高振 王晶 姜敏 李爭 徐丹 哈木拉提?吾甫爾 荊晶 李風森

摘要：目的 觀察止嗽散加減方對慢性阻塞性肺疾病（COPD）寒燥模型大鼠表皮生長因子受體（EGFR）及中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）的影響。方法 利用氣管滴注彈性蛋白酶結合煙熏90 d建立COPD模型，在此基礎上予以寒燥應激90 d建立COPD寒燥模型。將COPD寒燥模型大鼠隨機分為寒燥組和中藥組，中藥組連續(xù)干預7 d。第97日處死大鼠，觀察其肺組織病理形態(tài)。RT-qPCR和Western blot分別檢測肺組織EGFR mRNA和蛋白表達，ELISA檢測血清和肺泡灌洗液NE含量。結果 COPD組、寒燥組、中藥組肺組織EGFR mRNA和蛋白表達較對照組均升高，中藥組肺組織EGFR蛋白表達較COPD組和寒燥組均降低；COPD組、寒燥組和中藥組血清和肺泡灌洗液NE含量較對照組升高，寒燥組肺泡灌洗液NE含量高于COPD組，中藥組肺泡灌洗液NE含量低于寒燥組。結論 止嗽散加減方可能通過降低寒燥COPD模型大鼠肺組織EGFR和NE的水平，達到治療COPD的目的。

關鍵詞：慢性阻塞性肺疾病；寒燥；止嗽散加減方；表皮生長因子受體；中性粒細胞彈性蛋白酶

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.013

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）10-0053-04

Effects of Modified Zhisou Power on Epidermal Growth Factor Receptor and Neutrophil Elastase in Rats with Cold-Dryness Chronic Obstructive Pulmonary Disease GAO Zhen， WANG Jing， JIANG Min， LI Zheng， XU Dan， Halmurat UPUR， JING Jing， LI Feng-sen （National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine， Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract： Objective To reveal the effects of cold-dryness and modified Zhisou Power on epidermal growth factor receptor （EGFR） and neutrophil elastase （NE） in rats with COPD. Methods COPD model was established with an elastase dose into the trachea combined with exposure to smoking for 90 d； cold-dryness COPD group was further developed by exposure to a cold， dry environment for 90 d. After 90 days， cold-dryness COPD rats was divided into cold-dryness group and Zhisou Power intervention group （treated with modified Zhisou Power for 7 days）. On the 97th day， all rats were killed. Pathological changes in lungs were observed. mRNA and protein expression of EGFR were measured by RT-qPCR and Western blot， and the amount of NE in serum and BALF were examined by ELISA. Results EGFR mRNA and protein expression were significantly higher in COPD group， cold-dryness group and Zhisou Power intervention group than in control group. EGFR was significantly lower in Zhisou Power intervention group than in COPD group and cold-dryness group. NE was significantly higher in serum and BALF in COPD group， cold-dryness group and Zhisou Power intervention group than in control group. NE in BALF was significantly higher in cold-dryness group than in COPD group. NE in BALF was significantly lower in Zhisou Power intervention group than in cold-dryness group. Conclusion Modified Zhisou Power can down-regulate the expression of EGFR and the mount of NE in cold-dryness COPD rats to treat COPD.

Key words： COPD； cold-dryness； modified Zhisou Power； epithelial growth factor receptor； neutrophil elastase

新疆地處中國西北部，為世界上離海洋最遠的地

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金（2015211C138）

通訊作者：李風森，E-mail：fengsen602@163.com

區(qū)，氣候干燥寒冷。新疆慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）在中醫(yī)證型、證素、癥狀等中醫(yī)特點上與內地有別，表現出寒、燥的臨床特點[1]。流行病學調查顯示，西北寒燥證是新疆COPD的特殊和多發(fā)證型之一[2]。前期研究發(fā)現，寒燥可以降低COPD模型大鼠肺組織水通道蛋白（aquaporin，AQP）4和AQP5表達，升高黏蛋白（mucin，MUC）5AC和MUC5B表達[3]。本研究擬在前期研究的基礎上，觀察中藥止嗽散加減方對COPD寒燥模型大鼠表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）及中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）的影響，初步探討其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級雄性Wistar大鼠65只，5周齡，體質量（150±20）g，新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（新）2003-0001。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學SPF級實驗動物中心，溫度（25±3）℃、相對濕度60%～80%。

