,,,,*

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457;2.威海海洋職業(yè)學院食品工程系,山東威海 264300)

白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水有機成分分析

盛杰1,2,徐亞超1,紀海玉1,劉安軍1,*

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457;2.威海海洋職業(yè)學院食品工程系,山東威海 264300)

本研究對白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水主要有機成分進行定性和定量分析。首先使用指示劑法檢測蛋白質或多肽以及生物堿;其次應用標準曲線法測小分子糖、氨基酸,頂空固相微萃取-氣相色譜法檢測乙醇含量;最后采用高效液相色譜法測有機酸種類和含量,頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用檢測揮發(fā)性成分。研究發(fā)現(xiàn),黃水中含有氨基酸,不含多肽、蛋白質和生物堿,pH為4.34,乙醇1.04 mL/100 mL,小分子糖含量11.01 mg/mL,氨基酸含量5.11 mg/mL,乙酸737.58 mg/100 mL,甲酸248.73 mg/100 mL,揮發(fā)性成分共有56種,其中酯類物質占90.38%。結果表明,白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水的有機成分主要為小分子糖、氨基酸、乙醇、乙酸、甲酸和酯類物質。

白酒,釀酒黃水,有機成分,定性定量分析

釀酒黃水是采用固態(tài)法發(fā)酵生產(chǎn)濃香類白酒時產(chǎn)生的一種副產(chǎn)物,別名黃漿水[1-2]。濃香類白酒常以高粱、大米、小麥、豆類等作為主要原料,經(jīng)過加入曲種、送水于池內后進行發(fā)酵所得[3-4]。由于原料不同,副產(chǎn)物黃水中主要成分所含種類和含量也會有所不同。釀酒原料在進行發(fā)酵過程中,大分子物質如淀粉、糊精,分解后的小分子物質如還原糖、乙醇等,以及微生物菌種等成分均混合于水中,并且經(jīng)長期在窖池底部沉積,形成黃水[4]。由此得出,黃水中所含物質豐富,大體含淀粉、還原糖、酒精、單寧及色素等,除上述成分外,還存在大量酸類物質,以有機酸為主[5-6],酯類物質也是釀酒黃水中常見的一類物質,其中以脂肪酸乙酯所占比例最多。

目前,在我國很多酒廠都是采用回窖發(fā)酵、培養(yǎng)人工窖泥、養(yǎng)窖等方式方法來處理釀酒黃水[7],雖然在一定程度上實現(xiàn)了釀酒黃水的資源化再利用,但沒有大范圍得到解決,很多釀酒黃水被作為廢棄物直接被排放到環(huán)境中,造成了黃水資源的浪費,而且對環(huán)境造成了嚴重污染。近年來,基于黃水中含有的豐富營養(yǎng)成分,科研技術人員充分探討研究黃水在各個領域的用途,以此找出更多新的應用領域來提高釀酒黃水的使用價值。

本文系統(tǒng)分析了白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水可能的主要成分,旨在探尋其發(fā)揮主要抑菌作用的成分。前期研究證明:釀酒黃水對常見的致病菌細菌(大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌)以及根霉菌和青霉菌等部分霉菌都有明顯的抑菌性能;同時也證明了黃水的抑菌性能在高溫、低溫、紫外線照射、高糖、高鹽,金屬離子等外界條件的干擾下,都表現(xiàn)出較好的抑菌性能;這都為發(fā)酵工業(yè)副產(chǎn)物黃水的應用提供思路,利用黃水的抑菌性能,可代替部分合成防腐劑作為天然保鮮劑應用于食品中。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

白酒、釀酒黃水 江蘇大風歌酒業(yè)有限公司;茚三酮、碘化鉀、草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸、丙酸、95%乙醇、叔丁醇 均為分析純。

電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械三廠;pHS-25型pH計 上海雷磁儀器廠;SAAB-57324SPME手動萃取頭 上海安譜科學儀器有限公司;HP5809氣相色譜/質譜計算機聯(lián)用儀 美國惠普公司;Waters e2695高效液相色譜儀 德國Waters公司;GC9700型氣相色譜儀 溫嶺市福立分析儀器有限公司;氫火焰檢測器(FID)。

