牛鑫，張國(guó)威，汪泱

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，1、四肢顯微外科研究所；2、神經(jīng)外科，上海200233)

·論 著·

人類(lèi)尿液來(lái)源干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性分析

牛鑫1，張國(guó)威2，汪泱1

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，1、四肢顯微外科研究所；2、神經(jīng)外科，上海200233)

目的 從人類(lèi)尿液中直接分離能夠體外大量擴(kuò)增且具有多向分化潛能的干細(xì)胞，并研究其生物學(xué)特性。方法 收集志愿者尿液100～200ml，經(jīng)離心后使用完全培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)板中；克隆貼壁生長(zhǎng)后換液。大量擴(kuò)增后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志物，使用成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化，通過(guò)茜素紅染色、阿利新藍(lán)染色檢測(cè)誘導(dǎo)分化結(jié)果。結(jié)果 每100m l尿液經(jīng)14d培養(yǎng)能夠直接分離得到3～10個(gè)克隆，傳代培養(yǎng)至第5代時(shí)可擴(kuò)增至2～10×107個(gè)尿液來(lái)源干細(xì)胞，能夠滿(mǎn)足細(xì)胞治療需要。尿液來(lái)源干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29，CD44，CD73，CD90為陽(yáng)性，CD34，CD45，HLA-DR為陰性，與間充質(zhì)干細(xì)胞一致。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，尿液干細(xì)胞能夠能夠成骨、成軟骨分化。結(jié)論 尿液來(lái)源干細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，可以作為細(xì)胞治療、組織工程中的種子細(xì)胞。

尿液來(lái)源干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；種子細(xì)胞

細(xì)胞治療是攻克危重疾病、修復(fù)難愈合損傷的新型療法。干細(xì)胞因其增殖能力旺盛，具有多向分化潛能、能夠分泌多種因子等生物學(xué)特性通常被選為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞。種子細(xì)胞的來(lái)源和培養(yǎng)是長(zhǎng)期以來(lái)限制細(xì)胞治療發(fā)展的關(guān)鍵因素。目前，可用于細(xì)胞移植療法的種子細(xì)胞主要為胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞和骨髓、脂肪等多種組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）。胚胎干細(xì)胞來(lái)源有限，培養(yǎng)方法復(fù)雜，面臨倫理、成瘤問(wèn)題以及異體移植的免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)[1]；誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)、培養(yǎng)過(guò)程復(fù)雜，且有成瘤風(fēng)險(xiǎn)；骨髓、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞因其可以自體取材、成瘤風(fēng)險(xiǎn)低、且免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)低，在細(xì)胞治療中具有一定優(yōu)勢(shì)，并被廣泛研究。例如，經(jīng)研究證實(shí)，骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在體外直接分化為神經(jīng)元[2]；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞能夠遷移至缺血半影區(qū)[3]。此外，骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞還能夠促進(jìn)血管生成[4，5]，抑制凋亡[6]，分泌營(yíng)養(yǎng)因子[7]。將骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞自體移植，能夠顯著促進(jìn)糖尿病足壞死創(chuàng)面的愈合[8]。但是，骨髓、脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞取材過(guò)程有創(chuàng)，給病人造成額外痛苦和負(fù)擔(dān)。因此，尋找來(lái)源無(wú)創(chuàng)的移植種子細(xì)胞一直是干細(xì)胞研究領(lǐng)域持續(xù)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