1.2 藥物及制備

止嗽散加減方由《醫(yī)學心悟》中止嗽散化裁而成，由荊芥10 g、陳皮10 g、炙甘草10 g、桔梗10 g、百部30 g、紫菀20 g、款冬花20 g、紫蘇葉10 g、苦杏仁15 g、生姜10 g、川貝母9 g組成，上述飲片購自新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學部，水煎2次，蒸發(fā)去液體后低溫烘干制成粉狀浸膏，7劑中藥計1078 g原藥材，共制得粉狀浸膏370 g，低溫干燥保存待用。

1.3 主要試劑與儀器

PCR、Western blot ELISA試劑盒（美國Santa Cruz Biotechnology），彈性蛋白酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。FLI-2000H型人工氣候箱（日本EYELA公司），BUXCO MA1320呼吸功能實驗平臺（美國Buxco公司），BS-1105型電子天平（北京賽多克斯天平有限公司），DM600B-1顯微鏡（德國Leica公司），JEM-1230型生物用透射電子顯微鏡（日本電子株式會社），亞克力染毒箱（自制），哈德門牌卷煙（山東中煙工業(yè)有限責任公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模和給藥

實驗大鼠采用隨機數字表法分為COPD寒燥組30只、COPD組20只、對照組15只。實驗參照文獻[4]制作COPD模型。于實驗開始后第30日按每100 g體質量氣管滴注溶于0.8 mL生理鹽水20 U NE；第1～29日、31～97日每日進行煙熏。在規(guī)定時間每日置于亞克力染毒箱內，染毒箱連接吸煙裝置，用三通管及80 mL喂食器將卷煙抽吸后注入染毒箱內，以15吸/min隨時補充煙霧，保持煙霧濃度相對穩(wěn)定，每次18只大鼠吸煙1 h。在2組動物吸煙中間清潔染毒箱，打開入口及排氣口，風扇鼓風通氣5 min驅散殘存煙霧。參照文獻[5]方法制作COPD寒燥模型。在給予COPD模型施加因素的基礎上疊加以下處理因素：第1～97日每晚將大鼠置于系統設置為溫度（6±2）℃、濕度25%～32.8%的人工氣候箱，每日10 h。對照組正常環(huán)境中常規(guī)飼料喂養(yǎng)，第30日大鼠與模型組相同術式氣管滴注等體積生理鹽水。所有大鼠飼養(yǎng)97 d，第90日時將COPD寒燥模型大鼠隨機分為中藥組和寒燥組，中藥組給予止嗽散加減方灌胃，給藥劑量根據人體內服劑量按人和動物間體表面積折算的等效劑量進行換算，每只大鼠予浸膏0.96 g溶于10 mL水，每次5 mL，早晚各1次，COPD組、寒燥組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。

2.2 肺組織病理觀察

第97日大鼠戊巴比妥鈉麻醉，下腔靜脈抽血處死，迅速摘取大鼠肺組織，取右肺中葉，部分氣管、支氣管，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水、浸蠟包埋、切片（2 μm），每塊組織連續(xù)切片3張，HE染色，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)學改變。

2.3 實時熒光定量PCR檢測

RT-qPCR檢測肺組織EGFR mRNA水平。EGFR引物序列：上游TGCCCACCACTCATGCTGTA，下游GCCGTGATCTGTCACCACGTA，產物長度153 bp。采用2步法：95 ℃、30 s，95 ℃、5 min，56 ℃、30 s，40個循環(huán)。以β-actin Ct值標化EGFR Ct值，采用2-ΔΔCt方法計算EGFR mRNA表達。

