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(華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

基于RAW264.7細胞模型的不同茶類抗炎功能特性

李曉飛,高雄,林曉蓉,張媛媛,李斌*,陳忠正*

(華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

茶葉根據經典加工工藝不同分為紅茶、綠茶、青(烏龍)茶、白茶、黃茶、黑茶。為探討不同加工工藝形成的不同茶類的抗炎功能特性,本研究以云南大葉種綠茶、紅茶、普洱黑茶、金觀音烏龍茶、福鼎大白白茶、君山銀針黃茶為材料。采用硝普化鈉法和脂多糖誘導 RAW264.7巨噬細胞為體外炎癥模型評價抗炎活性。結果發(fā)現,綠茶、白茶及黃茶對一氧化氮(NO)的清除能力較強,半抑制濃度(IC50)值在99.27～104.83 μg/mL范圍內;在六種茶類中,黃茶對脂多糖誘導RAW264.7細胞產生炎癥反應的抑制作用最強,其抑制NO產生的IC50值為398.13 μg/mL,在濃度為500 μg/mL時,其對腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的抑制率分別為69.25%、87.68%;黃茶可在基因轉錄和翻譯水平上,顯著下調iNOS基因的轉錄和翻譯。相關性分析表明,茶多酚含量與清除NO的IC50值、抑制細胞產生NO的IC50值、TNF-α以及IL-6產生量均呈顯著負相關。表明六種茶類均具有抗炎活性,黃茶對促炎癥因子(NO、TNF-α、IL-6)的抑制效果最佳,可通過下調iNOS基因的轉錄和翻譯水平,減少NO產生,從而發(fā)揮抗炎功效。

六種類茶,RAW264.7細胞,抗炎功效,炎癥介質

在正常人機體內,適當的炎癥有助于清除損傷,促進傷口修復和愈合,但過度的炎癥會釋放大量的炎癥介質,如一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)等。其中,過量的NO會進一步產生活性氮自由基,攻擊DNA、蛋白質等生物大分子,造成細胞和組織損傷;過量的TNF-α、IL-6等促炎癥因子會進一步加劇炎癥反應,造成惡性循環(huán)。持續(xù)的炎癥反應嚴重威脅人體健康,漸進性導致惡性腫瘤、神經退行性疾病等慢性疾病的發(fā)生[1-4]。

茶葉中含有豐富的茶多酚、茶多糖、生物堿、氨基酸等成分[5],賦予茶葉抗氧化、抗炎癥、抗癌、保護神經等功能特性[6]。我國茶樹資源豐富,根據經典制茶工藝,茶葉可分為:綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶、黑茶等六大類,賦予茶葉不同的品質特性。茶葉抗炎活性以綠茶和紅茶研究較多[7-8],也有研究者根據茶葉發(fā)酵程度,比較了綠茶(未發(fā)酵)、烏龍茶(半發(fā)酵)以及紅茶(全發(fā)酵)的抗炎活性[9]。但迄今未見同時比較六種不同茶類抗炎功能特性的研究。

為系統(tǒng)比較六大經典加工茶類的抗炎功能特性,本研究以云南大葉種綠茶、紅茶、普洱黑茶、金觀音烏龍茶、福鼎大白白茶、君山銀針黃茶為材料,沸水浸提、凍干后,測定和比較凍干茶粉中茶多酚、咖啡堿等化學組成,采用硝普化鈉法評價NO清除能力,以脂多糖(LPS)誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7體外炎癥細胞模型評價抗炎活性;以研究發(fā)現抗炎活性最強的黃茶為代表,采用實時熒光定量PCR和蛋白質印跡技術分析其對一氧化氮合成酶(iNOS)基因mRNA轉錄水平和蛋白質表達水平的影響,初步探討其抗炎機制,為系統(tǒng)比較不同茶類的功能特性提供初步的理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

