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(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

發(fā)酵-酶解耦合法大豆苷元轉(zhuǎn)化工藝

李笑梅,向世新,楊春華,馬慧玲,張娜

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

以市售大豆異黃酮粉為樣品,選用產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的LJ-Q2菌種與優(yōu)化后的固定化β-葡萄糖苷酶進(jìn)行耦合發(fā)酵,采用單因素、響應(yīng)曲面法對(duì)耦合發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,高效液相法(HPLC)測(cè)定大豆異黃酮苷元,考察耦合發(fā)酵條件對(duì)大豆苷元轉(zhuǎn)化率的影響。研究結(jié)果如下:最優(yōu)條件為溫度54 ℃,耦合時(shí)間3 h,初始pH7,固定化酶添加量7%;大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量13.76 mg,大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率為76.8%。對(duì)大豆苷制備應(yīng)用技術(shù)開發(fā)有參考價(jià)值。

固定化,耦合發(fā)酵,大豆苷元,轉(zhuǎn)化率

大豆異黃酮(Soybean Isoflavone,SI)主要存在于大豆種皮、子葉、胚軸中[1]。是大豆生長過程形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物,被稱為“植物雌激素”,是大豆中一類重要的生理活性物質(zhì)[2]。分為游離型和結(jié)合型兩種,也稱苷元和糖苷?，F(xiàn)在已知的大豆異黃酮的同分異構(gòu)體一共有12種[3]。游離型苷元又稱非糖部分(大豆異黃酮配基),有3種:大豆素(Daidzein)、黃豆黃素(Glycitein)、染料木素(Genistein),以及對(duì)應(yīng)的9種結(jié)合型糖苷:葡萄糖苷型3種、乙?；咸烟擒招?種和丙二酰基葡萄糖苷型3種[4-5]。在天然的大豆異黃酮產(chǎn)品中,具有生物活性的大豆異黃酮苷元易被人體吸收[6-8],僅占總量的2%～3%,剩余的是不易被人體吸收的結(jié)合型糖苷,占97%～98%[9]。大豆異黃酮具有重要的生物學(xué)活性,在類雌激素、抗腫瘤、預(yù)防骨質(zhì)疏松和心血管疾病等方面有確切作用[10]。

國內(nèi)外研究表明,游離型生物活性高于結(jié)合型[11-13],糖苷型的大豆異黃酮不能直接被小腸壁吸收,必須經(jīng)水解去除糖基轉(zhuǎn)化為游離型的苷元才可被小腸吸收[14],所以要將結(jié)合型糖苷轉(zhuǎn)化成游離型苷元,關(guān)鍵技術(shù)是提高大豆苷元轉(zhuǎn)化率,開發(fā)出大豆苷元轉(zhuǎn)化新途徑、新工藝。大豆苷元轉(zhuǎn)化技術(shù)主要有酸堿水解法;酶水解法[15],最主要的酶有β-葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等[16];微生物降解法,對(duì)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌種研究主要集中在酵母、曲霉、木霉以及細(xì)菌內(nèi)[17]。韓慧[18]得出微波、炒制、烘箱干燥有利于大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化。關(guān)于苷元轉(zhuǎn)化工藝的相關(guān)研究多半側(cè)重于單一技術(shù),耦合方法少見報(bào)道。

綜合目前的相關(guān)研究,存在的問題是,大豆苷元的提取率和轉(zhuǎn)化率都比較低,市售的大豆異黃酮產(chǎn)品總黃酮含量在30%～80%,而且其中苷元絕對(duì)質(zhì)量也很低。另外,作為工業(yè)原料的市售大豆異黃酮主要是結(jié)合型,但游離型含量較高的產(chǎn)品價(jià)格相對(duì)較高。因此,開發(fā)大豆苷元轉(zhuǎn)化新途徑非常有意義。據(jù)此,在前期研究工作基礎(chǔ)上將產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的LJ-Q2腸道菌種與優(yōu)化后的固定化β-葡萄糖苷酶進(jìn)行耦合發(fā)酵大豆異黃酮粉,旨在開發(fā)大豆苷元轉(zhuǎn)化的新工藝,優(yōu)化耦合工藝條件參數(shù),更好的提高苷元轉(zhuǎn)化率,為促進(jìn)大豆異黃酮的利用率以及苷元制備技術(shù)開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

