周浩純 顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮*
(中國計量大學生命科學學院,浙江杭州 310018)
·基礎研究·
響應面法優(yōu)化酶促水解藍圓鲹蛋白制備抗凝血肽的研究*
周浩純**顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮***
(中國計量大學生命科學學院,浙江杭州 310018)
以藍圓鲹加工副產物為原料,探究酶促水解制備抗凝血肽的工藝條件。研究結果表明,堿性蛋白酶對藍圓鲹蛋白質的水解效果最好,經單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化后得到堿性蛋白酶酶促水解的最佳條件為:水解pH 7.5,水解溫度44℃,堿性蛋白酶添加量9 500 U/g,水解時間4.2 h,響應面模型預測水解液的相對抗凝血活性值為100 AT-U/mL,3次驗證試驗表明,實際相對抗凝血活性為101 AT-U/mL,水解度為19.55%,與預測值接近。
藍圓鲹;抗凝血肽;酶促水解;加工副產物;響應面法
藍圓鲹(Decapterus maruadsi)屬于大宗低值魚,主要分布在我國南海,數(shù)量較多,是典型的海洋經濟魚類之一。藍圓鲹除鮮食外,主要用于加工制作魚罐頭、魚糜等產品,加工后的副產物富含蛋白質,不易貯藏與運輸,通常用作制備飼料,經濟價值較低。由于藍圓鲹加工副產物富含蛋白質,是制備各種生物活性肽的優(yōu)良原料,如制備抗氧化肽、降血壓肽、礦物元素結合肽。目前,利用藍圓鲹加工副產物制備抗凝血肽的研究尚未見報道。凝血是機體重要的生理防御過程,但在病理條件下可誘發(fā)血栓,繼而導致如肺梗塞、腦血栓、視網膜動靜脈阻塞、心肌梗塞和四肢及周圍血管栓塞等疾病,嚴重危害人類生命健康。目前市面上常見的抗血栓藥主要是化學合成西藥,也有酶制劑,如瑞替普酶等。近年來的研究表明,一些蛋白質水解得到的生物活性肽也具有抗凝血作用,來源包括黃鰭金槍魚蛋白、蛋清粉、蝎子蛋白、蝦虎魚蛋白、紫貽貝蛋白、菲牛蛭蛋白。經研究發(fā)現(xiàn),藍圓鲹加工副產物的酶促水解液具有抗凝血作用,本文主要利用響應面法優(yōu)化酶促水解藍圓鲹加工副產物制備抗凝血肽的工藝條件。
藍圓鲹加工副產物,浙江省溫州洞頭區(qū)水產品市場。
藍圓鲹加工副產物→烘干→去頭→粉碎過篩→異丙醇脫脂2~3次→揮發(fā)有機試劑→烘干→粉碎過篩→低溫密封保存
稱取脫脂后的魚粉于錐形瓶中,加入一定pH的磷酸緩沖液200 mL(胃蛋白酶用KCl緩沖液),搖勻后加入一定量的蛋白酶,在恒溫水浴搖床(150 r/min)中水解一定時間后沸水浴滅酶10 min,待冷卻后離心(10 000 r/min,4℃,10 min),取上清液,保存?zhèn)溆谩?/p>
選用復合蛋白酶(溫度50℃、pH7.5)、堿性蛋白酶(溫度50℃、pH8.5)、風味蛋白酶(溫度50℃、pH7.0)、胰蛋白酶(溫度37℃、pH8.0) 分別對脫脂后的魚粉進行酶促水解,以抗凝血活性、水解度作為指標,篩選出最適的蛋白酶。
單因素試驗:分別以水解溫度(25℃~65℃)、pH值(7.0~9.5)、蛋白酶添加量(8 000 U/g~13 000 U/g,以每g蛋白質所需要的酶添加單位表示)、水解時間(1 h~5 h) 和魚粉添加量(2 g/L~150 g/L) 為單因素進行水解,測定水解液的水解度和相對抗凝血活性。
響應面優(yōu)化:根據(jù)單因素試驗結果,選擇pH、水解溫度、酶添加量、水解時間4個因素進一步優(yōu)化,以單因素試驗中的較佳水平為中心點,運用CCD(Central Composite Design) 進行響應面試驗設計,測定各試驗組的水解液相對抗凝血活性,四因素三水平響應面試驗設計的因素水平編碼值如表1所示。
表1 響應面試驗因素水平編碼表
藍圓鲹魚粉樣品經2.0 mol/L NaOH在80℃條件下回流水解4 h后,以6.0 mol/L HCl調節(jié)pH至中性,以福林酚法測定總蛋白質含量。
根據(jù)參考文獻[19]中方法測定可溶性肽含量。水解度(DH)用公式計算:水解度=(可溶性肽的含量/總蛋白的含量)×100%。
根據(jù)參考文獻[17]中方法測定抗凝血活性,以相對值表示。
重復3次試驗,最終結果顯示為平均值±標準差,統(tǒng)計圖在Origin 8.5軟件下完成。響應面分析在Design Expert 8.0軟件下完成。
以常見的4種商業(yè)化蛋白酶對脫脂后的藍圓鲹加工副產物進行酶促水解,測定其水解度和抗凝血活性,結果如下頁圖1所示。從圖1可以看出,堿性蛋白酶具有更高水解效率,其水解度最高,其次是復合蛋白酶;堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解液具有同等的抗凝血活性,結合水解度,最后選擇堿性蛋白酶為水解酶,研究其最佳水解條件。
圖1 不同蛋白酶水解液的水解度和抗凝血活性的影響
試驗研究了魚粉添加量、堿性蛋白酶添加量、水解溫度、pH和水解時間對藍圓鲹蛋白質酶促水解過程的影響,測定水解液的抗凝血活性和水解度,結果如圖2~6所示。由圖2可知,魚粉添加量與水解液抗凝血活性沒有明顯規(guī)律,當魚粉添加量在5 g/L和20 g/L時抗凝血活性明顯高于其他水平,而水解度隨著魚粉的增加而降低。由圖3可知,水解度隨堿性蛋白酶添加酶量先增加,然后趨于平衡,而抗凝血活性則在酶添加量為9 000 U/g時最高。由圖4可知,水解度在水解時間為40℃時最高,但水解液的抗凝血活性在40℃和50℃時均表現(xiàn)出相對較強。由圖5可知,水解度在pH8.5及以后表現(xiàn)出較高值,這是堿性蛋白酶的特點,但水解液的抗凝血活性卻并未出現(xiàn)有規(guī)律的變化,在pH7.0和pH8.0時表現(xiàn)出較大相對抗凝血活性。從圖6可知,水解時間越長,抗凝血活性越高,但在4 h后有明顯下降,水解度也隨著水解時間增加而增加,但在3 h后逐漸減小。因此,通過單因素試驗確定下一步響應面優(yōu)化水解條件的因素為堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時間和pH,其中心點分別為9 000 U/g、40℃、4 h、和8.0。