福建福鼎大白白茶、湖南君山銀針黃茶 由北京云開雅集茶文化交流中心提供;金觀音烏龍茶 由廣東懷集高山青農產品有限公司提供;云南大葉種綠茶、紅茶 由廣東省華海糖業(yè)發(fā)展有限公司提供;云南大葉種普洱黑茶 由廣東省茶葉進出口公司提供。小鼠巨噬細胞RAW264.7 購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；色譜純甲酸(96%)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、脂多糖(LPS)、氨基苯磺胺、N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽 美國Sigma公司;無酚紅DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素、杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)、GlutaMAX 美國Life公司;細胞總蛋白抽提試劑盒 上海碧云天生物技術研究所;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、封閉液、化學發(fā)光試劑盒 美國Thermo公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)兔抗小鼠抗體、β-actin兔抗小鼠抗體 美國Cell Signaling Technology公司;咖啡堿(99.9%)、Trizol提取試劑盒、4S Red Plus核酸染色劑、瓊脂糖、第一鏈cDNA合成試劑盒 上海生工生物有限公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜 德國Merk Millipore公司;色譜純甲醇 韓國Honeywell Burdick & Jackson公司;福林酚試劑(2 mol/L) 北京普博欣生物科技有限公司;所有實驗用水均為Milli-Q超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

Centrifuge 5804R冷凍離心機 德國Eppendorf A G公司;ALPHA1-2 LD plus真空冷凍干燥機 德國Christ公司;Milli-Q Integral 3超純水系統(tǒng) 德國Merk Millipore公司;UV-2102C紫外可見分光光度計 上海尤尼科有限公司;Spectra Max Plus酶標儀 美國Molecular Devices公司;HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;Ckx41顯微鏡 日本Olympus公司;Agilent 1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司;PCR反應擴增儀、垂直電泳儀、電轉槽 美國Bio-Rad公司;OmegaLumG自動化學發(fā)光儀 美國Aplegen公司;Stepone plus型熒光定量PCR儀 美國ABI公司。

1.2實驗方法

1.2.1 茶葉水提取物凍干粉的制備 茶葉研磨過20～30目篩,按茶水比1∶25 (w/v)加入沸水,封口,100 ℃沸水浴浸提45 min,每10 min振搖一次,過濾、冷卻后,將濾液置于-40 ℃快速結凍,轉移至冷凍干燥機中凍干成茶粉,-20 ℃保存?zhèn)溆?。凍干茶?超純水溶解后測定化學成分和一氧化氮(NO)自由基清除能力;細胞培養(yǎng)液溶解之進行細胞測定實驗。凍干粉得率計算公式如下:

式(1)

式中:m1為水提取物凍干粉的質量,g;m0為浸提茶湯的茶葉干重,g。

1.2.2 NO自由基清除率測定 參照Tsai等[10]方法,并進行適當修改。將60 μL不同濃度的茶葉水提取物(15.63～250 μg/mL)和60 μL硝普化鈉溶液(10 mmol/L,pH7.4磷酸鹽緩沖液配制)先后加入96孔板并混勻,日光燈下,25 ℃光照150 min后,加入120 μL Griess試劑(60 μL A溶液:2%(w/v)氨基苯磺胺溶于4%磷酸水溶液,60 μL B溶液:0.2%(w/v)N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽溶于水),酶標儀測定542 nm處吸光值。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細胞RAW 264.7復蘇后,培養(yǎng)于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中,每隔2 d繼代一次。培養(yǎng)液組成為88%無酚紅DMEM培養(yǎng)基、10% FBS、1%青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)、1% GlutaMAX(4 mmol/L)。