2.4 Western blot檢測

取大鼠肺組織，加適量RIPA裂解緩沖液，提取組織總蛋白。BSA法定量蛋白濃度后，取蛋白樣品20 μg經120 g/L SDS-PAGE膠電泳分離，120 V條件下電泳約1 h，將膠從電泳槽取出，在轉移緩沖液中恒壓100 V下轉膜2 h。50 g/L脫脂奶粉TBST室溫封存1 h，EGFR大鼠單克隆抗體（EGFR 1∶200，羊抗鼠）4 ℃過夜孵育，抗羊IgG二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑顯影，Bio-Rad軟件對條帶進行灰度掃描分析，以β-actin作為內參，計算EGFR相對表達量。

2.5 中性粒細胞彈性蛋白酶含量檢測

切開分離下腔靜脈，抽取靜脈血5 mL，5 ℃、2500 r/min離心15 min，吸取血清，置于-70 ℃冰箱保存待測。隨后，按以下方法收集支氣管肺泡灌洗液：經下腔靜脈抽血處死大鼠，將氣管與雙肺暴露，做氣管下部橫行切口，對右主支氣管予以結扎，用接12號針頭（尖端磨平）的注射器經氣管切口向左肺緩慢灌注無菌生理鹽水3 mL，每次灌注后立即回收灌注液，紗布過濾，重復3次。BALF離心，取其上清液移入無菌瓶內，置于-70 ℃超低溫冰箱保存待測。ELISA用于定量檢測大鼠血清及肺泡灌洗液中NE的濃度，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

3 統計學方法

采用SPSS11.5統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，凡符合正態(tài)分布和方差齊的數據采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD法，若方差不齊則用Tamhane方法進行兩兩比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 肺組織病理觀察結果

對照組肺泡大小基本一致，肺泡壁厚度正常，外周未見炎性細胞浸潤，或見極少量炎癥細胞散在分布；COPD組見大量炎癥細胞浸潤，肉芽腫發(fā)生；寒燥組見大量炎性浸潤，肉芽腫發(fā)生，部分肺纖維化；中藥組見炎性浸潤發(fā)生，較COPD組和寒燥組部分改善。結果見圖1。

4.2 止嗽散加減方對模型大鼠肺組織表皮生長因子受體mRNA和蛋白表達的影響

與對照組比較，COPD組、寒燥組、中藥組大鼠肺組織EGFR mRNA和蛋白表達明顯升高（P<0.01）；中藥組EGFR mRNA表達較寒燥組有下降趨勢，但差異無統計學意義；中藥組肺組織EGFR蛋白表達較COPD組和寒燥組明顯降低（P<0.01）。結果見表1、圖2。

4.3 止嗽散加減方對模型大鼠肺組織血清和肺泡灌洗液中性粒細胞彈性蛋白酶含量的影響

與對照組比較，寒燥組血清NE含量明顯升高（P<0.01），中藥組血清NE含量明顯升高（P<0.05）；COPD組肺泡灌洗液NE含量明顯升高（P<0.05），寒燥組肺泡灌洗液NE含量明顯升高（P<0.01），中藥組肺泡灌洗液NE含量明顯升高（P<0.05）；與COPD組比較，寒燥組肺泡灌洗液NE含量明顯升高（P<0.05）；與寒燥組比較，中藥組肺泡灌洗液NE含量明顯降低（P<0.01）。結果見表2。

5 討論

《寓意草·與門人定議病式》把“辨高卑燥濕，五方異宜”作為“議病式”的重要內容之一；《注解傷寒論·傷寒例》更進一步明確“醫(yī)之治病，當審其土地所宜”。新疆處于中國西北地區(qū)，地勢高而寒冷少雨，其病多燥寒。寒燥與津液的關系密切，一方面影響津液的量，另一方面影響津液的功效，而中醫(yī)的津液表現在氣道則與黏液的功能相近[6]。