圖2 魚粉添加量對藍圓鲹蛋白質水解的影響
圖3 酶添加量對藍圓鲹蛋白質水解的影響
圖4 水解溫度對藍圓鲹蛋白質水解的影響
圖5 pH對藍圓鲹蛋白質水解的影響
圖6 水解時間對藍圓鲹蛋白質水解的影響
表2 響應面試驗結果
以響應面CCD設計,試驗了堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時間和pH對水解液抗凝血活性的影響,共29個試驗,其中中心點5個,按表2順序進行試驗,測定水解液的抗凝血活性,結果如表2所示。利用Design Expert 8.0軟件,以抗凝血活性為響應值,酶添加量、水解溫度、水解時間和pH為變量,進行二次回歸模型分析,得到預測模型公式為:
抗凝血活性=+563.365 23-128.808 89X1+2.321 81X2-0.024 253X3+12.166 67X4-0.355 56X1X2-3.780 09E-017X1X3-2.000 00X1X4+1.15266E-018X2X3-0.333 33X2X4+1.000 00E-003X3X4+9.813 33X12+0.030 288X22+8.533 33E-007X32+2.583 33X42,其中X1為pH,X2為水解溫度(℃),X3為酶添加量(U/g),X4為水解時間 (h)。
對影響水解過程的4個因素進行方差分析,結果如表3所示。
表3 響應面試驗結果的方差分析
由表3可知,4個因素的顯著性影響大小依次為:水解溫度>pH>水解時間>酶添加量。其中水解溫度這一因素表現(xiàn)為極顯著,因此可看出溫度對于水解液抗凝血活性的影響非常大;該模型中只有酶添加量這一個因素為不顯著,分析原因可能是所加的酶量均達到或接近飽和。用Design Expert8.0軟件預測得到的最優(yōu)水解條件為:堿性蛋白酶添加量9 500 U/g,水解溫度44℃,水解時間4.2 h和水解pH7.5,在此條件下進行驗證試驗,測得該條件下藍圓鲹水解液的相對抗凝血活性達100 AT-U/mL,與預測值101 AT-U/mL非常接近。此時,水解液的水解度為19.55%。
藍圓鲹是我國南海經濟魚類之一,加工后的副產物含有大量的蛋白質,是一種較好的蛋白質資源。本文以藍圓鲹加工后的副產物為原料,脫脂后經過酶促水解,制備成具有抗凝血作用的水解液。結果表明,堿性蛋白酶對藍圓鲹蛋白質的水解效果最好,經單因素和響應面試驗優(yōu)化的水解條件為:水解pH 7.5,水解溫度44℃,堿性蛋白酶添加量9 500 U/g,水解時間4.2 h,在此條件下進行水解,相對抗凝血活性可達到100 AT-U/mL,水解度可達19.55%。
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Optimization ofenzymatic hydrolysis of Decapterus maruadsi protein for anticoagulant peptides production by response surface methodology*
ZHOUHaochun**GUHankeSHANDantingSONGLuyaoYUShunjieHUANGGuangrong***
(College oflife sciences,China jilianguniversity,ZhejiangHangzhou 310018,China)
The anticoagulant peptides fromblue scad(Decapterus maruadsi)processingby-products byenzymatic hydrolysis were investigated in this paper.The results showed that alcalase was the best choice for producinganticoagulant peptides fromblue scad processingby-products.The best hydrolysis conditions were optimized bysingle-factor-experiment and response surface methodology(RSM)as following:hydrolysis pH 7.5,hydrolysis temperature of44℃,alcalase addition of 9 500 U/g and hydrolysis time of 4.2 h.The relative anticoagulant activity by the RSMprediction model was 100 AT-U/mL,which was veryclose tothat ofthree verification experiments,101 AT-U/mL,and the degree ofhydrolysis was 19.55%at the best hydrolysis conditions.
Decapterus maruadsi;anticoagulant peptides;enzymatic hydrolysis;processing by-products;response surface methodology
TS254.4
A
1673-6044(2017)03-0052-05
10.3969/j.issn.1673-6044.2017.03.016
國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201610356004)
**周浩純,女,1996年出生,中國計量大學食品質量與安全專業(yè)在讀本科。
*** 黃光榮,通訊作者,E-mail:grhuang@126.com.
2017-04-18