1.2.4 RAW264.7細胞上清液中NO產生量測定 參照Zhang等[11]方法,接種細胞:RAW264.7細胞按5×105個/mL的濃度接種于96孔板,每孔200 μL,于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;加入樣品:棄去舊培養(yǎng)液,加入100 μL不同濃度的茶葉水提取物(細胞培養(yǎng)液配制)和100 μL終濃度為1 μg/mL的LPS溶液,混勻,繼續(xù)培養(yǎng);NO產生量測定:加入樣品培養(yǎng)24 h后取出96孔板,每孔轉移100 μL細胞培養(yǎng)上清液到新96孔板,向新96孔板加入100 μL Griess試劑,酶標儀測定542 nm處吸光值;細胞存活率測定:將舊96孔板中剩余培養(yǎng)液棄去,每孔加入100 μL MTT溶液(0.05 mg/mL),于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后,棄去MTT溶液,加入200 μL二甲基亞砜,置于搖床上(100 r/min)搖勻15 min,酶標儀測定550 nm處吸光值。NO產生百分比和細胞存活率的計算公式如下:

式(2)

式(3)

式中:A樣品+LPS為樣品和LPS共處理組吸光值;A樣品為樣品單獨處理組吸光值;ALPS為LPS單獨處理組吸光值;A空白為正常培養(yǎng)組吸光值。NO百分比(%)是相對于LPS單獨處理組,即將LPS單獨處理組的NO產生量當作100%;細胞存活率(%)是相對于LPS單獨處理組,即將LPS單獨處理組的細胞存活率當作100%。

1.2.5 TNF-α和IL-6含量測定 接種細胞:同1.2.5,樣品處理組分別加入500 μg/mL茶葉水提取物和終濃度為1 μg/mL的LPS溶液,混勻?？瞻捉M只加細胞培養(yǎng)液,對照組只加LPS溶液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將96孔板1000×g離心20 min,吸取細胞培養(yǎng)上清液,稀釋適當倍數,按照試劑盒說明書檢測上清液中RAW264.7細胞分泌的TNF-α和IL-6含量。

1.2.6 茶葉水提取物凍干粉主要化學成分測定 采用福林酚比色法測定茶多酚含量[12];茚三酮比色法測定游離氨基酸含量[12];硫酸-蒽酮比色法測定可溶性糖含量[13];高效液相色譜(HPLC)法測定咖啡堿含量[14],測得的化學成分含量均換算成占凍干茶粉的百分比。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測iNOS mRNA轉錄水平 參照王佐等[15]的方法,并進行適當修改。接種細胞:RAW264.7細胞按5×105個/mL的濃度接種于直徑70 mm培養(yǎng)皿中,于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;加入樣品:棄去舊培養(yǎng)液,加入不同濃度的黃茶水提取物和終濃度為1 μg/mL的LPS溶液,混勻,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;總RNA提取:棄去舊培養(yǎng)液,用Trizol提取試劑盒提取細胞總RNA,UV-2102C紫外可見分光光度計測定提取RNA的A260及A280值;逆轉錄反應:按試劑盒說明,在PCR管中加入RNA 800 ng和隨機引物p(dN)6(0.2 μg/μL)1 μL,用不含RNA酶的超純水定容至13 μL;70 ℃溫浴5 min,冰浴10 s,短暫離心后加入5×反應緩沖液4 μL、dNTP混合液(10 mmol/L)2 μL、RNA酶抑制劑(20 U/μL)1 μL、AMV反轉錄酶(10 U/μL)2 μL;37 ℃溫浴5 min,42 ℃溫浴60 min,70 ℃溫浴10 min后終止反應,將上述溶液-20 ℃保存;熒光定量PCR檢測:對iNOS、β-actin基因(引物序列見表1)表達進行定量分析,PCR反應體系為2×SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Template(cDNA)7.2 μL、10 μmol/L的FP和RP各0.4 μL,加超純水定容至20 μL;PCR反應條件為95 ℃預變性3 min,隨后95 ℃變性7 s,57 ℃退火延伸10 s,共40個循環(huán)。

表1 目的基因和內參基因PCR引物序列Table 1 The PCR primer sequence oftarget genes and reference gene

