王琪，沈凌煒，錢韻

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310003)

·論 著·

B7-H4在胰腺癌中的表達(dá)及與臨床病理及預(yù)后的相關(guān)性分析

王琪，沈凌煒，錢韻

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310003)

目的 研究B7-H4異常表達(dá)于胰腺癌組織，其表達(dá)水平與胰腺癌預(yù)后的相關(guān)性。方法 收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院2011年1月至2014年12月間胰腺癌切除手術(shù)取得的胰腺癌組織（188例），以及非腫瘤患者胰腺組織（25例）。通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)B7-H4在上述組織中的表達(dá)。結(jié)果 胰腺癌組織中B7-H4表達(dá)陽性率為100%，明顯高于非腫瘤患者胰腺組織（68%），且胰腺癌組織中B7-H4的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。同時(shí)，胰腺癌組織中B7-H4的表達(dá)水平與TNM分級(jí)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及分化顯著相關(guān)。多因素生存分析顯示，B7-H4表達(dá)水平、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及化療為獨(dú)立的胰腺癌預(yù)后指標(biāo)。結(jié)論 B7-H4在胰腺癌組織中異常表達(dá)，為獨(dú)立的胰腺癌不良預(yù)后指標(biāo)，有望成為胰腺癌治療的免疫靶點(diǎn)。

B7-H4；胰腺癌；預(yù)后；生物標(biāo)志；免疫組化

胰腺癌是高死亡率癌癥之一，其五年存活率＜6%[1]。胰腺癌高侵襲性和隱匿性的特點(diǎn)導(dǎo)致其預(yù)后極差[2]，且其增長(zhǎng)快、轉(zhuǎn)移早，被確診時(shí)大部分患者已發(fā)展成晚期[3]。因此，尋找胰腺癌早期生物標(biāo)志物以及確定這些標(biāo)志物與疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)移與預(yù)后的關(guān)系顯得尤為重要，這些生物標(biāo)志物可以用來評(píng)估胰腺癌切除手術(shù)病人的預(yù)后[4]。B7家族在腫瘤免疫逃避機(jī)制中發(fā)揮重要作用，影響患者預(yù)后[5]。

B7-H4是B7家族中的一員，抑制T細(xì)胞增殖、IL-2的產(chǎn)生及細(xì)胞周期進(jìn)展，與腫瘤T細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)[6，7]。B7-H4在不同的腫瘤中異常表達(dá)，包括乳腺癌[8]，非小細(xì)胞肺癌[9]，卵巢癌[10]，腎細(xì)胞癌[11]。B7-H4能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]，異常表達(dá)B7-H4的患者其總體存活率較差[13]，胰腺癌中B7-H4 表達(dá)水平[11，12，14-16]與其病理特征有密切相關(guān)[17]，因此B7-H4有望成為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)記物[14-16]，然而B7-H4的表達(dá)與胰腺癌的病理分級(jí)分期尚未明確。本研究通過免疫組織化學(xué)染色方法測(cè)定B7-H4的表達(dá)水平，并分析其與胰腺癌患者總生存期(OS)的相關(guān)性，進(jìn)而判斷B7-H4能否作為胰腺癌獨(dú)立的指標(biāo)，為胰腺癌的免疫治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病人和組織標(biāo)本實(shí)驗(yàn)對(duì)2011年1月至2014年12月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院的188例胰腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了分析。臨床數(shù)據(jù)包括病人信息、腫瘤分化、腫瘤分級(jí)和治療方法。與此同時(shí)收集了同一時(shí)期的25例良性胰腺疾病患者（如胰腺炎和囊腫）為臨床對(duì)照組。所有組織樣本為石蠟組織切片，并由兩名病理醫(yī)生通過HE染色切片明確診斷。本研究遵循浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院醫(yī)學(xué)倫理。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 使用EnVisionTM兩步法(Dako，斯特魯普，丹麥)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將石蠟包埋組織進(jìn)行5μm連續(xù)切片并轉(zhuǎn)移到干燥免疫組化專用玻片，然后脫蠟、水化、封閉、PBS洗滌三次、羊血清封閉減少非特異性結(jié)合，最后將組織與兔抗-B7-H4單克隆抗體4°C孵育過夜，隨后滴加相應(yīng)二抗，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，中性樹脂封片。