大豆異黃酮粉(含量 30%) 河南眾信生物科技有限公司;大豆素標(biāo)準(zhǔn)品Daidzein(純度 99%)、大豆黃素標(biāo)準(zhǔn)品Glycitein(純度 99%)、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品Genistein(純度 99%)、大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品Daidzin(純度 99%)、大豆黃苷標(biāo)準(zhǔn)品Glycitin(純度 99%)、染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品Genistin(純度 99%) 西安市天園生物制藥廠;LJ-Q2腸道菌 自素食者糞便分離鑒定;黑曲霉β-葡萄糖苷酶 南京生利德生物技術(shù)有限公司;殼聚糖 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;海藻酸鈉 天津市福晨化學(xué)試劑廠;腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;甲醇 美國天地公司,色譜純;檸檬酸 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,分析純;磷酸氫 二鉀天津市化學(xué)試劑一廠,分析純;氯化鈣 吉林宏久試劑廠,分析純;硫酸銨、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鋅 天津市天新精細(xì)化工開發(fā),分析純;吐溫-80 邢臺(tái)藍(lán)星助劑廠。

YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-1超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)儀器制造有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;Agilent 1200LC高效液相色譜 美國安捷倫公司;TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;SHZ-D3循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;AS3120A超聲波 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì) 上海精密儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化β-葡萄糖苷酶的制備 采用海藻酸鈉-殼聚糖法將β-葡萄糖苷酶固定化[19]。吸取稀釋酶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的海藻酸鈉水溶液混合均勻。用注射器緩慢滴到2%的殼聚糖-醋酸溶液和2%的CaCl2溶液混合溶液,形成微膠囊。然后置于冰箱在恒溫層4 ℃的溫度下硬化2 h,抽濾。在0.2%的戊二醛中,40 ℃下、交聯(lián)1 h[20]。洗滌,得到固定化酶,置于冰箱恒溫層儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 六種大豆異黃酮定性定量方法 稱取一定量大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品,用80%甲醇溶解超聲30 min后定容,配制成六種單標(biāo)液,各濃度為0.4 mg/mL。再用上述六種標(biāo)液以相同比例分別配制成0.048、0.096、0.144、0.192、0.240 mg/mL系列濃度大豆異黃酮混和標(biāo)液[21]。

用0.048 mg/mL混標(biāo)在雙光束紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行全波長掃描,確定最大吸收波長。

采用高效液相色譜法進(jìn)行定性定量檢測(cè),固定相為Agilent1200LC C18柱(250 mm×4.6 mm 5 μm),以甲醇、水為流動(dòng)相,以甲醇∶(水+甲醇)=20%～60%的比例進(jìn)行梯度洗脫,流速為1.2 mL/min,柱溫為40 ℃,檢測(cè)波長為確定的最大吸收波長。將各單標(biāo)過0.45 μm微孔濾膜于進(jìn)樣瓶中,依次進(jìn)樣,各組分保留時(shí)間作為樣品的定性依據(jù)。用配置好的混合標(biāo)液進(jìn)樣,得到六種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

按公式(1)分別計(jì)算每種大豆異黃酮含量,游離型大豆異黃酮總量由三種游離型大豆異黃酮相加得出,結(jié)合型大豆異黃酮總量由三種結(jié)合型大豆異黃酮相加得出。

m=c×V×10-3

式(1)

式(1)中:c-由各類型大豆異黃酮回歸方程得出其濃度,μg/mL;V-定容體積,mL。

按公式(2)計(jì)算游離型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化率。

式(2)

式(2)中:m-每種大豆異黃酮絕對(duì)質(zhì)量,mg;m1-樣品中游離型異黃酮絕對(duì)質(zhì)量,mg;m2-耦合發(fā)酵后游離型異黃酮絕對(duì)質(zhì)量,mg；m3-樣品中結(jié)合型異黃酮絕對(duì)質(zhì)量,mg。