1.2.8 蛋白質印跡法檢測蛋白表達量 參照王佐等[15]的方法,并進行適當修改。接種細胞和加入樣品實驗步驟同1.2.7;細胞總蛋白提取:取出培養(yǎng)皿棄去培養(yǎng)基,DPBS洗3遍,刮下細胞并離心收集,加入適量細胞裂解液(含1 mmol/L苯甲基磺酰氟),冰上裂解30 min后,14000×g離心15 min,上清即為抽提到的細胞總蛋白;蛋白濃度定量:將BCA試劑A與B按50∶1的比例混合,配成BCA工作液;取25 μL適當稀釋的樣品到96孔板中,每孔加入200 μL BCA工作液,混勻,37 ℃孵育30 min,酶標儀測定562 nm處吸光值,根據牛血清白蛋白標準曲線計算蛋白濃度;檢測目的蛋白表達:將抽提蛋白與上樣緩沖液按4∶1的體積比混合,沸水浴10 min,冷卻后按等蛋白量(40 μg)進行SDS-PAGE電泳(電壓80 V電泳40 min后換電壓110 v電泳150 min),電泳結束后,將凝膠中的蛋白轉印至PVDF膜上,用TBST溶液洗膜6次(每次5 min),將PVDF膜置于封閉液中室溫封閉1 h后進行一抗(1∶1000)孵育(4 ℃過夜);洗膜后加入TBST溶液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000),室溫孵育1.5 h,洗膜后進行ECL顯影,用化學發(fā)光儀掃描并記錄結果。

1.3數據分析

采用SAS 9.2進行差異顯著性分析;采用ABI 7500 system SDS Software 1.4進行熒光定量PCR數據處理,以β-actin為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算基因轉錄的相對變化;采用FluorChem進行蛋白質條帶光密度值積分,以β-actin為內參蛋白做相對定量分析。實驗結果均以平均值±標準偏差表示(n=3)。

2 結果與分析

2.1不同茶類水提取物對NO自由基的清除作用分析

由圖1可知,六個不同種類茶在15.63～250 μg/mL范圍內,隨著水提取物濃度增大,其對NO的清除效果逐漸增強。這與Tsai等研究綠茶與幾種藥用植物對NO清除作用的實驗結果相類似[10]。經擬合可以計算得NO清除率IC50值(半數抑制濃度),其值越低,NO清除效果越好。由表2可知,不同茶類對NO的清除作用存在一定差異,綠茶、白茶、黃茶對NO的清除作用最強,IC50值在99.27～104.83 μg/mL范圍內,三者無顯著性差異(p>0.05),其次是烏龍茶(120.06 μg/mL)、黑茶(176.04 μg/mL)、紅茶(214.68 μg/mL)。結果表明,不同加工工藝生成的茶類,隨著茶葉發(fā)酵程度加深,NO自由基的清除能力降低。大量研究表明,茶多酚是茶葉中清除自由基的有效成分[16],在加工過程中,六種茶類發(fā)酵程度的差異,使其茶多酚含量發(fā)生變化,進而影響NO自由基清除作用。

圖1 六種茶類水提取物凍干粉對NO清除率的影響Fig.1 NO-scavenging effect ofwater extract of six types of tea

2.2不同茶類水提取物對NO產生的影響

圖2 六種茶類水提取物對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞NO產生量和細胞存活率的影響Fig.2 Effects of water extract of six types of tea on NO production and cell viability in LPS-induced RAW264.7 cells注:無相同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖3同。

