周浩純 顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮*

（中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018）

·基礎研究·

響應面法優(yōu)化酶促水解藍圓鲹蛋白制備抗凝血肽的研究*

周浩純**顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮***

（中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018）

以藍圓鲹加工副產物為原料，探究酶促水解制備抗凝血肽的工藝條件。研究結果表明，堿性蛋白酶對藍圓鲹蛋白質的水解效果最好，經單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化后得到堿性蛋白酶酶促水解的最佳條件為：水解pH 7.5，水解溫度44℃，堿性蛋白酶添加量9 500 U/g，水解時間4.2 h，響應面模型預測水解液的相對抗凝血活性值為100 AT-U/mL，3次驗證試驗表明，實際相對抗凝血活性為101 AT-U/mL，水解度為19.55%，與預測值接近。

藍圓鲹；抗凝血肽；酶促水解；加工副產物；響應面法

藍圓鲹（Decapterus maruadsi）屬于大宗低值魚，主要分布在我國南海，數(shù)量較多，是典型的海洋經濟魚類之一。藍圓鲹除鮮食外，主要用于加工制作魚罐頭、魚糜等產品，加工后的副產物富含蛋白質，不易貯藏與運輸，通常用作制備飼料，經濟價值較低。由于藍圓鲹加工副產物富含蛋白質，是制備各種生物活性肽的優(yōu)良原料，如制備抗氧化肽、降血壓肽、礦物元素結合肽。目前，利用藍圓鲹加工副產物制備抗凝血肽的研究尚未見報道。凝血是機體重要的生理防御過程，但在病理條件下可誘發(fā)血栓，繼而導致如肺梗塞、腦血栓、視網膜動靜脈阻塞、心肌梗塞和四肢及周圍血管栓塞等疾病，嚴重危害人類生命健康。目前市面上常見的抗血栓藥主要是化學合成西藥，也有酶制劑，如瑞替普酶等。近年來的研究表明，一些蛋白質水解得到的生物活性肽也具有抗凝血作用，來源包括黃鰭金槍魚蛋白、蛋清粉、蝎子蛋白、蝦虎魚蛋白、紫貽貝蛋白、菲牛蛭蛋白。經研究發(fā)現(xiàn)，藍圓鲹加工副產物的酶促水解液具有抗凝血作用，本文主要利用響應面法優(yōu)化酶促水解藍圓鲹加工副產物制備抗凝血肽的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藍圓鲹加工副產物，浙江省溫州洞頭區(qū)水產品市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

藍圓鲹加工副產物→烘干→去頭→粉碎過篩→異丙醇脫脂2～3次→揮發(fā)有機試劑→烘干→粉碎過篩→低溫密封保存

1.2.2 酶促水解

稱取脫脂后的魚粉于錐形瓶中，加入一定pH的磷酸緩沖液200 mL（胃蛋白酶用KCl緩沖液），搖勻后加入一定量的蛋白酶，在恒溫水浴搖床（150 r/min）中水解一定時間后沸水浴滅酶10 min，待冷卻后離心（10 000 r/min，4℃，10 min），取上清液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白酶的篩選

選用復合蛋白酶（溫度50℃、pH7.5）、堿性蛋白酶（溫度50℃、pH8.5）、風味蛋白酶（溫度50℃、pH7.0）、胰蛋白酶（溫度37℃、pH8.0） 分別對脫脂后的魚粉進行酶促水解，以抗凝血活性、水解度作為指標，篩選出最適的蛋白酶。

1.2.4 酶促水解條件優(yōu)化

單因素試驗：分別以水解溫度（25℃～65℃）、pH值（7.0～9.5）、蛋白酶添加量（8 000 U/g～13 000 U/g，以每g蛋白質所需要的酶添加單位表示）、水解時間（1 h～5 h） 和魚粉添加量（2 g/L～150 g/L） 為單因素進行水解，測定水解液的水解度和相對抗凝血活性。

響應面優(yōu)化：根據(jù)單因素試驗結果，選擇pH、水解溫度、酶添加量、水解時間4個因素進一步優(yōu)化，以單因素試驗中的較佳水平為中心點，運用CCD（Central Composite Design） 進行響應面試驗設計，測定各試驗組的水解液相對抗凝血活性，四因素三水平響應面試驗設計的因素水平編碼值如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平編碼表

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白質含量的測定

藍圓鲹魚粉樣品經2.0 mol/L NaOH在80℃條件下回流水解4 h后，以6.0 mol/L HCl調節(jié)pH至中性，以福林酚法測定總蛋白質含量。

1.3.2 水解度的測定

根據(jù)參考文獻［19］中方法測定可溶性肽含量。水解度（DH）用公式計算：水解度=（可溶性肽的含量/總蛋白的含量）×100%。

1.3.4 相對抗凝血活性的測定

根據(jù)參考文獻［17］中方法測定抗凝血活性，以相對值表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

重復3次試驗，最終結果顯示為平均值±標準差，統(tǒng)計圖在Origin 8.5軟件下完成。響應面分析在Design Expert 8.0軟件下完成。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

以常見的4種商業(yè)化蛋白酶對脫脂后的藍圓鲹加工副產物進行酶促水解，測定其水解度和抗凝血活性，結果如下頁圖1所示。從圖1可以看出，堿性蛋白酶具有更高水解效率，其水解度最高，其次是復合蛋白酶；堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解液具有同等的抗凝血活性，結合水解度，最后選擇堿性蛋白酶為水解酶，研究其最佳水解條件。