1.3 評(píng)價(jià)B7-H4染色請(qǐng)兩位沒有接觸到患者臨床信息的病理醫(yī)生隨機(jī)選出5個(gè)400倍鏡下放大切片視野，進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，染色結(jié)果表明B7-H4高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。以半定量方法[13]評(píng)估B7-H4的表達(dá)，其陽性細(xì)胞的比例計(jì)分如下：0(＜5%)；1(6%-25%)；2(26%-50%)；3(51%-75%)；4(＞75%)。 染色強(qiáng)度評(píng)估如下：0(無染色)；1(弱染色，淡黃色)；2(溫和的染色，黃棕色)；3(強(qiáng)染色，深棕色)。染色積分是陽性比例乘以染色強(qiáng)度：0(陰性)；1-4(弱陽性)；5-8(中度陽性)；9-12(強(qiáng)陽性)。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)定染色積分＜9時(shí)，B7-H4為低表達(dá)；≥9時(shí)，B7-H4為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，由單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析B7-H4的表達(dá)和臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系?？偵嫫?OS)的計(jì)算為胰腺癌的初診到患者死亡。采用Kaplan-Meier分析和log rank檢驗(yàn)分析患者生存期差異，多變量Cox回歸分析獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床特征本研究包含的188例胰腺癌均為患者浸潤(rùn)性導(dǎo)管腺癌，其中男性112例、女性76例，該188例胰腺癌患者的手術(shù)年齡中位數(shù)是 65歲(范圍：35-82歲)，具體數(shù)據(jù)見表 1，直至2016年12月，由隨訪證實(shí)188名患者均已死亡。

2.2 胰腺癌中B7-H4的表達(dá) 免疫組化染色顯示，胰腺癌患者組織中B7-H4的表達(dá)陽性率(188/188，100%)較正常及良性胰腺組織（17/25，68%，P＜0.01）高，且B7-H4的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高(5.10±2.97 vs 0.86±0.75，P＜0.01)。

2.3 B7-H4表達(dá)和臨床病理特征之間的關(guān)系 B7-H4的表達(dá)水平和臨床病理特征之間的關(guān)系如表1。B7-H4在胰腺癌組織樣本中的表達(dá)與TNM分級(jí)(TNM 1-2：4.16±2.04 vs TNM 3-4：7.50±3.60，P＜0.01) 遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移 (轉(zhuǎn)移：7.68±3.61 vs 無轉(zhuǎn)移：4.31±2.23，P＜0.01) 和分化狀態(tài) (分化良好：2.43±2.46 vs分化較差：7.34±3.46，P＜0.01)密切相關(guān)，與患者在診斷時(shí)的年齡(＜65和≥65年)、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，或是否化療沒有關(guān)系。

表1 B7-H4表達(dá)與胰腺癌患者的臨床特征的相關(guān)性及單變量分析的總體生存率

2.4 B7-H4表達(dá)和總生存期的關(guān)系使用kaplanmeier分析胰腺癌組織B7-H4的表達(dá)水平與病人生存期的相關(guān)性。直至實(shí)驗(yàn)最后跟進(jìn)，188名患者均死亡，其生存期中位數(shù)是9.90±0.58個(gè)月(95%可信區(qū)間：8.76～11.04個(gè)月)。高表達(dá)B7-H4的胰腺癌患者的生存期 (3.80±0.84；95%可信區(qū)間：2.16-5.44)較低表達(dá)B7-H4的胰腺癌患者的生存期(10.80±0.82；95%可信區(qū)間：9.18～12.42；P＜0.01；圖1)明顯縮短。其他預(yù)后因素包括遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(P＜0.01)，TNM 分級(jí)(P＜0.01)，分化狀態(tài)(P＜0.01)，化療(P＜0.05)也被證實(shí)能降低總生存期，如表1。