由圖2可知,在62.5～1000 μg/mL濃度范圍內,六種茶類水提取物處理RAW264.7細胞24 h后,細胞存活率均在90%以上。在此基礎上,進一步測定六個不同種類茶水提取物對NO產生量的影響,與空白組相比,LPS單獨處理RAW264.7巨噬細胞24 h后,細胞上清液中NO產生量顯著增加(p<0.05),六個不同種類茶水提取物與LPS共培養(yǎng)可顯著抑制NO的產生,隨著處理濃度增加,NO產生量逐漸降低,呈劑量依賴關系。經擬合計算得NO抑制率IC50值,如表2所示,黃茶(398.13 μg/mL)對NO產生的抑制作用最強,綠茶、白茶、烏龍茶次之,IC50值在557.59～584.46 μg/mL范圍內,三者無顯著性差異(p>0.05),紅茶(951.27 μg/mL)最弱。Tsai等對藥用植物和香料研究發(fā)現,抑制LPS誘導RAW264.7細胞產生NO受三個方面的綜合影響:阻斷iNOS蛋白表達;抑制iNOS酶活性;清除NO自由基[10,17]。本研究從表2可知,黃茶與綠茶、白茶清除NO自由基的作用無顯著差異,但抑制NO產生的作用顯著強于二者(p<0.05),其可能在阻斷iNOS蛋白表達或抑制iNOS酶活性方面作用更強。

表2 六種茶類水提取物NO清除率和NO抑制率的IC50值Table 2 The IC50 values of water extract of six types of teafor NO-scavenging and NO-suppressing effect

注:不同茶類上標示無相同字母表示差異顯著(p<0.05)。

表3 六種茶類水提取物凍干粉中主要化學成分的含量(%)Table 3 The percentage of main chemical components in freeze-dried powder of water extract of six types of tea(%)

注:表中數據表示各化學成分含量占茶葉水提取物凍干粉的百分比(%);同一組分上標示無相同字母表示差異顯著(p<0.05)。

表4 六種茶類水提取物中主要理化成分含量與NO清除率IC50值、NO抑制率IC50值、TNF-α及IL-6產生量的相關性分析Table 4 The correlation analysis between main chemical components in tea extract and the IC50 values ofNO-scavenging and NO-suppressing effect,TNF-α and IL-6 production

注:*p<0.05,***p<0.001。

2.3不同茶類水提取物對TNF-α和IL-6釋放的影響

炎癥的病理過程除與NO相關外,巨噬細胞會產生促炎癥因子TNF-α和IL-6,引起T淋巴細胞的增殖和激活,進一步擴大炎癥級聯反應,造成組織損傷[18]。因此,TNF-α和IL-6的釋放也是炎癥發(fā)生的重要標志。從圖3可知,與空白組相比,LPS單獨處理RAW264.7細胞后,細胞上清液中TNF-α和IL-6產生量顯著增加(p<0.05)。與LPS單獨處理組相比,六種茶類水提取物在500 μg/mL濃度時,均能顯著抑制IL-6釋放,而對于TNF-α,綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶可顯著抑制TNF-α釋放,黑茶和紅茶則無抑制作用。其中黃茶對TNF-α和IL-6的抑制效果最強,抑制率分別為69.25%,87.68%。

圖3 六種茶類水提取物對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞產生TNF-α、IL-6的影響Fig.3 Effects of water extract of six types of tea on TNF-αand IL-6 production in LPS-induced RAW 264.7 cells

2.4不同茶類水提取物凍干粉主要化學組成及相關性分析

本研究綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、黑茶、紅茶水提取物凍干粉得率(占茶葉干重百分比)依次為40.8%、39.5%、37.1%、33.6%、29.6%、32.8%,茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖及咖啡堿含量測定結果如表3所示。

從表3可知,本研究六種茶類水提取物的主要理化成分含量存在差異,但均以茶多酚含量最高(19.65%～35.03%),不同茶類茶多酚含量大小依次是:綠茶>黃茶>白茶>烏龍茶>黑茶>紅茶,這既與品種的遺傳基礎有關,也與不同茶類加工過程中多酚類等物質的氧化、水解等生化變化相關。趙洋等[19]連續(xù)兩年分析22個茶樹品種的生化成分,結果發(fā)現茶多酚含量品種間差異顯著。周瑞等[20]研究發(fā)現,茶多酚含量隨著茶葉發(fā)酵程度的加深而減少,主要是由于茶葉在發(fā)酵過程中多酚類物質發(fā)生氧化。綠茶屬于未發(fā)酵茶,烏龍茶屬于半發(fā)酵茶,白茶和黃茶的發(fā)酵程度介于綠茶和烏龍茶之間,黑茶(后發(fā)酵)和紅茶(全發(fā)酵)的發(fā)酵程度大于烏龍茶。游離氨基酸以白茶中的含量最高(13.52%),黑茶最低(2.15%)。六種茶類水提取物可溶性糖含量為5.97%～7.42%,咖啡堿含量為6.02%～10.82%。在理化組分分析基礎上,與六種茶類的抗炎功能活性進行相關性分析。

