦自愿簽訂產(chǎn)前診斷同意書，于16-24周在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水20ml，送實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，G顯帶后染色體分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析孕婦外周血NIPT的指征構(gòu)成比和NIPT陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，采用描述性分析，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和率表示。IBM SPSSStatistics 19.0軟件對(duì)組間年齡進(jìn)行χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)結(jié)果612例唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦組經(jīng)外周血胎兒游離DNA檢測(cè)結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)者共計(jì)7例（6例21-三體、1例18-三體）；169例高齡孕婦組共檢出1例18-三體結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)者；7例既往不良孕產(chǎn)史孕婦組共檢出1例21-三體結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)者；41例超聲檢查提示胎兒異常孕婦組共檢出2例（1例21-三體、1例13-三體）結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)者；性染色體異常未提示。見表1。

2.2 孕婦外周血胎兒游離DNA檢測(cè)結(jié)果與羊水染色體核型分析結(jié)果比較11例外周血胎兒游離DNA高風(fēng)險(xiǎn)者，經(jīng)孕婦同意，均手術(shù)抽取羊水進(jìn)行染色體核型分析，羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析結(jié)果與外周血胎兒游離DNA檢測(cè)結(jié)果一致，敏感度100%、特異度100%、準(zhǔn)確率100%，性染色體異常未見，并流產(chǎn)后、產(chǎn)后查體確診無(wú)差錯(cuò)。NIPT檢測(cè)結(jié)果提示低風(fēng)險(xiǎn)者流產(chǎn)后、妊娠后電話隨訪，均未發(fā)現(xiàn)遺漏診斷病例。見表2。

3 討論

21-三體綜合征（唐氏綜合征）又稱先天愚型或Down綜合征，是最為常見的染色體三體征，60%患兒在胎內(nèi)早期即流產(chǎn)，存活者有明顯的智能落后、特殊面容、生長(zhǎng)發(fā)育障礙和多發(fā)畸形。18-三體綜合癥（愛德華氏綜合征）是僅次于先天愚型的第二種常見染色體三體征，臨床畸形主要表現(xiàn)在骨骼、泌尿生殖系統(tǒng)、心臟等，此外皮膚、毛發(fā)、肺及腎也可異常。13-三體綜合征（帕陶氏綜合征）臨床畸形有小頭，前額、前腦發(fā)育缺陷，男性常有陰囊畸形和隱睪，女性則有陰帝肥大，雙陰道、雙角子宮等。針對(duì)以上常見三種胎兒常染色體非整倍體基因異常疾病的篩查，實(shí)驗(yàn)室目前應(yīng)用比較廣泛的有無(wú)創(chuàng)和有創(chuàng)兩種產(chǎn)前診斷技術(shù)，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷是應(yīng)用孕婦外周血清 （AFP、β-HCG、uE3）指數(shù)二聯(lián)或三聯(lián)篩查及超聲檢查，但準(zhǔn)確率為60～70%[6]；有創(chuàng)產(chǎn)前診斷染色體核型分析準(zhǔn)確率高，能分析除數(shù)目異常外的結(jié)構(gòu)異常，是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[7]，但有創(chuàng)產(chǎn)前診斷有0.5～2%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，并且可導(dǎo)致胎膜早破、絨毛羊膜炎、陰道出血、早產(chǎn)等并發(fā)癥，孕婦依從性差，技術(shù)本身還存在5%以上的假陽(yáng)性率，診斷通量低下，專業(yè)人員缺乏，人員培訓(xùn)及實(shí)驗(yàn)室建設(shè)周期長(zhǎng)，報(bào)告時(shí)限過(guò)長(zhǎng)等諸多問(wèn)題[8]。1997年在孕婦外周血首次檢出胎兒游離DNA，基于孕婦外周血胎兒游離DNA高通量基因測(cè)序的NIPT技術(shù)經(jīng)過(guò)十多年發(fā)展，該技術(shù)日益完善，為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷開辟了一條新道路。Chiu[9]等文獻(xiàn)報(bào)道NIPT技術(shù)對(duì)于檢測(cè)21-三體的敏感度100%、特異度97.9%；Chen[10]等文獻(xiàn)報(bào)道該技術(shù)對(duì)18-三體和13-三體的檢測(cè)敏感度和特異度分別為91.9%、98.0%以及 100%、98.9%；林穎[11]等文獻(xiàn)報(bào)道該技術(shù)對(duì)21-三體的檢測(cè)敏感度特異度均為100%；鄧璐莎[12]等文獻(xiàn)報(bào)道該技術(shù)對(duì)21-三體、18-三體和13-三體的檢測(cè)敏感度100%，特異度99.9%；姚婷[13]等文獻(xiàn)報(bào)道該技術(shù)的對(duì)21-三體、18-三體和13-三體的檢測(cè)敏感度100%，特異度99.9%。本研究采用準(zhǔn)確度高、無(wú)創(chuàng)簡(jiǎn)單取樣、無(wú)并發(fā)癥等優(yōu)點(diǎn)的高通量基因測(cè)序技術(shù)[14]，對(duì)829例孕婦外周血游離胎兒DNA行NIPT檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該技術(shù)對(duì)21-三體、18-三體和13-三體的檢測(cè)敏感度100%、特異度100%，與以上[9-13]文獻(xiàn)報(bào)道基本相符，但檢出率與以上[9-13]文獻(xiàn)略有出入以及性染色體異常未檢測(cè)可能與本研究樣本偏少有關(guān)，有待進(jìn)一步積累臨床資料再探討；研究人群年齡[24～41（32±1.7）歲]與宋桂寧[15]等研究報(bào)道的臨床孕婦幾乎一半為高齡孕婦基本相符，但高齡孕婦胎兒所患染色體疾病的概率也隨之增加[16]，隨著我國(guó)普遍二胎計(jì)劃生育政策的實(shí)施，相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)高齡孕婦占比會(huì)越來(lái)越大，NIPT檢測(cè)的臨床推廣意義重大。