1.2.3 耦合發(fā)酵工藝 用于發(fā)酵的LJ-Q2腸道菌是前期工作自素食者腸道分離得到的革蘭氏陽性球菌,為厭氧型,與黑曲霉相比較,在發(fā)酵時(shí)間短于64 h時(shí)LJ-G1、LJ-Q2產(chǎn)酶能力高于黑曲霉[22],產(chǎn)β-葡萄糖苷酶[23]。配置50 mL腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI),將活化后的LJ-Q2腸道菌接種于BHI液體培養(yǎng)基中,接菌量(體積分?jǐn)?shù))5%、培養(yǎng)基pH8、培養(yǎng)溫度38 ℃、培養(yǎng)時(shí)間38 h。將大豆異黃酮粉原料進(jìn)行發(fā)酵,待發(fā)酵時(shí)間剩余3 h時(shí),添加固定化酶于發(fā)酵液中,進(jìn)行耦合酶解發(fā)酵,初始pH為7、耦合時(shí)間為3 h,固定化酶添加量為5%,溫度40 ℃,然后在空氣搖床中發(fā)酵,得酶解發(fā)酵液。

1.2.4 耦合發(fā)酵工藝單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)主要考察耦合溫度,耦合時(shí)間,初始pH,固定化酶添加量四個(gè)因素,以未經(jīng)耦合發(fā)酵的經(jīng)炒制后的大豆異黃酮原料為對(duì)照組,采用HPLC進(jìn)行檢測(cè),以游離型大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo),各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4.1 初始pH對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響 在其他條件不變的情況下,考察初始pH4、5、6、7、8,耦合溫度為40 ℃,耦合時(shí)間為3 h,酶添加量為5%。對(duì)耦合發(fā)酵大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響。

1.2.4.2 耦合溫度對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響 在其他條件不變的情況下,考察耦合溫度20、30、40、50、60 ℃,初始pH7,耦合時(shí)間為3 h,酶添加量為5%。對(duì)耦合發(fā)酵大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響。

1.2.4.3 耦合時(shí)間對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響 在其他條件不變的情況下,考察耦合時(shí)間1、3、5、7、9 h,初始pH7,耦合溫度40 ℃,酶添加量為5%。對(duì)耦合發(fā)酵大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響。

1.2.4.4 酶添加量對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響 在其他條件不變的情況下,考察酶添加量1%、3%、5%、7%、9%,初始pH7,耦合溫度40 ℃,耦合時(shí)間3 h。對(duì)耦合發(fā)酵大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化耦合發(fā)酵工藝條件 采用Box-Behnken模型,以溫度、時(shí)間、初始pH和酶添加量四個(gè)單因素為耦合發(fā)酵大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量影響的主要考察因子(自變量),分別以A、B、C、D表示,并以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平對(duì)自變量進(jìn)行編碼。因子編碼及水平見表1。并采用多元回歸分析,擬合二次多項(xiàng)式回歸模型的Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)[24],進(jìn)行結(jié)果分析,得到固定化酶水解大豆異黃酮粉優(yōu)化工藝條件,在此基礎(chǔ)上,做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels Table of Box-Behnken design

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)三次,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素顯著性分析,采用Design-Expert 8.05b軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案、建立數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行多元回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1六種大豆異黃酮標(biāo)樣定性檢測(cè)

2.1.1 大豆異黃酮最大吸收波長 由紫外掃描圖可以看出,確定259 nm為最大吸收波長,作為液相的測(cè)定條件。

圖1 大豆異黃酮紫外全波長掃描圖Fig.1 Soy isoflavones full wavelength ultraviolet scan

2.1.2 游離大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線 用HPLC法分別測(cè)定配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣量20 μL,n=3。以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 六種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of six soybean isoflavones

峰面積y對(duì)濃度x(μg/mL)進(jìn)行回歸分析,回歸方程分別為:

大豆素:y=129.55x-43.855,r=0.9996;大豆黃素:y=61.151x-53.554,r=0. 998;