本研究相關性分析表明,茶多酚含量與清除NO的IC50值、抑制細胞產生NO的IC50值、TNF-α以及IL-6產生量均呈顯著負相關(p<0.001),相關系數分別為-0.9824、-0.8586、-0.8781、-0.8979(表4),表明茶多酚很可能是影響不同茶類發(fā)揮抗炎活性的主要功能性成分。Paquay等研究表明,綠茶和紅茶多酚均可有效清除NO自由基[8]。Lin等研究發(fā)現,綠茶、烏龍茶以及紅茶抑制LPS誘導RAW264.7產生NO是由于多種酚類物質的相互結合,而不僅僅是兒茶素,指出茶多酚可能是抑制NO產生的主要活性成分[9]。Ho等研究表明,龍眼花提取物抑制LPS誘導RAW264.7細胞產生NO是由于多酚類、黃酮類、原花青素類等共同作用的結果,而不僅僅是單一的酚類物質[21]。另外,研究表明,茶多酚[22]、咖啡堿[23]均可在基因轉錄和翻譯水平上,抑制促炎癥因子TNF-α和IL-6的產生,相比于咖啡堿,茶多酚的抑制效果較好[24]。

2.5黃茶水提取物對iNOS基因轉錄和翻譯表達的影響

從上述實驗結果可知,黃茶對NO自由基的清除作用與白茶和綠茶無顯著差異,而在細胞水平上,相比于其他茶類,黃茶的抗炎效果最強,因此,選取黃茶為代表,進一步對RAW264.7細胞中調控NO產生的iNOS基因表達進行分析,結果如圖4、圖5所示。

圖4 黃茶水提取物對LPS誘導RAW264.7細胞表達iNOS mRNA的影響Fig.4 Effect of water extract of yellow tea a on iNOSmRNA expression in LPS-induced RAW264.7 cells注:##(p<0.01)表示與空白組差異顯著;**(p<0.01)表示與LPS誘導組差異顯著。

由圖4、圖5可知,相比于空白組,LPS單獨誘導RAW264.7細胞后,細胞內iNOS mRNA和iNOS蛋白表達量極顯著上調(p<0.01)。在62.5、125、250 μg/mL濃度范圍內,黃茶水提取物處理組iNOS mRNA相對表達量分別為LPS誘導組的21%、19%、11%,即黃茶水提取物處理極顯著下調iNOS mRNA表達(p<0.01);黃茶水提取物處理組iNOS蛋白相對表達量分別為LPS誘導組的73%、48%、32%,即黃茶水提取物處理顯著降低iNOS蛋白表達水平(p<0.05)。核轉錄因子kappaB(NF-κB)是細胞中重要的轉錄調節(jié)因子,在炎癥病理過程,NF-κB信號途徑的激活會誘導產生促炎癥因子,如NO、TNF-α、IL-6等,促炎癥因子又會進一步活化NF-κB,導致惡性循環(huán),從而加劇炎癥反應,因此,大量抗炎藥物以NF-κB為作用靶點[23,25]。研究表明,茶葉中咖啡堿[23]、茶多酚[24]均可通過抑制NF-κB信號途徑的激活,下調RAW264.7細胞內iNOS mRNA和iNOS蛋白表達。以上結果表明,黃茶可通過下調RAW264.7巨噬細胞中iNOS mRNA轉錄水平,從而抑制iNOS蛋白表達,可能主要是黃茶中茶多酚與咖啡堿共同作用的結果。