表1 NIPT檢測(cè)結(jié)果

表2 NIPT檢測(cè)結(jié)果與羊水染色體核型分析結(jié)果比較

NIPT技術(shù)的臨床應(yīng)用主要指征為：⑴高齡；⑵常規(guī)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)；⑶既往有（21、18、13）號(hào)染色體非整倍體生育史；⑷胎兒超聲軟指標(biāo)異常提示與染色體非整倍體相關(guān)[17]。慎用人群為：⑴孕周＜12 周；⑵高體重（體重＞100kg）；⑶體外受精-胚胎移植方式受孕；⑷雙絨毛膜性雙胎妊娠；⑸合并腫瘤；⑹獨(dú)立影像學(xué)篩查軟指標(biāo)提示常見染色體非整倍體似然比高的（鼻骨缺失、NF最高等）；⑺孕婦一年內(nèi)接受過(guò)異體血制品、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療、4周內(nèi)接受過(guò)免疫治療等；⑻夫妻一方明確染色體異常。此技術(shù)也存在一定的缺陷：⑴孕婦自體染色體異常；⑵多胎孕婦，此類孕婦更加需求；⑶目前僅檢測(cè)21-三體、18-三體、13-三體以及性染色體數(shù)目異常，嵌合體型染色體、染色體結(jié)構(gòu)異常（微缺失、微重復(fù)、易位等）以及性染色體異常的檢測(cè)有困難等；⑷游離胎兒DNA含量低于檢測(cè)下限時(shí)會(huì)導(dǎo)致降低結(jié)果的特異性、敏感度和準(zhǔn)確性；⑸收費(fèi)偏高。因此NIPT技術(shù)還不能作為診斷方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的胎兒產(chǎn)前篩查和診斷，有待進(jìn)一步完善。

綜上所述，有著敏感度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高、無(wú)胎兒丟失臨床風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)的NIPT檢測(cè)技術(shù)，理應(yīng)在人口數(shù)量約占全國(guó)人口總數(shù)1%的周口市大力推廣，為減少出生缺陷兒、提高人口質(zhì)量提供強(qiáng)有力的臨床技術(shù)保障。

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Clinical application and analysis of non-invasive prenatal testing technology in Zhoukou City

SHANG Pengchao1，CHANG Yanzhen2，ZHANG Xiaozhan3，WANG Junjie1，ZHAO Chun1，WU Juan1，WANG Min1.
1.Zhoukou Central Hospital，Henan zhoukou 466000，China；2.Zhengzhou Lab of KingMED Diagnostics Zhengzhou 450000，China；3.Departmentof Clinical Laboratory；the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China.

Objective To explore the clinical application of non-invasive prenatal testing technology in the screening of fetal chromosomal non-integral disease in Zhoukou city.M ethods From January 2014 to November 2015 in the Central Hospital of Zhoukou city，829 cases of pregnantwomen were enrolled，including the screening results of Down's syndrome indicated that high risk(risk＞1/275)，elderly women(gestational age equal to or above 35 years old)，previous adverse pregnancy history，and ultrasound examination suggest fetal anomalies.The high throughput sequencing analysis of fetal chromosomal aneuploidy without invasive prenatal geneswas conducted，which could provide the karyotype analysis of those high risk pregnantwomen within amniocentesis surgery.Results A total of seven cases(six cases 21-triploid，one case of 18-triploidy)within 612 cases of Down's screening high risk group of pregnantwomen showed high risk，based on the peripheral blood free fetal DNA detection.One case of high risk 18-triploid was detected within 169 cases of pregnant women.One case of high risk 21-trisomy was detected within seven cases of adverse pregnancy history of pregnantwomen results.Two cases of pregnantwomen with high risk(one case of 21-triploid，one case of 13-triploid)were detected within 41 cases of ultrasound fetal abnormalities.These results suggested that NIPT(21，18，13)-trisomy of high risk pregnant women were 8 cases，2 cases，1 case，respectively.The cases of further diagnosed and karyotype analysis were 8 cases，2 case，1 case，respectively.The results indicated that the sensitive，specificity，and accuracy rate of NIPT for detecting the fetal 21-trisomy，18-trisomy，13-trisomy was 100%.And this result was consistent with the karyotype analysis.ConclusionThe high throughput sequencing analysis ofmaternal peripheral blood cell free fetal DNA with high sensitive，specificity，and accuracy rate could be used for common fetal chromosome aneuploid disease screening，and be applied in clinic.

Non-invasive prenatal testing；Noninvasive prenatal testing；Aneuploid；Cell-free fetal DNA；Chromosome

R596.1

A

1674-1129(2017)05-0661-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.008

尚鵬超，男，1980年生，學(xué)士學(xué)位，主管檢驗(yàn)技師，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)，主要研究方向：臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)以及分子診斷。

2017-04-17；

2017-07-16)