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        響應(yīng)面法優(yōu)化酶促水解藍(lán)圓鲹蛋白制備抗凝血肽的研究*

        2017-10-18 07:49:57周浩純顧晗可單丹婷宋璐瑤俞舜杰黃光榮
        食品工程 2017年3期
        關(guān)鍵詞:抗凝血副產(chǎn)物魚粉

        周浩純 顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮*

        (中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310018)

        ·基礎(chǔ)研究·

        響應(yīng)面法優(yōu)化酶促水解藍(lán)圓鲹蛋白制備抗凝血肽的研究*

        周浩純**顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮***

        (中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310018)

        以藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物為原料,探究酶促水解制備抗凝血肽的工藝條件。研究結(jié)果表明,堿性蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)的水解效果最好,經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后得到堿性蛋白酶酶促水解的最佳條件為:水解pH 7.5,水解溫度44℃,堿性蛋白酶添加量9 500 U/g,水解時(shí)間4.2 h,響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)水解液的相對(duì)抗凝血活性值為100 AT-U/mL,3次驗(yàn)證試驗(yàn)表明,實(shí)際相對(duì)抗凝血活性為101 AT-U/mL,水解度為19.55%,與預(yù)測(cè)值接近。

        藍(lán)圓鲹;抗凝血肽;酶促水解;加工副產(chǎn)物;響應(yīng)面法

        藍(lán)圓鲹(Decapterus maruadsi)屬于大宗低值魚,主要分布在我國(guó)南海,數(shù)量較多,是典型的海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一。藍(lán)圓鲹除鮮食外,主要用于加工制作魚罐頭、魚糜等產(chǎn)品,加工后的副產(chǎn)物富含蛋白質(zhì),不易貯藏與運(yùn)輸,通常用作制備飼料,經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低。由于藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物富含蛋白質(zhì),是制備各種生物活性肽的優(yōu)良原料,如制備抗氧化肽、降血壓肽、礦物元素結(jié)合肽。目前,利用藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物制備抗凝血肽的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。凝血是機(jī)體重要的生理防御過(guò)程,但在病理?xiàng)l件下可誘發(fā)血栓,繼而導(dǎo)致如肺梗塞、腦血栓、視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞、心肌梗塞和四肢及周圍血管栓塞等疾病,嚴(yán)重危害人類生命健康。目前市面上常見(jiàn)的抗血栓藥主要是化學(xué)合成西藥,也有酶制劑,如瑞替普酶等。近年來(lái)的研究表明,一些蛋白質(zhì)水解得到的生物活性肽也具有抗凝血作用,來(lái)源包括黃鰭金槍魚蛋白、蛋清粉、蝎子蛋白、蝦虎魚蛋白、紫貽貝蛋白、菲牛蛭蛋白。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物的酶促水解液具有抗凝血作用,本文主要利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶促水解藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物制備抗凝血肽的工藝條件。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物,浙江省溫州洞頭區(qū)水產(chǎn)品市場(chǎng)。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 原料預(yù)處理

        藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物→烘干→去頭→粉碎過(guò)篩→異丙醇脫脂2~3次→揮發(fā)有機(jī)試劑→烘干→粉碎過(guò)篩→低溫密封保存

        1.2.2 酶促水解

        稱取脫脂后的魚粉于錐形瓶中,加入一定pH的磷酸緩沖液200 mL(胃蛋白酶用KCl緩沖液),搖勻后加入一定量的蛋白酶,在恒溫水浴搖床(150 r/min)中水解一定時(shí)間后沸水浴滅酶10 min,待冷卻后離心(10 000 r/min,4℃,10 min),取上清液,保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 蛋白酶的篩選

        選用復(fù)合蛋白酶(溫度50℃、pH7.5)、堿性蛋白酶(溫度50℃、pH8.5)、風(fēng)味蛋白酶(溫度50℃、pH7.0)、胰蛋白酶(溫度37℃、pH8.0) 分別對(duì)脫脂后的魚粉進(jìn)行酶促水解,以抗凝血活性、水解度作為指標(biāo),篩選出最適的蛋白酶。

