周 云,李 盛,唐宗生,楊東亮,宋景嬌
不同種小鼠乙型肝炎模型的建立及其感染狀況研究*
周 云,李 盛,唐宗生,楊東亮,宋景嬌
目的探討建立急性或慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染小鼠模型的方法。方法采用高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2表達(dá)質(zhì)粒,建立急性或慢性HBV感染小鼠模型,采用ELISA法檢測HBV抗原,采用RT-PCR法檢測免疫相關(guān)分子基因,使用FACS檢測肝內(nèi)淋巴細(xì)胞活化情況,采用酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)法檢測脾臟相關(guān)免疫細(xì)胞特征。結(jié)果成功建立急性和慢性高壓尾靜脈注射HBV感染小鼠模型;在急性BALB/c小鼠模型,血清HBsAg持續(xù)時間分別為(3.25±1.04) w,顯著短于慢性 C57BL/6 小鼠組【(10.0±3.74)w,P<0.05)】;在 BALB/c小鼠模型,注射2.5 μg病毒質(zhì)粒小鼠血清HBsAg持續(xù)時間為(3.67±1.03)w,顯著長于注射50 μg組【(2.33±0.52)w,(P<0.05)】;在高壓尾靜脈注射后第10 d,BALB/c小鼠脾臟出現(xiàn)了HBcAg特異性T淋巴細(xì)胞。結(jié)論成功建立高壓尾靜脈注射HBV感染小鼠模型,發(fā)現(xiàn)宿主遺傳背景、免疫應(yīng)答狀態(tài)和病毒劑量影響HBV感染小鼠模型的建立。
乙型肝炎;pAAV/HBV1.2表達(dá)質(zhì)粒;高壓尾靜脈注射;小鼠
作者單位:430022武漢市 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院感染性疾病科(周云,李盛,唐宗生,楊東亮);附屬同濟(jì)醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)中心(宋景嬌);河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院(周云)
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈全球范圍廣泛流行,慢性感染者達(dá)3.5億人。因此,HBV感染是全球一大公共衛(wèi)生問題[1,2]。HBV感染可引起急性和慢性肝炎,并與肝硬化和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。成人感染HBV后通常表現(xiàn)為急性自限性肝炎,僅有5%會發(fā)展為慢性感染,而新生兒感染后約90%發(fā)展為慢性感染。然而,HBV慢性感染的機(jī)制尚不明確[3]。為了研究HBV感染的免疫病理發(fā)生機(jī)制,迫切需要建立合適的動物模型。小鼠為目前應(yīng)用最廣泛的實驗動物之一,遺傳背景清晰,其免疫學(xué)特征已被廣泛研究。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型已成為廣泛應(yīng)用的小鼠模型。但是,小鼠屬于免疫耐受模型,不適合研究HBV清除機(jī)制[4]。因此,我們建立一種簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)實用的高壓尾靜脈注射感染HBV小鼠模型,可用于急慢性HBV感染的致病機(jī)制研究。
1.1 動物與試劑 SPF級雄性BALB/c和C57BL/6小鼠,6~8周齡,體質(zhì)量為18~22 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。所有動物實驗均符合本校動物實驗倫理學(xué)委員會的規(guī)定。pAAV和pAAV/HBV1.2質(zhì)粒由臺灣大學(xué)陳培哲教授惠贈。檢測HBsAg試劑盒購自上??迫A生物工程股份有限公司;Endo-free Plasmid Maxi Kit購自美國OMEGA公司;ONE Step SYBR PrimerScript RT-PCR Kit購自日本TAKAR公司;動物組織總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;酶聯(lián)免疫斑點檢測試劑盒(ELISPOT)購自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。重組HBcAg和HBsAg購自以色列ProSpec公司。PE標(biāo)記抗鼠CD69抗體及同型對照購自美國Ebioscience公司。本實驗所用引物均購自德國QIAGEN公司。
1.2 HBV感染小鼠模型的建立 將10 μg重組質(zhì)粒pAAV/HBV1.2溶于相當(dāng)于小鼠體質(zhì)量10%的生理鹽水,混勻后轉(zhuǎn)移至注射器備用。用75%酒精消毒小鼠尾部,再用遠(yuǎn)紅外理療儀照射2~3 min,致小鼠尾靜脈充盈并清晰可見,在尾靜脈末端1/3處注入HBV重組質(zhì)粒,在5~8 s內(nèi)完成注射。在高壓尾靜脈注射后定期采血,連續(xù)采血12 w。采血方法為,給予1%戊巴比妥鈉150 μl腹腔注射,麻醉后用滅菌毛細(xì)管從小鼠眼眶內(nèi)側(cè)采血約300 μl,離心分離小鼠血清,凍存于-80℃。在高壓尾靜脈注射后第10、20、30 d處死小鼠,取肝組織,部分肝組織用10%中性福爾馬林固定,用于石蠟切片,另一部分肝組織置液氮凍存后保存于-80℃冰箱。