尿液能夠作為檢測(cè)、診斷多種疾病的生物樣本，蘊(yùn)含豐富的代謝產(chǎn)物、生物大分子、囊泡、細(xì)胞等內(nèi)容物[9-12]，并且能夠無(wú)創(chuàng)、大量獲取。鑒于此，我們嘗試從尿液中獲取干細(xì)胞。經(jīng)過(guò)摸索，我們建立了從尿液中直接分離培養(yǎng)干細(xì)胞，即尿液來(lái)源干細(xì)胞（urine-derived stem cell，USCs）的新體系。 我們利用特性成分培養(yǎng)基，通過(guò)簡(jiǎn)單離心，從人體尿液中分離得到一種干細(xì)胞，其可表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD29等標(biāo)志物，并具有多向分化潛能。尿液干細(xì)胞獲取過(guò)程無(wú)創(chuàng)，獲取過(guò)程簡(jiǎn)單，且能夠多次無(wú)限量獲取，從而為干細(xì)胞的研究和利用增加了一個(gè)極其安全、便利的細(xì)胞來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 尿液由成年健康志愿者捐贈(zèng)捐贈(zèng)過(guò)程符合上海市第六人民醫(yī)院倫理委員會(huì)各項(xiàng)規(guī)定。捐贈(zèng)者留取清潔中段尿液100～200ml，以備使用。

1.1.2 主要儀器生物安全柜 （Thermo），CO2培養(yǎng)箱（Thermo），離心機(jī)。

1.1.3 主要試劑100×antibiotic antimycotic（GIBCO，15240062），尿液干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（DMEM/F12 培養(yǎng)基（Corning），優(yōu)級(jí)胎牛血清（GIBCO）2%，EGF （Perprotech）10ng/ml，PDGF （Millipore）2ng/ml，TGF-beta（Perprotech）1ng/ml，bFGF （Perprotech）2ng/ml，氫化可的松（Sigma）0.5mM，胰島素（GIBCO）25mg/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白（sigma）20mg/ml，腎上腺素549ng/mL，三碘甲狀腺氨酸 125ng/ml），0.25%胰蛋白酶（含 EDTA）（GIBCO）， 磷酸緩沖液（PBS）（Corning），明膠（上海國(guó)藥集團(tuán)），多聚甲醛（上海國(guó)藥集團(tuán)），成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（GIBCO），成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（GIBCO），茜素紅（Sigma），阿利新藍(lán)（Sigma）。 直 標(biāo) 抗 體 ：CD34-APC(BD No.560940)，CD45-FITC(BD No.560976)，CD29-PE(BD No.561795)，CD44-FITC(BD No.560977)，CD73-PE(BD No.561014)，CD90-PE(BD No.560970)，HLA-DRPE(BD No.560943)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離將0.1%明膠按1.5ml/孔加入6孔板，置于CO2培養(yǎng)箱中，在37℃下靜置2h完成包被。細(xì)胞接種前棄去明膠。取尿液樣本后，按每100ml尿液加入 5ml 100×antibiotic antimycotic，充分輕柔混勻，400g離心10min；棄上清，使用PBS清洗沉淀物，然后再次400g離心10min。離心后棄去上清，每100ml尿液的沉淀物使用6ml尿液干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸，并以0.2ml/cm2接種于包被過(guò)的培養(yǎng)板。接種次日觀察樣本是否污染，接種后7d更換完全培養(yǎng)基，并觀察克隆。克隆生長(zhǎng)至細(xì)胞緊密接觸時(shí)使用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）進(jìn)行傳代。

1.2.2 USCs表面標(biāo)志物的鑒定 USCs傳代培養(yǎng)至第4代，將融合度為90%的USCs消化至單個(gè)細(xì)胞，使用4%多聚甲醛在室溫固定10min，200g離心5min棄去上清，使用PBS清洗，200g再次離心5min后棄去上清，重懸至適宜密度并按說(shuō)明書(shū)推薦濃度加入直標(biāo)抗體，并按說(shuō)明書(shū)推薦時(shí)間、溫度孵育；孵育后200g離心5min，使用PBS清洗游離抗體，200g再次離心5min，將細(xì)胞重懸至200μl，經(jīng)GUAVA easyCyte6HT檢測(cè)。

1.2.3 USCs誘導(dǎo)分化USCs傳代培養(yǎng)至第 5～7代，將融合度為100%的USCs棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)培養(yǎng)基隔天換液，誘導(dǎo)28d后分別進(jìn)行染色。