染料木素:y=105.85x-50.178,r=0.9991;大豆苷:y=53.574x-34.498,r=0.9987;

大豆黃苷:y=60.494x-43.071,r=0.9986;染料木苷:y=71.444x-27.151,r=0.9990。

式中:y為大豆異黃酮的峰面積:x 為大豆異黃酮的濃度,μg/mL,線性范圍是0～40 μg/mL。

2.1.3 大豆異黃酮的定性

2.1.3.1 混合標(biāo)樣中六種大豆異黃酮定性 根據(jù)單標(biāo)的保留時(shí)間對(duì)混標(biāo)色譜圖各組分進(jìn)行定性。由圖3可知:19.200 min是大豆苷,20.700 min是大豆黃苷,24.604 min是染料木苷,36.321 min是大豆素,38.383 min是大豆黃素,41.861 min是染料木素。

圖3 混合標(biāo)樣大豆異黃酮色譜圖Fig.3 The chromatogram of six soyisoflavones in standard substance

2.1.3.2 原料中大豆異黃酮的定性定量 由圖4可知,原料中各組分大豆異黃酮出峰時(shí)間與圖3混合標(biāo)樣各組分的出峰時(shí)間相同,含有上述六種大豆異黃酮。根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出原料中大豆苷含量為2.187 mg/g;大豆黃苷含量為1.764 mg/g;染料木苷含量為1.242 mg/g;大豆素含量為3.661 mg/g;大豆黃素含量為0.634 mg/g;染料木素含量為0.4 mg/g。三種結(jié)合型異黃酮總含量為5.193 mg/g;三種游離型異黃酮總含量為4.695 mg/g。

圖4 原料未經(jīng)預(yù)處理大豆異黃酮色譜圖Fig.4 The chromatogram of soybean isoflavoneswithout any pretreatment in sample

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 初始pH對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響結(jié)果 如圖5所示,初始pH是4.0時(shí)大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量較低,然后隨pH上升,苷元絕對(duì)質(zhì)量同步增加,初始pH7,苷元絕對(duì)質(zhì)量達(dá)到最高,之后開始下降,經(jīng)顯著性分析,pH6和pH7(p>0.05)無顯著性差異,pH7和pH8(p>0.05)也無顯著性差異。pH5和pH7(p<0.05)存在顯著性差異,表明適宜的初始pH為6.0～8.0。

圖5 初始pH對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響Fig.5 Effect of initial pH on the absolute quality of aglycone

2.2.2 耦合溫度對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響結(jié)果 如圖6所示,耦合溫度為20 ℃時(shí)大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量較低,然后隨溫度升高,苷元絕對(duì)質(zhì)量也增加,到50 ℃時(shí)苷元絕對(duì)質(zhì)量最高,之后開始下降,經(jīng)顯著性分析,40 ℃和50 ℃(p<0.05)存在顯著性差異,50 ℃和60 ℃(p<0.05)同樣存在顯著性差異。表明適宜溫度為40～60 ℃。

圖6 溫度對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響Fig.6 Effect of temperature on the absolute quality of aglycone

2.2.3 耦合時(shí)間對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響結(jié)果 如圖7所示,當(dāng)耦合時(shí)間為1 h時(shí)大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量較低,隨著耦合時(shí)間上升,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量升高,耦合時(shí)間為3 h時(shí)苷元酮絕對(duì)質(zhì)量最高,之后絕對(duì)質(zhì)量開始下降,經(jīng)顯著性分析,1 h和3 h存在顯著性差異(p<0.05),3 h和5 h(p>0.05)無顯著性差異。表明適宜時(shí)間為1～5 h。

圖7 耦合時(shí)間對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響Fig.7 Effect of coupling time on absolute quality of aglycone

2.2.4 酶添加量對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響結(jié)果 如圖8所示,固定化酶添加量為1%時(shí)大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量較低,然后隨酶添加量增加,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量同步升高,添加量為7%時(shí)苷元絕對(duì)質(zhì)量最高,之后開始下降,經(jīng)顯著性分析,5%和7%(p<0.05)有顯著性差異,7%和9%(p>0.05)無顯著性差異,表明固定化酶適宜添加量為5%～9%。