1.2實驗方法

1.2.1 雙縮脲定性實驗 取黃水1 mL于試管中,先向試管中加入1 mL雙縮脲試劑A,搖勻,再向試管中加入2滴雙縮脲試劑B,振蕩搖勻,觀察顏色變化[8]。

1.2.2 茚三酮定性實驗 取黃水1 mL于試管中,用滴管加入0.2%茚三酮乙醇試劑2滴,搖勻,沸水浴加熱2 min,待顏色穩(wěn)定后,冷卻,觀察顏色變化[9]。

1.2.3 碘-碘化鉀定性實驗 取黃水1 mL于試管中,加入碘-碘化鉀試劑,觀察試管中顏色變化[10]。

1.2.4 頂空固相微萃取-氣相色譜法測乙醇含量 首先,手持萃取頭Hub(PDMS-100 μm)一端和手柄接入后將其插入GC進樣口進行活化。條件為230 ℃、30 min;色譜柱:石英毛細管柱DB-ALC2 30 m×0.53 mm×2 μm;柱溫40 ℃;氣化室溫度220 ℃;檢測器溫度220 ℃;解析條件220 ℃,解析時間60 s;用超純水配置濃度分別為1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 mg/mL的一系列乙醇標準溶液;取標準溶液體積5 mL注入15 mL頂空瓶中,按0.15 g/mL加入氯化鈉鹽析劑,并加入1 mL叔丁醇內標工作液(1000 μg/L),在頂孔瓶內放入攪拌磁子,并且隔墊將口密封,設置萃取溫度為50 ℃,平衡時間為5 min,萃取時間為30 min,后立即上樣進行氣相色譜分析。以乙醇的峰面積作為縱坐標,乙醇的標準溶液濃度作為橫坐標,繪制標準曲線;同理,首先量取1 mL黃水于容量瓶中,用重蒸水定容至5 mL,然后轉移至15 mL頂空瓶中,加入0.75 g氯化鈉鹽析劑與1 mL叔丁醇內標工作液(1000 μg/L),放入攪拌磁子后隔墊密封;并放于磁力加熱攪拌器上加熱攪拌,后將SPME萃取頭萃取后的待測試樣立即進行氣相色譜分析;所有實驗均進行3次,標準曲線法進行定量分析[11]。

1.2.5 酸度的測定 樣品過濾后,取50 mL于100 mL燒杯,在室溫下用pH計多次測量,待穩(wěn)定后,記錄pH;

1.2.6 有機酸含量和種類的測定 色譜柱:Spursil C18(250×4.6 mm×5 μm);檢測波長215 nm,流速1 mL/min,進樣量20 μL;流動相:準確稱取KH2PO44.0827 g,三蒸水溶解后定容至1000 mL容量瓶,磷酸調pH至2.8,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后于超聲波清洗器中脫氣30 min備用。標準品配置:分別稱以下有機酸,均放于50 mL容量瓶中,三蒸水定容至刻度,按表1配置各有機酸標準溶液和有機酸混合標準溶液,過0.45 μm的微孔纖維素濾膜備用。樣品過0.45 μm的微孔纖維素濾膜備用,上機,根據(jù)保留時間確定樣品中有機酸種類,采用外標定量的方法,計算樣品中各物質的含量[12-14]。

表1 標準品的濃度及色譜保留時間Table 1 Concentration and reserved time of normal sample

1.2.7 揮發(fā)性成分的測定 色譜條件:色譜柱:DB-5 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣溫度:250 ℃;載氣:He,99.999%;分流比:20∶1;程序升溫:初始溫度80 ℃,保持3 min,然后以3 ℃/min升至230 ℃,保持20 min。質譜條件:質量分離器:離子阱;離子源:EI;電離能量:70 eV;離子阱溫度:220 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延長時間:2.5 min;掃描方式:全掃描;掃描范圍:50～1000 m/z;萃取頭(PDMS-100 μm)的處理:15 mL頂空瓶中裝入5 mL釀酒黃水,并封蓋,插入固相微萃取裝置,萃取溫度50 ℃,平衡時間5 min,萃取時間30 min。取出萃取頭,直接進樣進行GC-MS分析,解析時間10 min,化合物組成的分析以計算機NIST05譜庫檢索結果和人工譜圖解析相結合的方法確定,按面積歸一化法進行定量[15-16]。