此外，多變量分析B7-H4的表達(dá)水平(相對(duì)危險(xiǎn)度：1.744；95%可信區(qū)間：1.087～2.799；P＜0.05)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移 (相對(duì)危險(xiǎn)度：2.684；95%可信區(qū)間：1.26605.691；P＜0.05) 及化療 (相對(duì)危險(xiǎn)度：0.613；95%可信區(qū)間：0.449-0.838；P＜0.01)為獨(dú)立的胰腺癌預(yù)后判斷指標(biāo)，如表2。

表2 多變量分析的總體生存率

圖1 kaplan-m eier及l(fā)og rank檢驗(yàn)分析胰腺癌患者總生存期(OS)。Kap lan-meier分析表明高表達(dá)B7-H4的胰腺癌患者比低表達(dá)B7-H4的患者生存期短(P＜0.01)。

3 討論

最近的研究表明，B7-H4不表達(dá)于人類正常組織[6]，卻廣泛表達(dá)于多 種腫瘤組織[8，9，11，19，21，22]，它可以抑制T細(xì)胞的活化、誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡或激活抑制性T細(xì)胞，如Treg細(xì)胞[18-20]。同時(shí)，B7-H4可以下調(diào)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗腫瘤反應(yīng)[6]。此外，B7-H4特異性RNA(siRNA)能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)[21，23]。以上表明，B7-H4在腫瘤進(jìn)展和免疫逃避中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

本研究表明B7-H4在胰腺癌組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中的高表達(dá)與總生存時(shí)間負(fù)相關(guān)，獨(dú)立于其他預(yù)后因素。雖然其他研究表明B7-H3和B7-H4尤其是B7-H1的表達(dá)與生存期負(fù)相關(guān)[24，25]，然而本研究顯示異常表達(dá)的B7-H4是一個(gè)獨(dú)立的胰腺癌患者預(yù)后指標(biāo)。

B7-H4的高表達(dá)與許多惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著很大的聯(lián)系[26-28]。B7-H4在腫瘤組織中的過表達(dá)表明它可能成為一個(gè)潛在的腫瘤標(biāo)記和免疫治療靶點(diǎn)。然而，B7-H4在胰腺癌中的預(yù)后作用尚不明確。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中[29]，高表達(dá)B7-H4的患者較低表達(dá)B7-H4的患者，預(yù)后更差；在胃癌[30]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[31]、膽管癌[32]，B7-H4 作為預(yù)后不良或疾病轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。目前的研究表明，B7-H4更有可能僅表達(dá)于胰腺癌組織中而不表達(dá)于正常胰腺組織[17]，因此，B7-H4能作為胰腺癌預(yù)后不良或轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。另外，與晚期腫瘤(Ⅲ-Ⅳ)相比，早期腫瘤(Ⅰ-Ⅱ)中B7-H4的表達(dá)更低，這些都表明B7-H4可能參與人類胰腺癌的進(jìn)展。因此B7-H4的表達(dá)水平與不良預(yù)后之間的關(guān)系可能與復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境及未明確的B7-H4受體有關(guān)。

B7-H4可通過抑制T細(xì)胞活化、誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌[33-34]及T細(xì)胞毒性來逃避抗腫瘤免疫應(yīng)答[22]。雖然我們的研究結(jié)果表明，B7-H4的高表達(dá)可作為人類胰腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)，但高表達(dá)的B7-H4能否降低患者的總生存期仍待研究。

本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)不足之處是樣本數(shù)太少，考慮到B7-H4在胰腺癌患者中的潛在價(jià)值，我們?cè)诤罄m(xù)研究中將用更多的數(shù)據(jù)支持我們的研究。

總之，B7-H4在胰腺癌組織中的表達(dá)與正常胰腺組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)相比表明，B7-H4的表達(dá)與患者的總生存期有著密切的聯(lián)系。因此，B7-H4有望成為胰腺癌的預(yù)后指標(biāo)。

[1]Stewart BW，Wild CP.World cancer report 2014[M].Lyon，F(xiàn)rance：IARCNonserial Publication，2014：89-90.

[2]Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics.CA Cancer[J].J Clin，2008，58(2)：71-96.

[3]Katz MH，Pisters PW，Evans DB，et al.Borderline resectable pancreatic cancer：The importance of this emerging stage of disease[J].JAm Coll Surg，2008，206(5)：833-846.