        1.2.4 酶促水解條件優(yōu)化

        單因素試驗(yàn):分別以水解溫度(25℃~65℃)、pH值(7.0~9.5)、蛋白酶添加量(8 000 U/g~13 000 U/g,以每g蛋白質(zhì)所需要的酶添加單位表示)、水解時(shí)間(1 h~5 h) 和魚粉添加量(2 g/L~150 g/L) 為單因素進(jìn)行水解,測(cè)定水解液的水解度和相對(duì)抗凝血活性。

        響應(yīng)面優(yōu)化:根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇pH、水解溫度、酶添加量、水解時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化,以單因素試驗(yàn)中的較佳水平為中心點(diǎn),運(yùn)用CCD(Central Composite Design) 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),測(cè)定各試驗(yàn)組的水解液相對(duì)抗凝血活性,四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平編碼值如表1所示。

        表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表

        1.3 測(cè)定方法

        1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

        藍(lán)圓鲹魚粉樣品經(jīng)2.0 mol/L NaOH在80℃條件下回流水解4 h后,以6.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至中性,以福林酚法測(cè)定總蛋白質(zhì)含量。

        1.3.2 水解度的測(cè)定

        根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]中方法測(cè)定可溶性肽含量。水解度(DH)用公式計(jì)算:水解度=(可溶性肽的含量/總蛋白的含量)×100%。

        1.3.4 相對(duì)抗凝血活性的測(cè)定

        根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]中方法測(cè)定抗凝血活性,以相對(duì)值表示。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        重復(fù)3次試驗(yàn),最終結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,統(tǒng)計(jì)圖在Origin 8.5軟件下完成。響應(yīng)面分析在Design Expert 8.0軟件下完成。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 蛋白酶的篩選

        以常見(jiàn)的4種商業(yè)化蛋白酶對(duì)脫脂后的藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物進(jìn)行酶促水解,測(cè)定其水解度和抗凝血活性,結(jié)果如下頁(yè)圖1所示。從圖1可以看出,堿性蛋白酶具有更高水解效率,其水解度最高,其次是復(fù)合蛋白酶;堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解液具有同等的抗凝血活性,結(jié)合水解度,最后選擇堿性蛋白酶為水解酶,研究其最佳水解條件。

        2.2 單因素試驗(yàn)

        圖1 不同蛋白酶水解液的水解度和抗凝血活性的影響

        試驗(yàn)研究了魚粉添加量、堿性蛋白酶添加量、水解溫度、pH和水解時(shí)間對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)酶促水解過(guò)程的影響,測(cè)定水解液的抗凝血活性和水解度,結(jié)果如圖2~6所示。由圖2可知,魚粉添加量與水解液抗凝血活性沒(méi)有明顯規(guī)律,當(dāng)魚粉添加量在5 g/L和20 g/L時(shí)抗凝血活性明顯高于其他水平,而水解度隨著魚粉的增加而降低。由圖3可知,水解度隨堿性蛋白酶添加酶量先增加,然后趨于平衡,而抗凝血活性則在酶添加量為9 000 U/g時(shí)最高。由圖4可知,水解度在水解時(shí)間為40℃時(shí)最高,但水解液的抗凝血活性在40℃和50℃時(shí)均表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)。由圖5可知,水解度在pH8.5及以后表現(xiàn)出較高值,這是堿性蛋白酶的特點(diǎn),但水解液的抗凝血活性卻并未出現(xiàn)有規(guī)律的變化,在pH7.0和pH8.0時(shí)表現(xiàn)出較大相對(duì)抗凝血活性。從圖6可知,水解時(shí)間越長(zhǎng),抗凝血活性越高,但在4 h后有明顯下降,水解度也隨著水解時(shí)間增加而增加,但在3 h后逐漸減小。因此,通過(guò)單因素試驗(yàn)確定下一步響應(yīng)面優(yōu)化水解條件的因素為堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時(shí)間和pH,其中心點(diǎn)分別為9 000 U/g、40℃、4 h、和8.0。