圖8 酶添加量對(duì)苷元絕對(duì)質(zhì)量的影響Fig.8 Effect of enzyme additionon the absolute quality of aglycone

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)利用Design-Expert軟件,獲得響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

表3 響應(yīng)面回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test and the regression equation of response surface experiment

注:p<0.01,差異極顯著,**表示;p<0.05,差異顯著,*表示。

由表2可以看出,2組游離型大豆異黃酮絕對(duì)質(zhì)量最高為12.42 mg。根據(jù)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果,經(jīng)回歸擬合后,各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可通過以下回歸方程表示:

Y=11.53+0.34A+0.071B+0.035C+0.51D-0.14AB-0.14AC-0.057AD-0.074BC-0.097BD+0.14CD+0.031A2-0.98B2-0.17C2-1.67D2

響應(yīng)面回歸方程及顯著性分析見表3。

2.4耦合發(fā)酵法制備大豆異黃酮苷元響應(yīng)面分析圖

由圖9可知,溫度為40 ℃,隨溫度的上升,苷元絕對(duì)質(zhì)量逐漸加大,溫度在54 ℃左右,苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大值,之后又慢慢下降。隨水解時(shí)間繼續(xù)增加,苷元絕對(duì)質(zhì)量增大,在水解時(shí)間3 h左右,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大值,其后呈下降趨勢(shì)。

圖9 溫度和水解時(shí)間的交互作用對(duì)大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.9 Effects of temperature and hydrolysis timeon the content of soybean isoflavone glycosides

圖10 溫度和pH的交互作用對(duì)大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.10 Effects of temperature and pH interactionon the content of soybean isoflavone glycosides

由圖10可知,溫度為40 ℃,隨溫度的上升,苷元絕對(duì)質(zhì)量逐漸升高,溫度在54 ℃左右,苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大值,之后又慢慢下降。然后pH的增加,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量增大,在初始pH為7左右,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大值,其后呈下降趨勢(shì)。

由圖11可知,隨溫度的升高,苷元絕對(duì)質(zhì)量逐漸加大,溫度在54 ℃左右,苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大,之后又慢慢下降。然后固定化酶添加量的增加,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量增大,在固定化酶添加量7%左右,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大值,其后呈下降趨勢(shì)。

圖11 溫度和酶添加量的交互作用對(duì)大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.11 Effects of temperature and enzyme interactionon the content of soybean isoflavone glycosides

由圖12可知,水解時(shí)間的延長,苷元絕對(duì)質(zhì)量加大,水解時(shí)間3 h左右,苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大,之后又呈下降趨勢(shì)。當(dāng)pH增加苷元絕對(duì)質(zhì)量增大,在初始pH為7左右時(shí),大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大值,其后呈下降趨勢(shì)。

圖12 水解時(shí)間和pH的交互作用對(duì)大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.12 Effects of hydrolysis time and pHon the content of soybean isoflavone glycosides

由圖13可知,水解時(shí)間延長,苷元絕對(duì)質(zhì)量增大,在水解時(shí)間3 h左右,苷元絕對(duì)質(zhì)量到達(dá)最高點(diǎn),之后又呈下降趨勢(shì)。隨著固定化酶添加量加大,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量增大,在固定化酶添加量在7%左右,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大值,其后呈下降趨勢(shì)。

圖13 水解時(shí)間和酶添加量的交互作用對(duì)大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.13 Effects of interaction between hydrolysis timeand enzyme content on soybean isoflavone glycoside content

由圖14可知,隨pH的上升,苷元絕對(duì)質(zhì)量逐漸升高,然后pH在7左右時(shí)苷元絕對(duì)質(zhì)量到達(dá)最高點(diǎn),之后又慢慢下降。隨著固定化酶添加量的升高,苷元絕對(duì)質(zhì)量增大,在固定化酶添加量在7%左右,苷元絕對(duì)質(zhì)量為最大值,其后呈下降趨勢(shì)。

