陳大偉，夏文杰，徐秀章，鄧晶，葉欣

(廣州市廣州血液中心，廣東 廣州 510095)

實體器官移植失敗患者HLA和HPA抗體篩查及特異性分析

陳大偉，夏文杰，徐秀章，鄧晶，葉欣

(廣州市廣州血液中心，廣東 廣州 510095)

目的 了解廣州地區(qū)實體器官移植失敗患者中HLA抗體和HPA抗體的分布和特異性，初步探索HLA抗體及HPA抗體與實體器官免疫性排斥反應的相關性。方法 隨機收集廣州地區(qū)實體器官移植失敗患者標本136例，利用Lifecodes LifeScreen Deluxe（LMX）篩查標本的HLA抗體，陽性者再分別利用LIFECODES LSATMClassⅠ和LIFECODES LSATMClassⅡ（Single Antigen）鑒定抗體特異性；利用Lifecodes PAKR 2LE對HPA抗體進行篩查，陽性標本利用MAIPA進行最終確證。結果 廣州地區(qū)136例實體器官移植失敗患者中，抗-HLA陽性率55.15%（75/136），其中HLA-Ⅰ類抗體出現(xiàn)頻率為38.97%（53/136），HLA-Ⅱ類抗體出現(xiàn)頻率為42.65%（58/136）。HLA-Ⅰ類抗體中出現(xiàn)頻率較高的分別是抗-A*02 35.85%（19/53）、 抗-B*15 47.17%（25/53） 和抗-Cw*07 28.30%（15/53），HLA-Ⅱ類抗體出現(xiàn)頻率最高者是抗-DRB1*04 39.66%（23/58）和抗-DQB1*03 46.55%（27/58）。此外，檢出HPA-5bb抗體一例。結論 初步探討了廣州地區(qū)實體器官移植失敗患者HLA抗體及HPA抗體的分布情況，證實HLA抗體與移植后的免疫排斥反應密切相關。

實體器官移植；HLA抗體；HPA抗體；抗體篩查；抗體特異性

近年來越來越多的研究表明，抗體介導的體液排斥反應在移植物損傷過程中發(fā)揮著十分重要的作用。實體器官移植受者在接受了HLA不同的移植物后，體內(nèi)產(chǎn)生抗HLA抗體而成為致敏狀態(tài)。致敏不但與急性排斥有關，而且與慢性排斥及長期存活率也有關[1，2]。術前對HLA抗體進行檢測已是國內(nèi)外移植配型中心的常規(guī)，但是對術后HLA抗體的監(jiān)測尚未引起廣泛關注。移植后特異性HLA抗體的產(chǎn)生可增加移植物急、慢性排斥反應，縮短移植物的生存周期。本文擬通過檢測實體器官移植失敗患者抗人類白細胞抗原（HLA）抗體和抗人類血小板（HPA）抗體，了解廣州地區(qū)實體器官移植失敗患者體內(nèi)HLA抗體和HPA抗體的分布情況，初步探索移植失敗與HLA抗體和HPA抗體之間的關系，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象的選擇隨機選取廣州血液中心臨床輸血研究所2012年至2015年間，實體器官移植失敗患者136例，其中男性74例，女性62例，年齡39.4±13.5歲，作為實驗對象，采集靜脈全血10ml，EDTA 抗凝。

1.2 試劑與儀器LifeScreen Deluxe（美國Lifecodes，批號：3000383），LSATMClassⅠ（美國 Lifecodes，批號：09172B）和 LSATMClassⅡ（美國 Lifecodes，批號：10102A），PAKR 2LE（美國 Lifecodes，批號：3000205），配套儀器 Luminex（美國 Lifecodes，型號：Luminex 200）；酶標板 （英國Multiscreen，批號：R2KA41796），酶標儀（美國 Biotek，型號：ELX800GTI）；水平搖床 （美國Orbital，型號：MX100-4A）；真空泵（美國 Millipore，型號：WP6122050）。

1.3 抗體檢測

1.3.1 HLA抗體篩查利用LifeScreen Deluxe（LMX）試劑盒進行檢測。在酶標板中，每孔依次加入 20μl洗液、2.5μl磁珠和 7μl待測標本血清或?qū)φ昭?，混勻，室溫下置于搖床上（200r/min），避光孵育30min；之后每孔加入 60μl洗液，混勻，轉(zhuǎn)移至過濾板中；每孔加入120μl洗液，用真空泵吸出，再重復操作2次；每孔加入25μl稀釋為1×的濃縮酶聯(lián)物 (10×的結合了藻紅蛋白的羊源抗人類IgG抗體)，室溫下，置于水平搖床上（200r/min）避光孵育30min；每孔加入120μl洗液，混合，重懸磁珠。利用Luminex儀器收集數(shù)據(jù)，采用分析軟件Launch MatchIT（version 1.00）中的 LifeScreen 進行分析。