1.2.4 茜素紅染色將誘導(dǎo)后細(xì)胞棄上清，PBS清洗后使用4%多聚甲醛室溫固定10min。洗凈殘留固定劑后加入0.1%茜素紅溶液室溫染色10min。PBS洗去浮色后于光鏡下觀察。

1.2.5 阿利新藍(lán)染色將誘導(dǎo)后細(xì)胞棄上清，PBS清洗后使用4%多聚甲醛室溫固定10min。洗凈殘留固定劑后加入阿利新藍(lán)溶液室溫染色30min。PBS洗去浮色后于光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)果尿液經(jīng)離心、清洗、重懸，約80%的樣品在接種后第5～7d開(kāi)始出現(xiàn)克隆，即為USCs。USCs克隆通常為圓形，克隆內(nèi)細(xì)胞主要為梭形（圖1a）。部分克隆內(nèi)偶有出現(xiàn)上皮樣細(xì)胞，傳代后此類(lèi)細(xì)胞消失。接種14d后，每100ml尿液能夠直接分離獲得3～10個(gè)克隆。傳代后，USCs細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形、渦旋狀生長(zhǎng)（圖1b），符合間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。傳代培養(yǎng)至第5代時(shí)可擴(kuò)增至2～10×107個(gè)USCs，并能夠穩(wěn)定傳代至8代以上，能夠滿(mǎn)足細(xì)胞治療需要。部分USCs貼壁后不呈現(xiàn)明顯克隆狀態(tài)（圖1c，d），乃至成球生長(zhǎng)，但仍可較快速生長(zhǎng)，并被傳代至8代以上。

圖1 人類(lèi)尿液離心后分離獲得增殖旺盛的克隆（a）；傳代培養(yǎng)后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈梭形渦旋狀生長(zhǎng)（b）；部分USCs貼壁時(shí)不呈現(xiàn)明顯克隆狀態(tài)，或成球生長(zhǎng)（c，d）。標(biāo)尺200μm。

2.2 細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果將傳代后USCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)USCs細(xì)胞表面高表達(dá)CD29（98.62%）、CD44（99.62%）、CD73（94.44%）、CD90（90.44%）等標(biāo)志物，不表達(dá) CD34（2.84%）、CD45(2.84%)、HLA-DR(2.12%)等標(biāo)志物，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物特點(diǎn)（圖2a-g）。因此，我們推斷USCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，并且具有間充質(zhì)干細(xì)胞必備的多向分化潛能。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)USCs表面標(biāo)志物，其中CD29（a），CD44（c），CD73 （e），CD90 （f） 表達(dá)為陽(yáng)性；CD34 （b），CD45（d），HLA-DR（f）表達(dá)為陰性。

2.3 細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果我們將傳代培養(yǎng)至5～7代的USCs進(jìn)行成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化。USCs經(jīng)28d成骨誘導(dǎo)之后，細(xì)胞間產(chǎn)生大量沉淀物，且沉淀物茜素紅染色結(jié)果為陽(yáng)性，證明沉淀為鈣結(jié)節(jié)，USCs經(jīng)誘導(dǎo)后已向成骨方向分化 （圖3a）。USCs經(jīng)28d成軟骨誘導(dǎo)之后，細(xì)胞生長(zhǎng)緊密，產(chǎn)生大量細(xì)胞間質(zhì)，且阿利新藍(lán)結(jié)果為陽(yáng)性，證明已有大量糖蛋白產(chǎn)生，USCs有成軟骨分化潛能（圖3b）。

圖3 USCs成骨誘導(dǎo)后經(jīng)茜素紅染色，呈現(xiàn)大量鈣結(jié)節(jié)陽(yáng)性（a），成軟骨誘導(dǎo)后經(jīng)阿利新藍(lán)染色，呈現(xiàn)大量糖蛋白陽(yáng)性（b）。標(biāo)尺10μm。