[4]Clark JW，Glicksman AS，Wanebo HJ.Systemic and adjuvant therapy for patientswith pancreatic carcinoma[J].Cancer，1996，78(3)：688-693.

[5]Driessens G，Kline J，Gajewski TF.Costimulatory and coin?hibitory receptors in anti tumor immunity[J].Immunol Rev，2009，229(1)：126-144.

[6]Sica GL，Choi IH，Zhu G，et al.B7-H4，amolecule of the B7 family，negatively regulates T cell immunity[J].Immunity，2003，18(6)：849-861.

[7]Miyatake T，Tringler B，Liu W，et al.B7-H4(DD-O110)is overexpressed in high risk uterine endometrioid adenocarcinomas and inversely correlated with tumor T-cell infiltration[J].Gynecol Oncol，2007，106(5)：119-127.

[8]Tringler B，Zhuo S，Pilkington G，et al.B7 H4 is highly expressed in ductal and lobular breast cancer[J].Clin Cancer Res，2005，11(4)：1842 1848.

[9]Sun Y，Wang Y，Zhao J，et al.B7 H3 and B7-H4 expression in non small cell lung cancer[J].Lung Cancer，2006，53(2)：143-151.

[10]Tringler B，Liu W，Corral L，et al.B7-H4 overexpression in ovarian tumors[J].Gynecol Oncol，2006，100(1)：44-52.

[11]Krambeck AE，Thompson RH，Dong H，et al.B7-H4 expression in renal cell carcinoma and tumor vasculature：Associationswith cancer progression and survival[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(27)：10391-10396.

[12]Prasad DV，Richards S，Mai XM，et al.A novel B7 familymember that negatively regulates T cell activation[J].Immunity，2003，18(6)：863-873.

[13]Qian Y，Sang Y，Wang FX，etal.Prognostic significance of B7-H4 expression in matched primary pancreatic cancer and livermetastases[J].Oncotarget，2016，7(44)：72242-72249.

[14]Jiang J，Zhu Y，Wu C，et al.Tumor expression of B7-H4 predicts poor survival of patients suffering from gastric cancer[J].Cancer Immunol Immunother，2010，59(8)：1707-1714.

[15]Chen LJ，Sun J，Wu HY，et al.B7-H4 expression associates with cancer progression and predicts patient’s survival in human esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer Immunol Immunother，2011，60(7)：1047-1055.

[16]Quandt D，F(xiàn)iedler E，Boettcher D，et al.B7-H4 Expression in Human Melanoma：Its Association with Patients’ Survival and Antitumor Immune Response[J].Clin Cancer Res，2011，17(10)：3100-3111.

[17]Awadallah NS，Shroyer KR，Langer DA，et al.Detection of B7 H4 and p53 in pancreatic cancer：Potential role as a cytological diagnostic adjunct[J].Pancreas，2008，36(2)：200-206.

[18]Kryczek I，Zou L，Rodriguez P，et al.B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma[J].JExp Med，2006，203(4)：871-881.

[19]Zang X，Thompson RH，Al-Ahmadie HA，et al.B7-H3 and B7x are highly expressed in human prostate cancer and associated with disease spread and poor outcome[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(4)：19458-19463.

[20]Gao Q，Wang XY，Qiu SJ，et al.Overexpression of PD-L1 significantly associates with tumor aggressiveness and postoperative recurrence in human hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res，2009，15(3)：971-979

[21]Salceda S，Tang T，Kmet M，et al.The immunomodulatory protein B7-H4 is overexpressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation[J].Exp Cell Res，2005，306(3)：128-141.

[22]Choi IH，Zhu G，Sica GL，et al.Genomic organization and expression analysis of B7-H4，an immune inhibitory molecule of the B7 family[J].J Immunol，2003，171(9)：4650-4654.

[23]Qian Y，Hong B，Shen L，et al.B7-H4 enhances oncogenicity and inhibits apoptosis in pancreatic cancer cells[J].Cell Tissue Res，2013，353(1)：139-151.

[24]Chen XL，Yuan SX，Chen C，et al.Expression of B7-H1 protein in human pancreatic carcinoma tissues and its clinical significance[J].Ai Zheng，2009，28(12)：1328-1332(In Chinese).