前期實驗研究也發(fā)現，寒燥可促使COPD模型MUC5AC、MUC5B表達升高[3]。持續(xù)的氣道黏液過度分泌及流變學特性的改變會導致黏液纖毛清除功能受損、喪失，使細菌定植成為可能，甚至發(fā)生炎性改變；還會導致小氣道阻塞、氣流受限、氣體交換功能障礙，最終導致COPD進行性加重，甚至增加病死率，是影響病情及預后的獨立危險因素。一系列因素可直接或間接作用于分泌細胞，致使MUC表達上調，分泌細胞過度化生，促使COPD患者氣道黏液分泌量增加。其中NE是一種最大潛能的黏液促分泌劑[8]，在所有刺激黏液生成和分泌的因素中，75%的作用由NE發(fā)揮[8]。NE可同時誘導MUC5AC和MUC5B表達增高，且具有濃度依賴趨勢[9]。NE不可逆轉地改變了Clara細胞正常呈現的黏蛋白特征，導致產生異常的黏液[10]。而MUC5AC的合成受EGFR信號傳遞系統調節(jié)[11]，EGFR在COPD患者氣道MUC的合成中發(fā)揮重要作用[12]。

本研究發(fā)現，COPD組、寒燥組和中藥組模型大鼠肺部EGFR mRNA和蛋白表達均較對照組升高，寒燥對大鼠模型EGFR mRNA和蛋白表達的影響不大，而止嗽散加減方可降低COPD寒燥模型肺組織EGFR蛋白的表達。COPD組、寒燥組和中藥組血清和肺泡灌洗液NE含量較對照組升高；同時，寒燥增加COPD模型大鼠肺泡灌洗液NE的含量，止嗽散加減方則可降低COPD寒燥模型大鼠肺泡灌洗液NE含量。

綜上所述，本研究發(fā)現止嗽散加減方可降低COPD寒燥模型大鼠肺組織EGFR和NE的水平，這可能是該方理肺祛痰治療COPD的機制之一。

參考文獻：

[1] 高振，李風森，荊晶，等.新疆和內地慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)特點的對比研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（1）：195-198.

[2] 李風森，高振，荊晶，等.慢性阻塞性肺疾病西北寒燥證分布及臨床特點[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（2）：22-24.

[3] GAO Z， UPUR H， WANG J， et al. Expression of airway mucus-associated proteins in rats with chronic obstructive pulmonary disease with a cold-dryness symptom pattern[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2016，36（5）：671-677.

[4] GAO Z， LI F S， UPUR H， et al. Effect of cold-dryness on pulmonary and immunologic function in chronic obstructive pulmonary disease model rats[J]. J ournal of Traditional Chinese Mmedicine，2014， 34（2）：221-226.

[5] 高振，李風森，王晶，等.止嗽散加減方對慢性阻塞性肺疾病西北寒燥證大鼠模型肺功能的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2014，34（5）：556-561.

[6] 王劍，徐志偉，嚴燦，等.從黏液類物質病理改變探討痰證機理[J].上海中醫(yī)藥雜志，2007，30（6）：461-463.

[7] KISHIOKA K， OKAMOTO K， KIM J， et al. Regulation of secretion from mucous and serous cells in the excised ferret trachea[J]. Respir Physiol，2001，126（2）：163-171.

[8] 徐曉艷，周向東.中性粒細胞彈性蛋白酶與黏蛋白[J].中國藥物與臨床，2004，4（10）：741-744.

[9] 蘭箭，孫航，劉杞，等.人中性粒細胞彈性蛋白酶誘導氣道黏液高分泌細胞模型的建立及其機制的初步研究[J].中國生物工程雜志，2008， 28（3）：1-7.

[10] JAMIL S， BREUER R， CHRISTENSEN T G. Abnormal mucous cell phenotype induced by neutrophil elastase in hamster bronchi[J]. Exp Lung Res，1997，23（4）：285-295.

[11] TAKEYAMA K， DABBAGH K， LEE H M， et al. Epidermal growth factor system regulates mucin production in airways[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（6）：3081-3086.

[12] 毛翎，白春學，張敏，等.表皮生長因子受體和黏蛋白在慢性阻塞性肺疾病氣道中的表達及意義[J].中華結核和呼吸雜志，2004，27（9）：585- 588.

（收稿日期：2017-02-14）

（修回日期：2017-03-07；編輯：華強）