1.3 血清HBsAg檢測 采用雙抗夾心ELISA法檢測,將小鼠血清與1×PBS按照1:10比例稀釋,充分混勻后加入96孔板,每孔加稀釋血清50 μl,同時設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照,再加等體積的酶結(jié)合物,輕輕混勻,37℃孵育1 h,洗板5次,加顯色劑A液和B液各50 μl,37℃孵育30 min,加終止液50 μl,在酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度值。
1.4 肝組織免疫相關(guān)分子mRNA檢測 取肝組織20 mg,加裂解液RL 300 μl,用研磨棒研磨組織,然后加入去離子水590 μl和蛋白酶K 10 μl,混勻后56℃水浴20 min。離心后取上清,緩慢加入0.5倍無水乙醇,轉(zhuǎn)入吸附柱中,離心后棄廢液,再加入去蛋白液350 μl,離心后棄液,再向柱中加入DNaseⅠ,離心后棄液,再加入漂洗液 500 μl,最后加去離子水50 μl,洗脫。以總RNA為模板,采用RT-PCR法檢測細(xì)胞因子和CD分子mRNA水平,按照 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit說明配制反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 s,60℃20 s,共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,采用Pfaffl法計算目的基因水平。
1.5 小鼠脾細(xì)胞抗原刺激反應(yīng)檢測 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后20 d,給予1%戊巴比妥200 μl腹腔注射,麻醉小鼠,摘眼球采血,斷頸處死小鼠,無菌分離小鼠脾臟,用玻璃注射器活塞研磨脾臟,使用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至4×106個細(xì)胞/毫升。接種脾淋巴細(xì)胞于96孔ELISPOT包被板,加抗原刺激物HBcAg、HBsAg、CMV 和 ConA,終濃度為 0.5 μg/ml,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)30~36 h,在培養(yǎng)過程中不移動培養(yǎng)板。待斑點顯色反應(yīng),扣出孔內(nèi)培養(yǎng)基,加入冰冷的去離子水200 μl,4℃靜置10 min,細(xì)胞處于低滲而裂解,用1×Washing Buffer洗板5次,加生物素標(biāo)記抗體100 μl,37℃孵育1 h,洗板5次,再加酶聯(lián)親和素100 μl,37℃孵育1 h,洗板,加AEC顯色工作液100 μl,室溫避光靜置15~45 min,自來水沖洗板子正反面3~5次,終止顯色,采用ELISPOT斑點計數(shù)儀計數(shù)細(xì)胞。
1.6 肝內(nèi)淋巴細(xì)胞活化檢測 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后第10 d、20 d和30 d,給予小鼠1%戊巴比妥200 μl腹腔內(nèi)注射,采血后斷頸,處死小鼠,放置于75%酒精中浸泡3 min,切開皮膚和腹膜,暴露肝臟,將PBS10 ml緩慢通過肝門靜脈灌洗肝臟,將肝臟放置于70 μm濾網(wǎng)中研磨,加膠原酶Ⅱ裂解肝組織,用lympholyte-M液分離肝內(nèi)淋巴細(xì)胞。加熒光抗體表面染色,每孔肝內(nèi)淋巴細(xì)胞加PBS 100 μl,洗滌1次,加入抗PE-CD69抗體或同型對照(1:100),每孔 50 μl,4℃避光,抗原抗體結(jié)合反應(yīng)30 min,再用PBS洗滌1次,在流式細(xì)胞儀Calibur檢測,觀察肝內(nèi)T淋巴細(xì)胞活化情況。
1.7 統(tǒng)計分析 應(yīng)用GraphPad Prism軟件作圖,應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計量資料以(±s)表示,采用兩獨立樣本 t檢驗,對血清HBsAg陽性持續(xù)率采用Kaplan-Meier分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 不同小鼠血清HBsAg水平變化比較 在注射相同劑量的pAAV/HBV1.2情況下,BALB/c小鼠血清HBsAg持續(xù)時間為(3.25±1.04)w,顯著低于C57BL/6 組【(10.0±3.74)w,P<0.01)】;自高壓尾靜脈注射后第1 d~注射后第12 w,經(jīng)Kaplan-Meier分析,C57BL/6小鼠HBsAg持續(xù)陽性率顯著高于BALB/c小鼠(P<0.05,圖 1),說明我們成功建立了高壓尾靜脈注射HBV感染小鼠模型,但是小鼠遺傳背景影響了HBsAg陽性持續(xù)時間。
圖1 不同遺傳背景小鼠血清HBsAg陽性水平和持續(xù)時間比較A:C57BL/6小鼠血清HBsAg陽性水平顯著高于BALB/c小鼠;B:C57BL/6小鼠血清HBsAg陽性持續(xù)時間顯著長于BALB/c 小鼠(n=8~14)