[25]Xu H，Chen X，Tao M，et al.B7-H3 and B7-H4 are independent predictors of a poor prognosis in patientswith pancreatic cancer[J].Oncol Lett，2016，11(3)：1841-1846.

[26]Topalian SL，Drake CG，Pardoll DM.Targeting the PD-1/B7-H1(PD-L1)pathway to activate anti tumor immunity[J].Curr Opin Immunol，2012，24(2)：207-212.

[27]Wang X，Wang T，Xu M，et al.B7-H4 overexpression impairs the immune response of T cells in human cervical carcinomas[J].Hum Immunol，2014，75(10)：1203-1209.

[28]Song X，Liu J，Lu Y，et al.Overexpression of B7-H1 correlates with malignant cell proliferation in pancreatic cancer[J].Oncol Rep，2014，31(3)：1191-1198.

[29]Yao Y，Ye H，Qi Z，et al.B7-H4(B7x)-Mediated Cross-talk between Glioma-Initiating Cells and Macrophages via the IL6/JAK/STAT3 Pathway Lead to Poor Prognosis in Glioma Patients[J].Clin Cancer Res，2016，22(3)：2778-2790.

[30]Cui Y，Li Z.B7-H4 is Predictive of Poor Prognosis in Patients with Gastric Cancer[J].Med SciMonit，2016，22(3)：4233-4237.

[31]Wu L，Deng WW，Yu GT，et al.B7-H4 expression indicates poor prognosis of oral squamous cell carcinoma[J].Cancer Immunol Immunother，2016，65(9)：1035-1045.

[32]Zhao X，Guo F，Li Z，et al.Aberrant expression of B7-H4 correlateswith poor prognosis and suppresses tumor-infiltration of CD8+T lymphocytes in human cholangiocarcinoma[J].Oncol Rep，2016，36(5)：419-427.

[33]Mugler KC，Singh M，Tringler B，et al.B7-H4 expression in a range of breast pathology：Correlation with tumor T cell infiltration[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol，2007，15(4)：363-370.

[34]Simon I，Katsaros D，Rigault de la Longrais I，et al.B7-H4 is over expressed in early stage ovarian cancer and is independent of CA125 expression[J].Gynecol Oncol，2007，106(5)：334 341.

Expression of B7-H 4 in pancreatic cancer and the relevant research w ith clinical pathology and prognosis

WANG Qi，SHEN Lingwei，QIAN Yun.
The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School ofMedicine，Hangzhou 310003，China.

Objective To study B7-H4 abnormally expressed in pancreatic cancer tissues，and to evaluate the correlation between B7-H4 and the prognosis of pancreatic cancer.M ethods Pancreatic cancer patients(n=188)and healthy controls(n=25)were collected from the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University school ofmedical from January 2011 to December 2014.Immunohistochemical staining was used to detect the expression of B7-H4.Results The positive rate of B7-H4 expression in pancreatic cancer tissueswas 100%，higher than that in normal pancreatic tissue samples(68%).And the expression level of B7-H4 in pancreatic cancer were obviously higher than control group.Meanwhile，the expression of B7-H4 in pancreatic cancer was significantly correlated with tumornodemetastasis(TNM)stage，distantmetastasis and differentiation.Multivariate survival analysis showed that the expression level of B7-H4，distantmetastasis，and chemotherapy were independent prognostic index of pancreatic cancer.Conclusion Abnormal expression of B7-H4 in pancreatic cancer is an independent prognostic marker of pancreatic cancer and is expected to be an immune target for the treatmentof pancreatic cancer.

B7-H4；Pancreatic cancer；Prognosis；Biomarker；Immunohistochemistry

R735.9，R446.8

A

1674-1129(2017)05-0642-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.003

浙江省自然科學(xué)基金，LQ16H160005

王琪，女，1987年生，學(xué)士學(xué)位，檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)，主要研究方向免疫學(xué)。

錢韻，女，1985年生，博士學(xué)位，主管檢驗(yàn)師，主要研究方向腫瘤免疫 Email：10818020@gstu.zju.edu.cn。

2017-06-13；

2017-09-05)