圖14 pH和酶添加量的交互作用對(duì)大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.14 Effects of the interaction of pH and enzyme contenton the content of soybean isoflavone glycosides

由耦合發(fā)酵法制備大豆異黃酮苷元響應(yīng)面分析圖得到最優(yōu)耦合發(fā)酵條件溫度54.03 ℃,水解時(shí)間3 h,初始pH7,固定化酶添加量7.29%。以此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),耦合發(fā)酵條件溫度54 ℃,水解時(shí)間3 h,初始pH7,固定化酶添加量7%,大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量13.76 mg,與響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)中的第2組結(jié)果12.42 mg差異顯著(p<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。耦合發(fā)酵前原料樣品中大豆異黃酮苷元絕對(duì)質(zhì)量為6.695 mg,三種結(jié)合型異黃酮總絕對(duì)質(zhì)量為9.193 mg,根據(jù)公式(2)計(jì)算出大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率76.8%。

其大豆苷元轉(zhuǎn)化率與近幾年相關(guān)研究結(jié)果相比均有提高,張濤[25](2008)采用固定化酶β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮轉(zhuǎn)化率達(dá)到70%,相比之下轉(zhuǎn)化率增加了6.8%。素食者糞便分離到的腸道菌LJ-Q2具有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力[13],課題前期李笑梅[22]采用LJ-Q2菌株發(fā)酵大豆異黃酮轉(zhuǎn)化率達(dá)到 39.4%,相比之下轉(zhuǎn)化率增加了37.4%。與黑曲霉相比產(chǎn)酶能力達(dá)到峰值的時(shí)間短為36 h,遠(yuǎn)短于黑曲霉108 h。由此認(rèn)為采用LJ-Q2菌-β-葡萄糖苷酶耦合發(fā)酵法全程發(fā)酵時(shí)間明顯縮短,且可以提高大豆苷元轉(zhuǎn)化率,具有開發(fā)應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到耦合發(fā)酵最優(yōu)條件為溫度54 ℃,耦合時(shí)間3 h,初始pH7,固定化酶添加量7%,此條件下大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率為76.8%。其大豆苷元轉(zhuǎn)化率與近幾年相關(guān)研究結(jié)果相比均有提高,對(duì)大豆苷制備應(yīng)用技術(shù)開發(fā)有參考價(jià)值。后續(xù)工作應(yīng)進(jìn)一步討論另外六種結(jié)合型,即丙二酰基葡萄糖苷型和乙?；咸烟擒招偷能赵D(zhuǎn)化,探討多種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶復(fù)合菌種與β-葡萄糖苷酶耦合發(fā)酵途徑,多途徑提高大豆異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率,開發(fā)易于實(shí)際生產(chǎn)的應(yīng)用技術(shù)。

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Fermentation-enzymaticcouplingmethodfordaidzeintransformation

LIXiao-mei,XIANGShi-xin,YANGChun-hua,MAHui-ling,ZHANGNa

(Key Laboratory of Food Science and Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

The commercially available soybean isoflavone powder was used as sample,LJ-Q2 strain withβ-glucosidase was selected and coupled with optimized immobilizedβ-glucosidase.The coupling conditions were optimized by single factor and response surface method. The content of soybean isoflavone glycoside was determined by high performance liquid chromatography(HPLC). The effects of coupled fermentation conditions on the conversion of daidzein were investigated.The results of optimal conditions were as follows:temperature 54 ℃,coupling time 3 h,initial pH7,immobilized enzyme addition amount 7%. The absolute quality of soybean isoflavone aglycon was 13.76 mg,the conversion rate of soybean isoflavone aglycon was 76.8%,application of technology development for soybeans glycosides had reference value.

immobilization;coupled fermentation;daidzein;conversion rate

TS201.3

A

1002-0306(2017)19-0118-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.023

2017-03-24

李笑梅(1960-),女,大學(xué)本科,教授,研究方向:食品科學(xué),E-mail:lixm0451@163.com。

黑龍江省科技廳應(yīng)用技術(shù)項(xiàng)目(GC13B203);黑龍江省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(2010td04)。