3 討論

細(xì)胞治療的效果高度依賴(lài)于種子細(xì)胞的選擇。終末分化細(xì)胞因其難以體外培養(yǎng)不宜作為種子細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞難以獲取，培養(yǎng)條件嚴(yán)苛，存在倫理問(wèn)題，并且不可能獲得自體細(xì)胞，因而使用后需面臨免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞在誘導(dǎo)過(guò)程中可能使用病毒，并具有較強(qiáng)成瘤性，存在安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，在體外能夠大量增殖、并具有多向分化潛能、且成瘤性低的間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出作為種子細(xì)胞的巨大優(yōu)勢(shì)。間充質(zhì)干細(xì)胞通常從骨髓、脂肪等多種中分離獲得[13-16]，能夠自體獲取，并長(zhǎng)期作為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞使用。然而，骨髓來(lái)源、脂肪來(lái)源以及臍帶血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞取材過(guò)程有創(chuàng)，且來(lái)源有限，難以實(shí)現(xiàn)多次取材，限制其后續(xù)應(yīng)用。在本項(xiàng)研究中，我們通過(guò)簡(jiǎn)單離心從人尿液中分離得到可以貼壁生長(zhǎng)的USCs，其表面標(biāo)志物與間充質(zhì)干細(xì)胞一致，能夠在體外大量擴(kuò)增，并具有成骨、成軟骨分化潛能。USCs在生物學(xué)特性上與間充質(zhì)干細(xì)胞相當(dāng)，且取材過(guò)程無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便，單次取材提供的細(xì)胞（2～10×107個(gè)）即可滿(mǎn)足一般細(xì)胞治療對(duì)種子細(xì)胞數(shù)量的要求。且USCs的來(lái)源決定治療過(guò)程中能夠?qū)ν还w進(jìn)行多次取材，可以滿(mǎn)足長(zhǎng)期、多次、多療程治療的需要，是理想的自體種子細(xì)胞來(lái)源，具有良好應(yīng)用前景。已有的從尿液中分離細(xì)胞的研究[17]主要著眼于將其誘導(dǎo)為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，對(duì)尿液來(lái)源細(xì)胞本身的特性、功能研究較少。我們的研究建立了從尿液中分離可多次傳代、大量擴(kuò)增的干細(xì)胞的技術(shù)體系，并細(xì)致分析了細(xì)胞表面標(biāo)志物，測(cè)試了細(xì)胞的多向分化潛能，加深了對(duì)尿液來(lái)源細(xì)胞的認(rèn)識(shí)，為細(xì)胞治療提供了種子細(xì)胞新來(lái)源。

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In vitro Culture and Biological Characteristics of Urine-Derived Stem Cells

NIU Xin1，ZHANG Guowei2，WANG Yang1.
1.Institute ofMicrosurgery on Extremities，The Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University，Shanghai200233，China;2.Departmentof Neurosurgery，The Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University，Shanghai200233，China.

Objective To directly isolate in vitro proliferative and multipotential stem cells from urine specimen and study their biological characteristics.M ethods 100～200m l urine were collected from volunteers，and further to centrifuged urine and resuspended the precipitate，then seeded the suspension into tissue culture plates.Changed fresh media after clones appeared.Detected cell surface markers through flow cytometry.Osteogenic and chondrogenic induction were performed followed by Alizarin Red S staining and Alcian Blue staining.Results We could isolated 3～10 clones from 100m l urine after cultured for 14 days.After subculturing to the fifth generation we harvest 2～10×107cells.These urine-derived stem cells expressed CD29，CD44，CD73 and CD90，but not expressed CD34，CD45 and HLA-DR，which is consistentwithmesenchymal stem cells.Conclusion Urine-derived stem cells have similar biological characteristics with mesenchymal stem cells，and could act as seed cells for cell therapy and tissue engineer.

Urine-derived stem cells；Mesenchymal stem cells；Seed cells

Q813.1+1，R446.62

A

1674-1129(2017)05-0638-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81501863）；上海市第六人民醫(yī)院院級(jí)課題（No.1634）

牛鑫，女，1984年生，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向?yàn)楦杉?xì)胞與再生醫(yī)學(xué)。

汪泱，女，1963年生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楦杉?xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，Email：wangy63cn@126.com

2017-07-25；

2017-08-29)