1.2.8 糖含量的測定 準備8只洗凈的試管,分別取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL標準葡聚糖液,加蒸餾水補齊1 mL,每個試管再加6%苯酚溶液1 mL,加濃硫酸5 mL,混勻,微振,靜置10 min,沸水浴中加熱15 min后,取出迅速冷卻至室溫,放置20 min。用紫外分光光度儀在490 nm波長下測定吸光度?？瞻讓φ找哉麴s水代替糖溶液,葡聚糖濃度為橫坐標,吸光度值A為縱坐標,繪制標準曲線。準確吸取稀釋梯度為25的黃水0.1 mL,加蒸餾水0.9 mL,6%苯酚1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,同樣用苯酚-硫酸法測定樣品在490 nm波長下的吸光度,根據(jù)標準曲線計算糖含量[17]?？偺呛坑嬎愎?C=N×C1,N為稀釋倍數(shù)250,C1為標準曲線讀數(shù)。

1.2.9 氨基酸含量的測定 分別吸取0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL氨基酸標準液于25 mL的容量瓶,各加4 mL水、磷酸緩沖液0.5 mL和2%茚三酮標準液體0.5 mL,沸水浴煮沸15 min,冷卻后加水定容至25 mL,570 nm下測定吸光光度值。以氨基酸濃度為橫坐標,吸光光度值為縱坐標做標準曲線。吸取稀釋10倍的釀酒黃水1 mL放置于25 mL容量瓶中,按上面操作步驟測其吸光光度值[18]。氨基酸含量計算公式:C=N×C2,其中,N為稀釋倍數(shù)10,C2為標準曲線上讀數(shù)。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每個樣品設三個平行,采用SPSS 20.0和Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA進行鄧肯氏差異分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1黃水成分定性實驗分析

由表2可看出,樣品中含氨基酸,不含多肽、蛋白質和生物堿。這與Tan GX[18]白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中含蛋白質0.08%～0.27%不同,可能由于白酒發(fā)酵的原料、原料配比、原料質量、窖齡、窖池質量等因素的不同所致。

表2 釀酒黃水的定性分析實驗結果Table 2 The qualitative analysis experimental results ofyellow water from wine fermentations

2.2頂空固相微萃取-氣相色譜法測定乙醇含量

圖1為部分濃度測試液體的乙醇色譜圖,圖2為乙醇標準曲線圖,經(jīng)計算樣品中乙醇含量為1.04 mL/100 mL,可知,黃水中所含乙醇含量極低。

圖1 乙醇的色譜圖Fig.1 Chromatograms of ethanol注:曲線1是0.2 g/100 mL乙醇標準品,曲線2是5倍稀釋樣品,曲線3是0.125 g/100 mL乙醇標準品。

圖2 乙醇標準曲線Fig.2 The normal curve of ethanol

2.3釀酒黃水pH的測定及有機酸含量的測定

根據(jù)1.2.5實驗方法測定釀酒黃水的酸堿度可知,其pH為4.34。這與朱開憲[19]白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水pH為3.85～6.71相吻合,同時也提示我們,在進一步研究抑菌成分時是否與此酸度有直接關系。同時,圖3、圖4分別為標準混合酸和釀酒黃水的HPLC圖,可知樣品中主要含草酸,甲酸,乳酸,乙酸和檸檬酸,其乙酸含量最多,為737.58 mg/100 mL,其次為甲酸,其含量為248.73 mg/100 mL。

圖3 標準混合酸的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standard mixed acid

圖4 釀酒黃水的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of yellow water

有機酸濃度(mg/100mL)保留時間(min)草酸31.335.707甲酸248.737.326乳酸32.029.350乙酸737.5810.177檸檬酸12.5013.058

2.4黃水揮發(fā)性成分的測定

圖5為釀酒黃水氣相色譜圖,表4與表5可知樣品中主要揮發(fā)性成分有56種,其中酯類面積百分比為90.38%,酯類物質的大量存在,使得黃水可以作為香味物質應用于食品中,宋柯等人采用黃水提取香味成分應用于香料中[20]。

圖5 釀酒黃水氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of yellowwater from wine fermentation