2.2 注射病毒劑量影響HBV持續(xù)時間 在BALB/c小鼠模型,注射 pAAV/HBV1.2 2.5 μg,血清HBsAg陽性持續(xù)時間為(3.67±1.03)w,顯著長于50 μg 劑量組【(2.33±0.52) w,P<0.05,圖 2A】;經(jīng)Kaplan-Meier分析,注射2.5 μg劑量組小鼠血清HBsAg陽性率顯著高于50 μg劑量組(P<0.05,圖2B)。我們發(fā)現(xiàn),在一定注射劑量范圍內(nèi),注射病毒質(zhì)粒質(zhì)量越多,血清HBsAg清除速度越快。
圖2 注射不同劑量pAAV/HBV1.2質(zhì)粒BALB/c小鼠血清HBsAg陽性水平和持續(xù)時間比較A:在BALB/c小鼠模型,經(jīng)高壓尾靜脈注射不同劑量pAAV/HBV1.2后,發(fā)現(xiàn)注射小劑量組(2.5 μg)小鼠HBsAg陽性水平顯著高于大劑量組(50 μg)小鼠;B:注射不同劑量pAAV/HBV1.2小鼠,血清HBsAg陽性持續(xù)時間比較,經(jīng)Kaplan-Meier分析,發(fā)現(xiàn)大劑量組小鼠血清HBsAg持續(xù)時間反而顯著短于小劑量組小鼠(n=6)
2.3 不同遺傳背景小鼠肝組織免疫相關(guān)分子水平比較 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后第4 d,BALB/c小鼠和 C57BL/6小鼠肝組織 IFN-γ、IL-10、TGF-β和PDL-1 mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但C57BL/6小鼠肝組織IL-6和FOXP3 mRNA 水平顯著高于 BALB/c小鼠(P<0.05,圖 3),暗示C57BL/6小鼠血清HBsAg持續(xù)陽性可能與肝內(nèi)免疫負(fù)調(diào)控分子FOXP3表達(dá)升高有關(guān)。
2.4 肝內(nèi)T淋巴細(xì)胞活化動態(tài)變化 給予BALB/c小鼠高壓尾靜脈注射pAAV空載體對照質(zhì)粒或pAAV/HBV1.2各10 μg,在注射后第10 d,注射pAAV/HBV1.2組小鼠肝內(nèi)CD69+/CD8+T淋巴細(xì)胞活化比例顯著升高,在第20 d和30 d下降(P<0.05,圖4)。
圖3 不同遺傳背景小鼠肝組織免疫相關(guān)分子mRNA水平比較 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后第4 d,發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠肝組織IL-6和FOXP3 mRNA水平顯著高于BALB/c小鼠
圖4 肝內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞CD69分子動態(tài)變化 在BALB/c小鼠模型,在注射pAAV/HBV1.2后第10 d,肝內(nèi) CD8+T淋巴細(xì)胞被活化,而在第20 d和30 d,卻不再見到T淋巴細(xì)胞被活化
2.5 HBsAg和HBcAg特異性T淋巴細(xì)胞數(shù)量的比較 BALB/c小鼠在高壓尾靜脈注射pAAV或pAAV/HBV1.2 10 μg后第20 d,以分泌IFN-γ為特征,未發(fā)現(xiàn)HBsAg特異性T細(xì)胞,而HBcAg特異性T細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05,圖5),說明HBcAg能致敏淋巴細(xì)胞,可能在清除HBV感染過程中發(fā)揮作用。
圖5 HBsAg和HBcAg特異性T細(xì)胞數(shù)量變化 在BALB/c小鼠模型,經(jīng)高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2后第20 d,未見HBsAg特異性T細(xì)胞,而HBcAg特異性T細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)
HBV感染宿主范圍狹窄,目前僅人類和黑猩猩可感染HBV。由于倫理及經(jīng)費等問題,應(yīng)用黑猩猩進(jìn)行科學(xué)研究受到了限制。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠屬于免疫耐受模型,無法用于HBV自限性清除的研究[3,5]。本實驗將pAAV/HBV1.2質(zhì)粒經(jīng)高壓尾靜脈注射BALB/c小鼠體內(nèi),產(chǎn)生急性HBV復(fù)制過程,模擬人類急性自限性感染過程[4,6,7]。該模型既探討了HBV清除機(jī)制,又為HBV感染小鼠模型的建立提供技術(shù)上的支持。
HBV清除與動物遺傳背景和年齡相關(guān)。我們的實驗結(jié)果證明HBV在C57BL/6小鼠體內(nèi)清除速度慢于BALB/c小鼠,與BALB/c小鼠對HBsAg所產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答強(qiáng)于C57BL/6小鼠有關(guān)[8]。宿主年齡越大,清除HBV速率越快,免疫功能健全的成人感染后常為自限性感染,而嬰幼兒感染多為持續(xù)性慢病毒感染[9,10]。
注射的病毒劑量影響HBV感染的持續(xù)時間[11,12]。具有正常免疫功能的小鼠,在給予小劑量的HBV腺病毒載體后,可以導(dǎo)致HBV感染持續(xù)存在,而大劑量HBV注射將導(dǎo)致病毒被快速清除[13]。