2.2 單因素試驗

圖1 不同蛋白酶水解液的水解度和抗凝血活性的影響

試驗研究了魚粉添加量、堿性蛋白酶添加量、水解溫度、pH和水解時間對藍圓鲹蛋白質酶促水解過程的影響，測定水解液的抗凝血活性和水解度，結果如圖2～6所示。由圖2可知，魚粉添加量與水解液抗凝血活性沒有明顯規(guī)律，當魚粉添加量在5 g/L和20 g/L時抗凝血活性明顯高于其他水平，而水解度隨著魚粉的增加而降低。由圖3可知，水解度隨堿性蛋白酶添加酶量先增加，然后趨于平衡，而抗凝血活性則在酶添加量為9 000 U/g時最高。由圖4可知，水解度在水解時間為40℃時最高，但水解液的抗凝血活性在40℃和50℃時均表現(xiàn)出相對較強。由圖5可知，水解度在pH8.5及以后表現(xiàn)出較高值，這是堿性蛋白酶的特點，但水解液的抗凝血活性卻并未出現(xiàn)有規(guī)律的變化，在pH7.0和pH8.0時表現(xiàn)出較大相對抗凝血活性。從圖6可知，水解時間越長，抗凝血活性越高，但在4 h后有明顯下降，水解度也隨著水解時間增加而增加，但在3 h后逐漸減小。因此，通過單因素試驗確定下一步響應面優(yōu)化水解條件的因素為堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時間和pH，其中心點分別為9 000 U/g、40℃、4 h、和8.0。

圖2 魚粉添加量對藍圓鲹蛋白質水解的影響

圖3 酶添加量對藍圓鲹蛋白質水解的影響

圖4 水解溫度對藍圓鲹蛋白質水解的影響

圖5 pH對藍圓鲹蛋白質水解的影響

2.3 響應面優(yōu)化堿性蛋白酶水解條件

圖6 水解時間對藍圓鲹蛋白質水解的影響

表2 響應面試驗結果

以響應面CCD設計，試驗了堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時間和pH對水解液抗凝血活性的影響，共29個試驗，其中中心點5個，按表2順序進行試驗，測定水解液的抗凝血活性，結果如表2所示。利用Design Expert 8.0軟件，以抗凝血活性為響應值，酶添加量、水解溫度、水解時間和pH為變量，進行二次回歸模型分析，得到預測模型公式為：

抗凝血活性=+563.365 23-128.808 89X1+2.321 81X2-0.024 253X3+12.166 67X4-0.355 56X1X2-3.780 09E-017X1X3-2.000 00X1X4+1.15266E-018X2X3-0.333 33X2X4+1.000 00E-003X3X4+9.813 33X12+0.030 288X22+8.533 33E-007X32+2.583 33X42，其中X1為pH，X2為水解溫度（℃），X3為酶添加量（U/g），X4為水解時間 （h）。

對影響水解過程的4個因素進行方差分析，結果如表3所示。

表3 響應面試驗結果的方差分析

由表3可知，4個因素的顯著性影響大小依次為：水解溫度＞pH＞水解時間＞酶添加量。其中水解溫度這一因素表現(xiàn)為極顯著，因此可看出溫度對于水解液抗凝血活性的影響非常大；該模型中只有酶添加量這一個因素為不顯著，分析原因可能是所加的酶量均達到或接近飽和。用Design Expert8.0軟件預測得到的最優(yōu)水解條件為：堿性蛋白酶添加量9 500 U/g，水解溫度44℃，水解時間4.2 h和水解pH7.5，在此條件下進行驗證試驗，測得該條件下藍圓鲹水解液的相對抗凝血活性達100 AT-U/mL，與預測值101 AT-U/mL非常接近。此時，水解液的水解度為19.55%。

3 結論

藍圓鲹是我國南海經濟魚類之一，加工后的副產物含有大量的蛋白質，是一種較好的蛋白質資源。本文以藍圓鲹加工后的副產物為原料，脫脂后經過酶促水解，制備成具有抗凝血作用的水解液。結果表明，堿性蛋白酶對藍圓鲹蛋白質的水解效果最好，經單因素和響應面試驗優(yōu)化的水解條件為：水解pH 7.5，水解溫度44℃，堿性蛋白酶添加量9 500 U/g，水解時間4.2 h，在此條件下進行水解，相對抗凝血活性可達到100 AT-U/mL，水解度可達19.55%。

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Optimization ofenzymatic hydrolysis of Decapterus maruadsi protein for anticoagulant peptides production by response surface methodology*

ZHOUHaochun**GUHankeSHANDantingSONGLuyaoYUShunjieHUANGGuangrong***
（College oflife sciences，China jilianguniversity，ZhejiangHangzhou 310018，China）

The anticoagulant peptides fromblue scad(Decapterus maruadsi)processingby-products byenzymatic hydrolysis were investigated in this paper.The results showed that alcalase was the best choice for producinganticoagulant peptides fromblue scad processingby-products.The best hydrolysis conditions were optimized bysingle-factor-experiment and response surface methodology(RSM)as following:hydrolysis pH 7.5,hydrolysis temperature of44℃,alcalase addition of 9 500 U/g and hydrolysis time of 4.2 h.The relative anticoagulant activity by the RSMprediction model was 100 AT-U/mL,which was veryclose tothat ofthree verification experiments,101 AT-U/mL,and the degree ofhydrolysis was 19.55%at the best hydrolysis conditions.

Decapterus maruadsi；anticoagulant peptides；enzymatic hydrolysis；processing by-products；response surface methodology

TS254.4

A

1673-6044（2017）03-0052-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.03.016

國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610356004）

**周浩純，女，1996年出生，中國計量大學食品質量與安全專業(yè)在讀本科。

*** 黃光榮，通訊作者，E-mail：grhuang@126.com.

2017-04-18