序號保留時間(min)化合物名稱面積百分比(%)12.577二戊醇0.09923.195丙烯醛0.03833.543二戊酮0.01043.967丙酸乙酯0.62554.3163-甲基-3-庚醇0.02564.548三甲基乙烯0.02775.051丁酸乙酯0.00485.399正戊醇0.01095.9412,3-丁二醇0.004106.653丁酸0.863117.9562-甲基丁酸丁酯0.006128.149異戊酸0.055138.4582-甲基丁酸0.051148.6893,4二甲基戊醇0.514159.418甲基戊基酮0.015169.457苯乙烯0.027179.767戊酸乙酯1.2541810.021戊酸0.0151910.676己酸甲酯0.0162012.302異己酸己酯0.0712112.649庚醇0.0222213.744丁酸丁酯66.012315.866己酸丙酯17.522416.550辛醇0.1252516.930對甲基苯酚抑菌性0.2912617.346己酸丙酯0.3502717.454庚酸乙酯0.7392817.667庚酸0.4262918.241苯乙醇0.044

續(xù)表

表5 釀酒黃水中主要的揮發(fā)性成分(%)Table 5 The main volatile componentsin yellow water from wine fermentation(%)

2.5釀酒黃水小分子糖含量的測定

圖6為葡萄糖標準曲線圖,經(jīng)檢測樣品所含總糖為11.01 mg/mL,這與朱開憲[19]白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中還原糖含量為6～45 mg/mL相吻合。

圖6 葡萄糖標準曲線Fig.6 The normal curve of glucose

2.6釀酒黃水氨基酸含量的測定

圖7為氨基酸標準曲線圖,計算可知,樣品中氨基酸含量為5.11 mg/mL。這與朱開憲[19]白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中總氮含量為2.7～3.5 mg/mL有所不同,但同時猜測,這與發(fā)酵液原料和發(fā)酵液儲存時間等因素有直接的關系,同時氨基酸添加到釀油中可增加其鮮味,作為防腐劑添加到食品中也增加營養(yǎng)價值。

圖7 氨基酸標準曲線Fig.7 Normal curve of ethanol

3 結論

釀酒黃水中成分復雜,其中主要包括糖、蛋白質、氨基酸、有機酸、乙醇、酯等,由于原料等因素不同,成分更是有所差異。本研究綜合分析了釀酒黃水的主要成分,研究得出:釀酒黃水pH為4.34,乙醇含量1.04 mL/100 mL,有機酸主要含草酸、甲酸、乳酸、乙酸和檸檬酸,其中乙酸為737.58 mg/100 mL,其次為甲酸,其含量為248.73 mg/100 mL,為黃水中有機酸的應用提供理論依據(jù),例如食醋的生產(chǎn)、有機酸鈣的生產(chǎn)等;揮發(fā)性成分有56種,其中酯類面積百分比為90.38%,小分子糖含量為11.01 mg/mL,氨基酸含量為5.11 mg/mL,這些有機成分都說明了釀酒黃水有豐富的營養(yǎng)價值,為白酒發(fā)酵副產(chǎn)物的廣泛應用提供了理論依據(jù)。

[1]程偉,吳麗華,徐亞磊,等.濃香型白酒釀造微生物研究進展[J].中國釀造,2014,33(3):1-4.

[2]李付麗,吳鑫穎,王曉丹,等.微生物技術在濃香型白酒增香方面的應用[J].中國釀造,2014,33(1):9-13.

[3]徐傳鴻,余有貴,張文武.黃水的理化分析及其應用研究進展[J].食品安全質量檢測學報,2014(10):90-92.

[4]唐麗云,李國紅,王步利,等.利用黃水酯化液提高濃香型白酒質量[J].食品與發(fā)酵科技,2013,49(3):50-59.

[5]梁俊發(fā),肖全偉,陳代偉,等.基于主成分分析法的品牌白酒中微量元素的分布特征研究[J].食品工業(yè)科技,2014(5):78-81.

[6]陳育新,韓珍,郭慶東.中國白酒中呈香呈味物質研究進展[J].食品研究與開方,2015(1):38-41.

[7]隋明,劉根娣,劉延嶺.四種浸泡石榴籽的白酒中揮發(fā)性成分分析[J].釀酒科技,2016,37(2):41-44.