圖5 黃茶水提取物對LPS誘導RAW264.7細胞表達iNOS蛋白的影響Fig.5 Effect of water extract of yellow tea a on iNOS proteinexpression in LPS-induced RAW264.7 cells注:##(p<0.01)表示與空白組差異顯著;*(p<0.05)和**(p<0.01)表示與LPS誘導組差異顯著。

3 結論

由于品種及制茶工藝不同,六種茶類的化學組成存在差異,但均可有效清除NO自由基,其中綠茶、白茶、黃茶對NO的清除能力較強,IC50值在99.27～104.83 μg/mL范圍內,三者無顯著性差異,其次是烏龍茶、黑茶、紅茶。

相比于其他茶類,黃茶對LPS誘導RAW264.7細胞產生NO、TNF-α以及IL-6的抑制作用最強,NO抑制率IC50值為398.13 μg/mL,處理濃度為500 μg/mL時,黃茶對TNF-α和IL-6的抑制率分別為69.25%,87.68%。

相關性分析結果表明,茶多酚含量與NO自由基清除率IC50值、NO產生抑制率IC50值、TNF-α以及IL-6產生量呈顯著負相關性(p<0.001),表明茶多酚很可能是影響不同茶類發(fā)揮抗炎活性的主要成分。

在LPS誘導RAW264.7細胞模型中,黃茶可在轉錄和翻譯水平通過下調iNOS基因的表達,從而抑制NO的產生。

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Anti-inflammatoryactivitiesofsixtypesofteainLPS-inducedRAW264.7cells

LIXiao-fei,GAOXiong,LINXiao-rong,ZHANGYuan-yuan,LIBin*,CHENZhong-zheng*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

According to the classical processing technology,tea can be categorised into six types:green tea,white tea,yellow tea,oolong tea,puer tea,black tea. This study aimed to investigate anti-inflammatory property of six types of tea,including Yunnan Daye(green tea,black tea,and puer tea),Fuding Dabai(white tea),Junshan Yinzhen(yellow tea),and Jin Guanyin(oolong tea). Nitric oxide(NO)-scavenging assay and LPS-induced RAW264.7 cells model were used to assess the anti-inflammatory activity of water extract of six types of tea. The results showed that,among six types of tea,green,white,and yellow tea displayed stronger NO-scavenging capacity with IC50values ranging from 99.27 to 104.83 μg/mL.Compared with other five types of tea,yellow tea exhibited significant anti-inflammatory activity against LPS-induced RAW264.7 cells. The IC50values of yellow tea for NO-suppressing effect was 398.13 μg/mL,and the inhibition rate for tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6)reached 69.25% and 87.68%,respectively,at a concentration of 500 μg/mL. Compared with LPS-induced group,treatment with water extract of yellow tea significantly down-regulated the expression of iNOS mRNA and decreased iNOS protein level. Correlation analysis showed that the content of tea polyphenols had a significant negative correlation with the IC50values of NO-scavenging and NO-suppressing,TNF-αand IL-6 productions. In conclusion,all six types of tea possessed anti-inflammatory property. Among six types of tea,yellow tea exerted the strongest inhibitory effect on production of pro-inflammatory mediators(NO,TNF-α,and IL-6),and could reduce NO production through down-regulating the expression of iNOS both in transcriptional and translational level.

six types of tea;RAW264.7 cell;anti-inflammatory activity;inflammatory mediators

TS201.1

A

1002-0306(2017)19-0067-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.013

2017-03-29

李曉飛(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品化學與營養(yǎng)，E-mail：15622107307@163.com。

*通訊作者:陳忠正(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：zhongzhengch@scau.edu.cn。

李斌(1960-)，女，博士，教授，研究方向：食品化學與營養(yǎng)，E-mail：bli@scau.edu.cn。

現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-23)；廣東省科技計劃項目(2012A020602040)。