適應(yīng)性免疫通常被認(rèn)為在清除HBV方面發(fā)揮重要的作用[14,15]。病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)直接與感染的肝細(xì)胞接觸,并殺傷清除肝細(xì)胞。然而,這并不是最有效的清除方式[16]。特異性CTL分泌IFN-γ,通過抑制病毒復(fù)制及衣殼體組裝而呈非溶解性清除病毒[17,18]。在急性自限性感染時,HBV DNA在病毒復(fù)制高峰后2~3周下降90%,肝臟不出現(xiàn)明顯的病理性損傷,說明CD8+T細(xì)胞分泌的 IFN-γ 等細(xì)胞因子能非溶解性清除 HBV[14,19,20]。我們在急性HBV感染小鼠模型檢測到HBcAg特異性分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞,因而認(rèn)為HBcAg或其形成的核衣殼在清除HBV感染過程中起一定的作用。
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(收稿:2016-10-26)
(本文編輯:陳從新)
Establishment of hepatitis B virus infection model in different mice by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid
Zhou Yun,Li Sheng,Tang Zongsheng,et al.Department of Infectious Disease,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China
Hepatitis B;pAAV/HBV1.2 plasmid;Hydrodynamic injection;Mice
10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.007
國家傳染病防治科技重大專項項目(編號:2008ZX10002-011)
周云,男,36歲,醫(yī)學(xué)博士。主要從事感染與免疫研究。E-mail:zyky120@126.com
宋景嬌,E-mail:jjsong@tjh.timu.edu.cn
【Abstrat】Objective To establish the acute or chronic HBV-infection mouse model.Methods Acute or chronic HBV-infection mouse model was established by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid.Serum HBsAg were detected by ELISA.The immune-related molecule mRNA were detected by real-time PCR.The activated lymphocytes in the livers were detected by FACS and ELISPOT was used to detect the HBV-specific cellular immune response.Results We successfully established the acute and chronic HBV-infection mouse model by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid;The duration of serum HBsAg secretion in acute HBV-infected BALB/c mice was (3.25±1.04) weeks,significantly shorter than that in chronic HBV-infected C57BL/6 mice[(10.0±3.74) weeks,P<0.05];The duration of serum HBsAg secretion in BALB/c mice injected with low dose (2.5μg) of pAAV/HBV1.2 plasmid was(3.67±1.03) weeks,significantly longer than that in high dose(50μg) group[(2.33 ±0.52) weeks,P <0.05];On the tenth day after hydrodynamic injection,HBcAg special T lymphocytes appeared in the spleen of BALB/c mice.Conclusion HBV-infection mouse model is successfully established by hydrodynamic injection of pAAV/HBV1.2 plasmid and we find that mouse genetic background,immune response and viral doses will impact the establishment of this kind of HBV-infection mouse model.