        圖2 魚粉添加量對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

        圖3 酶添加量對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

        圖4 水解溫度對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

        圖5 pH對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

        2.3 響應(yīng)面優(yōu)化堿性蛋白酶水解條件

        圖6 水解時(shí)間對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

        表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

        以響應(yīng)面CCD設(shè)計(jì),試驗(yàn)了堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時(shí)間和pH對(duì)水解液抗凝血活性的影響,共29個(gè)試驗(yàn),其中中心點(diǎn)5個(gè),按表2順序進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)定水解液的抗凝血活性,結(jié)果如表2所示。利用Design Expert 8.0軟件,以抗凝血活性為響應(yīng)值,酶添加量、水解溫度、水解時(shí)間和pH為變量,進(jìn)行二次回歸模型分析,得到預(yù)測(cè)模型公式為:

        抗凝血活性=+563.365 23-128.808 89X1+2.321 81X2-0.024 253X3+12.166 67X4-0.355 56X1X2-3.780 09E-017X1X3-2.000 00X1X4+1.15266E-018X2X3-0.333 33X2X4+1.000 00E-003X3X4+9.813 33X12+0.030 288X22+8.533 33E-007X32+2.583 33X42,其中X1為pH,X2為水解溫度(℃),X3為酶添加量(U/g),X4為水解時(shí)間 (h)。

        對(duì)影響水解過(guò)程的4個(gè)因素進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表3所示。

        表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

        由表3可知,4個(gè)因素的顯著性影響大小依次為:水解溫度>pH>水解時(shí)間>酶添加量。其中水解溫度這一因素表現(xiàn)為極顯著,因此可看出溫度對(duì)于水解液抗凝血活性的影響非常大;該模型中只有酶添加量這一個(gè)因素為不顯著,分析原因可能是所加的酶量均達(dá)到或接近飽和。用Design Expert8.0軟件預(yù)測(cè)得到的最優(yōu)水解條件為:堿性蛋白酶添加量9 500 U/g,水解溫度44℃,水解時(shí)間4.2 h和水解pH7.5,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得該條件下藍(lán)圓鲹水解液的相對(duì)抗凝血活性達(dá)100 AT-U/mL,與預(yù)測(cè)值101 AT-U/mL非常接近。此時(shí),水解液的水解度為19.55%。

        3 結(jié)論

        藍(lán)圓鲹是我國(guó)南海經(jīng)濟(jì)魚類之一,加工后的副產(chǎn)物含有大量的蛋白質(zhì),是一種較好的蛋白質(zhì)資源。本文以藍(lán)圓鲹加工后的副產(chǎn)物為原料,脫脂后經(jīng)過(guò)酶促水解,制備成具有抗凝血作用的水解液。結(jié)果表明,堿性蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)的水解效果最好,經(jīng)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的水解條件為:水解pH 7.5,水解溫度44℃,堿性蛋白酶添加量9 500 U/g,水解時(shí)間4.2 h,在此條件下進(jìn)行水解,相對(duì)抗凝血活性可達(dá)到100 AT-U/mL,水解度可達(dá)19.55%。

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        Optimization ofenzymatic hydrolysis of Decapterus maruadsi protein for anticoagulant peptides production by response surface methodology*

        ZHOUHaochun**GUHankeSHANDantingSONGLuyaoYUShunjieHUANGGuangrong***
        (College oflife sciences,China jilianguniversity,ZhejiangHangzhou 310018,China)

        The anticoagulant peptides fromblue scad(Decapterus maruadsi)processingby-products byenzymatic hydrolysis were investigated in this paper.The results showed that alcalase was the best choice for producinganticoagulant peptides fromblue scad processingby-products.The best hydrolysis conditions were optimized bysingle-factor-experiment and response surface methodology(RSM)as following:hydrolysis pH 7.5,hydrolysis temperature of44℃,alcalase addition of 9 500 U/g and hydrolysis time of 4.2 h.The relative anticoagulant activity by the RSMprediction model was 100 AT-U/mL,which was veryclose tothat ofthree verification experiments,101 AT-U/mL,and the degree ofhydrolysis was 19.55%at the best hydrolysis conditions.

        Decapterus maruadsi;anticoagulant peptides;enzymatic hydrolysis;processing by-products;response surface methodology

        TS254.4

        A

        1673-6044(2017)03-0052-05

        10.3969/j.issn.1673-6044.2017.03.016

        國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610356004)

        **周浩純,女,1996年出生,中國(guó)計(jì)量大學(xué)食品質(zhì)量與安全專業(yè)在讀本科。

        *** 黃光榮,通訊作者,E-mail:grhuang@126.com.

        2017-04-18

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