1.3.2 HLA抗體特異性分析根據(jù)HLA抗體篩查的情況，陽性標本分別進行HLA-Ⅰ抗體和HLA-Ⅱ抗體特異性分析。利用LSATM ClassⅠ/Ⅱ（LSA）試劑盒進行特異性分析。在酶標板中，每孔依次加入20μl LSA磁珠和7μl待測標本血清或?qū)φ昭?，混勻，室溫下置于搖床上（200r/min），避光孵育30min；之后每孔加入60μl洗液，混勻，轉(zhuǎn)移至過濾板中；每孔加入120μl洗液，用真空泵吸出，再重復操作2次；每孔加入25μl稀釋為1×的濃縮酶聯(lián)物，室溫下，置于水平搖床上（200r/min）避光孵育30min；每孔加入120μl洗液，混合，重懸磁珠。利用Luminex儀器收集數(shù)據(jù)，采用分析軟件Launch MatchIT（version 1.00）中的 Single Antigen 進行分析。

1.3.3 HPA抗體篩查用超純水將濃縮洗液稀釋為1×工作液，將待檢血漿和對照血清稀釋到工作濃度；取出微孔板加工作液300μl進行清洗，按事先安排加入50μl質(zhì)控血清和待檢血清，37℃水浴30min，洗板，除空白對照孔，其余加入1：100稀釋的酶結合物 50μl，37℃水浴 30min，洗板，加入稀釋的 PNPP 100μl，避光孵育 30min，加入 100μl終止液終止反應，空白孔加入200μl終止液，用酶標儀在405或者410nm處讀取各孔吸光度。

1.3.4 HPA抗體確證利用血小板抗原單克隆抗體特異性免疫固定檢測（MAIPA）進行HPA抗體的確證。用coating buffer將羊抗人IgG稀釋包被于96孔平底板中，4℃孵育過夜；采集已知HPA特異性的O型供者全血，分離血小板；根據(jù)實驗需要的格局，向96孔U型板中加入相應的血小板懸浮液，100μl/孔； 加入待檢血漿，25μl/孔， 震蕩混勻，37℃孵育30min；利用TBS/BSA緩沖液去除未結合的免疫球蛋白；利用TBS/BSA緩沖液稀釋鼠抗人單克隆抗體，加入U型板中，40μl/孔，重懸血小板；利用TBS/BSA緩沖液去除未結合的單克隆抗體；向U型板中加入Solubilization緩沖液，4℃孵育30min，充分裂解血小板膜；從U型板上清中吸取100μl裂解液，加入已包被的平底板相應的孔中，4℃孵育90min；用Tween洗液去除未結合的裂解蛋白；將過氧化物標記的羊抗人IgG用Tween洗液按 1：6000 稀釋，100μl/孔加入平底板中，4℃孵育90min；用Tween洗液去除未結合的酶標抗體；每孔加入100μl OPD溶液，室溫顯色20-30min，每孔加入100μl終止液終止反應；用酶標儀讀板，波長490mm。

2 結果

2.1 實體器官移植失敗患者HLA抗體篩查情況136例實體器官移植失敗患者，HLA抗體陽性率為55.15（75/136），男性患者中HLA抗體陽性率為51.35（38/74），女性患者中HLA抗體陽性率為59.68（37/62），見表 1。

2.2 實體器官移植失敗患者HLA抗體特異性分析分別對53例HLA-Ⅰ類抗體陽性和58例HLA-Ⅱ類抗體陽性的患者進行HLA抗體特異性分析。HLA-I類抗體中出現(xiàn)頻率較高的有A*24、A*02、B*15、B*35、Cw*07 和 Cw*17 等，見表 2，3。

表1 實體器官移植失敗患者HLA抗體篩查結果（%）

2.3 實體器官移植失敗患者HPA抗體篩查及特異性分析對136例血清進行HPA抗體篩查及特異性分析，僅發(fā)現(xiàn)一例HPA抗體陽性，經(jīng)MAIPA鑒定為HPA-5bb抗體，合并出現(xiàn)HLA抗體。

3 討論

人類白細胞抗原（HLA）是介導器官移植排斥反應的主要分子，患者在多次輸血、妊娠或者移植后受到同種HLA免疫致敏可產(chǎn)生群體反應性抗體（PRA），且影響移植物長期存活[3]。一項多中心研究表明術后出現(xiàn)HLA抗體的受者移植腎功能喪失的發(fā)生率明顯高于未出現(xiàn)抗HLA抗體的患者[4]。鄧晶[5]等對廣州地區(qū)無償獻血員HLA抗體的分布進行研究，發(fā)現(xiàn)其HLA抗體出現(xiàn)的頻率為3.53%（13/368）。本研究對廣州地區(qū)2012年至2015年間136例實體器官移植失敗的患者進行HLA抗體分布調(diào)查，發(fā)現(xiàn)實體器官移植失敗的患者HLA抗體頻率為55.15%（75/136），與廣州地區(qū)無償獻血員[5]相比差異明顯，有統(tǒng)計學意義。