[8]郝林,孔慶學,方祥.食品微生物學實驗技術[M].中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2016:35-37.

[9]張樺.生物化學實驗指導[M]. 科學出版社,2014:35-37.

[10]錢建業(yè).食品分析[M],中國紡織出版社,2014:87-132.

[11]張紅雨,宋曙輝,周家華,等.紫山藥低醇發(fā)酵飲料中乙醇含量的氣相色譜法測定[J].食品工業(yè)科技,2014(3):78-81.

[12]Serot T,Prost C,Visan L,et al. Identification of the main odor active compounds in musts from French and Romanian hybrids by three olfactometric methods[J]. J Agric Food Chem,2001,49(4):1909-1914.

[13]Majdak A,Herjavec S,Orlic S,et al. Comparison of wine aroma compounds produced by Saccharomyces paradoxus and Saccha-romyces cerevisiae strains[J]. Food Technol Biotech,2002,40(2):103-108.

[14]Ledauphin J,Saint-clair J F,Lablanquie O,et al. Determi-nation of key odorant compounds in freshly distilled Cognac using GC-O,GC-MS,and sensory evaluation[J]. J Agric Food Chem,2004,52(18):5670-5676.

[15]劉倩,申明月,聶少平,等.頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定即時牛肉的揮發(fā)性香氣成分[J].食品科學,2015,30(3):66-71.

[16]Campo E,Ferreira V,Escudero A,et al. Quantitative gas chromatography-olfactometry and chemical quantitative study of the aroma of four Madeira wines[J]. Analytica Chimica Acta,2006,563(1/2):180-187.

[17]Yi LG,Pen XY,Xu DF,et al. Analysis of trace components in yellow water from the production of five-grain Nong-xiang Baijiu(Liquor)and discussion on its application[J]. Liquor-Making Sci Technol,2014(4):83-85.

[18]Tan GX,Li J. Analysis of the compositions of yellow water &research advance in its application[J]. Liquor-Making S&T,2010(10):90-92.

[19]朱開憲,趙金松,胡春玲,等.黃水的預處理及成分測定研究[J].釀酒科技,2016(3):33-35.

[20]宋柯,杜崗,劉念.白酒發(fā)酵副產(chǎn)物丟糟、黃水、底鍋水中提取香味成份在酒用香料中的應用[J].釀酒,2008,31(4):18-20.

Analysisoforganiccomponentsofyellowwaterfromliquorfermentation

SHENGJie1,2,XUYa-chao1,JIHai-yu1,LIUAn-jun1,*

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Department of Food Engineering,Weihai Ocean Vocational College,Weihai 264300,China)

In this study,qualitative and quantitative analysis of main organic components of liquor fermentation were made. Firstly,the indicator was used to detect the presence of proteins or peptides and alkaloids and pH was determined by pH meter. Secondly,the standard curve method was used to determine the content of small molecular sugar and amino acid and the ethanol content was determined by headspace solid phase microextraction gas chromatography. Finally,the classification and content of organic acids were determined by HPLC and solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry was used to analyze the volatile components. Experiments on the analysis of the components of yellow water from liquor fermentation showed that detection of amino acids,peptides,proteins and alkaloids were not detected,pH was 4.34,the content of ethanol was 1.04 mL/100 mL,the content of small molecule sugar was 11.01 mg/mL,the content of amino acid reached up to 5.11 mg/mL,the content of acetic acid was 737.58 mg/100 mL,the content of acetate formic acid was 248.73 mg/100 mL and a total of 56 kinds of volatile components were contained,the percentage of esters accounted for 90.38% of total volatile constituents. The results showed that small molecular sugar,amino acid,ethanol,acetic acid,formic acid and esters as the organic components were contained yellow water from liquor fermentation.

liquor;yellow water from liquor;organic components;qualitative and quantitative analysis

TS201.2

A

1002-0306(2017)19-0231-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.042

2017-03-29

盛杰(1989-),女,碩士研究生,研究方向:功能性食品的研究與開發(fā),E-mail:270450819@qq.com。

*通訊作者:劉安軍(1963-),男,博士,教授,研究方向:功能性食品的研究與開發(fā),E-mail:laj@tust.edu.cn。

省部級農(nóng)業(yè)部項目(201303082-3)。