表2 53名實體器官移植失敗患者HLA-Ⅰ類抗體的特異性

表3 58名實體器官移植失敗患者HLA-Ⅱ類抗體的特異性

Harris PE[6]等研究發(fā)現(xiàn)抗HLA-I類抗體可降低移植腎存活率，并能明顯增加排斥反應的發(fā)生，而HLA-II類抗體對移植腎的長期存活可能有影響。不同區(qū)域和種族之間HLA抗原分布不同，地域抗原的特異性導致HLA抗體分布的差異，高頻抗原誘發(fā)產(chǎn)生高頻抗體[7]。本試驗中出現(xiàn)頻率較高的HLA-I類特異性抗體分別有 HLA-A*11，A*23，B*18，B*14，Cw*03和Cw*12等，對照本實驗室建立的健康獻血者血小板HLA基因庫[8]，抗體特異性與基因庫中頻率較高的特異性抗原基本一致。此外，研究表明HLA-DRB1與多種自身免疫性疾病和感染性疾病相關，還與器官移植前供者與受者的配型相關[9，10]。目前，世界衛(wèi)生組織命名的HLADRB1等位基因超過了460種，具有高度的多態(tài)性，與種族，地域有一定的相關性，各地區(qū)又有其自身的特點[11-13]。孫瑜等[14]對江西地區(qū)漢族造血干細胞志愿捐獻者的HLA-DRB1基因多態(tài)性進行了分析研究，其中基因頻率最高的是DRB1*04（15.2%）。

Gorgi Y[15]等對法國地區(qū)腎移植與人血小板抗原多態(tài)性之間的關系進行研究，發(fā)現(xiàn)位于GPIIb/IIIa糖蛋白上的HPA-4b作為一種獨立的風險因素，可影響腎移植的排斥反應。根據(jù)夏文杰等[16]對廣東地區(qū)無償獻血者HPA基因型的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣東地區(qū)HPA-4b出現(xiàn)的頻率為0，故暫不必考慮其對器官移植的影響。根據(jù)Kotzampasaki EM等[17]對HPA-5的研究發(fā)現(xiàn)，HPA-5錯配可能會導致移植后移植物抗宿主病的發(fā)生。本研究中，在實體器官移植失敗的患者中發(fā)現(xiàn)一例HPA-5bb抗體合并HLA抗體?？紤]到HPA抗體對實體器官移植的影響尚未達到統(tǒng)一認可，而且本研究患者例數(shù)較少，擬通過擴大樣本量進行進一步的研究。

眾多研究表明，HLA抗體是實體器官移植的高危因素，本研究亦發(fā)現(xiàn)實體器官移植失敗患者中HLA抗體出現(xiàn)的頻率明顯高于普通人群，再次證實HLA抗體與器官移植之間的密切關系。

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Screening and analysis of HLA and HPA antibodies in patients w ith failed solid organ transplantation

CHEN Dawei，XIA Wenjie，XU Xiuzhang，DENG Jing，YE Xin.
Guangzhou Blood Center，Guangzhou 510095，China.

Objective To elucidate the distribution of HLA/HPA antibodies in patients with failed solid organ transplantation in Guangzhou and identify the specificities of the HLA/HPA antibodies.To explore the relationship between HLA/HPA antibodies and rejection reaction of organ transplantation preliminarily.M ethods Random ly collected blood samples of 136 patients with failed solid organ transplantation.Screened all sampleswith Lifecodes LifeScreen Deluxe(LMX)for HLA antibody test and carried out the antibody specificity detection in the positive samples with LIFECODES LSATMClass I and LIFECODES LSATM Class II(Single Antigen)；Screened all sampleswith Lifecodes PAKR 2LE for HPA antibody testand carried out the antibody specificity detection in the positive sampleswith MAIPA.Results Among 136 patientswith failed solid organ transplantation in Guangzhou，the positive rate of HLA antibodies was 55.15%(75/136)，the frequency of HLA-I antibody and HLA-II antibody were 38.97%(53/136)，42.65%(58/136).The highest frequencies of HLA-I alloantibodies were anti-A*02 35.85%(19/53)，anti-B*15 47.17%(25/53)，anti-Cw*07 28.30%(15/53)，while themost HLA-IIalloantibody were anti-DRB1*04 39.66%(23/58)and anti-DQB1*03 46.55%(27/58).Besides，HPA-5bb antibody was detected in only one sample.Conclusion The study obtained the information about the frequency of HLA/HPA antibodies in the failed patientswith solid organ transplantation in Guangzhou，and the HLA antibodies were closely related to the immune rejection after transplantation.

Solid organ transplantation；HLA antibody；HPA antibody；Antibody screening；Specificities of antibodies

R446.62，R617

A

1674-1129(2017)05-0646-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.004

廣東省醫(yī)學科學技術研究基金項目（A2016616），廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（20171A011281），廣州市科技計劃項目（201707010021）。

陳大偉，男，1988年生，碩士研究生，主要從事血小板免疫方面的研究。

葉欣，女，1968年生，主任醫(yī)師，主要從事HLA抗原抗體檢測及血小板免疫方面的研究。

2017-04-14；

2017-08-10)