蘇 寒，毛 釗，陳 偉，郭 婷，閆 翔

·論 著·

牙齦卟啉單胞菌脂多糖對樹突狀細胞成熟及功能影響的體外研究

蘇 寒1，毛 釗1，陳 偉1，郭 婷1，閆 翔2

目的研究牙齦卟啉單胞菌脂多糖(P. gingivalis-LPS)的刺激對大鼠樹突狀細胞(DCs)成熟及功能的影響，為探索DCs在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供實驗依據(jù)。方法采用流式細胞學(xué)方法檢測P. gingivalis-LPS和大腸桿菌脂多糖(E.coli-LPS)刺激下，CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+和CD11c+CD40+DCs的比率；采用ELISA法檢測DCs分泌白介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)和白介素-13(IL-13)的量。采用CCK8法檢測與上述DCs共培養(yǎng)的CD4+T細胞的增殖；采用ELISA法檢測T細胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-13的量。在上述的培養(yǎng)系統(tǒng)中加入Toll樣受體4(TLR4)抑制劑(polymyxin B, PmB)或TLR2/TLR4抑制劑(oxidation of 1-palmitoyl-2-arachidonyl-sn- glycero-3-phosphorylcholine ,OxPAPC)，觀察TLR抑制劑對上述DCs成熟及功能的影響。結(jié)果P.gingivalis-LPS與E.coli-LPS均能刺激DCs成熟。TLR4抑制劑明顯抑制E.coli-LPS組DCs成熟和抗原提呈功能，對P.gingivalis-LPS組DCs成熟和抗原提呈功能沒有顯著抑制。TLR2/TLR4抑制劑對P.gingivalis-LPS組DCs成熟和抗原提呈功能顯著抑制。P.gingivalis-LPS組DCs分泌IL-12和IFN-γ的量低于E.coli-LPS組(P<0.05)；P.gingivalis-LPS組DCs分泌IL-10 和IL-13的量高于E.coli-LPS組(P<0.05)。與P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS共培養(yǎng)的DCs均能促進CD4+T細胞增殖。與P.gingivalis-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細胞分泌IL-2和IFN-γ的量低于E.coli-LPS組(P<0.05)；其分泌IL-10的量高于E.coli-LPS組(P<0.05)。結(jié)論P.gingivalis-LPS能促進DCs的成熟和抗原提呈功能。P.gingivalis-LPS刺激下的DCs促進Th2型免疫應(yīng)答；E.coli-LPS刺激下的DCs促進Th1型免疫應(yīng)答。P.gingivalis- LPS通過TLR2通路刺激DCs成熟；E.coli-LPS通過TLR4通路刺激DCs成熟。

樹突狀細胞；牙齦卟啉單胞菌脂多糖；大腸桿菌脂多糖；細胞表型；抗原提呈

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展的病原微生物，其致病成分包括脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、莢膜多糖、菌毛蛋白和牙齦素。P.gingivalis-LPS是牙周炎的主要致病因素之一，在牙周炎的病程中可引起不同類型的免疫和炎癥反應(yīng)[1]。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)廣泛分布于組織和器官，是體內(nèi)的專效抗原提呈細胞。未成熟DCs 攝取抗原,成熟DCs向na?ve T淋巴細胞提呈抗原并刺激na?ve T細胞分化為效應(yīng)性T細胞。因此，DCs是先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答之間的重要橋梁[2]。微生物成分對DCs的刺激可上調(diào)DCs表面共刺激分子的表達并促進DCs分泌炎性細胞因子，促使輔助性T細胞(Th細胞)分化為Th1或Th2細胞[3-4]。上述過程始于DCs通過其表面的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別不同的抗原物質(zhì)(包括病原微生物成分)，因此PRRs及它們的配體在DCs成熟和發(fā)揮抗原提呈功能的過程中具有重要作用。目前已知牙周炎的發(fā)病機制為宿主對牙周病原體感染的免疫反應(yīng)，宿主免疫系統(tǒng)在此過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者的牙齦上皮組織中存在著DCs，然而，這些DCs在牙周炎的發(fā)展過程中的確切作用機制還不清楚[5]。本研究擬對P. gingivalis-LPS對SD大鼠骨髓源性DCs成熟及功能的影響進行研究，為探索DCs在牙周炎病程中的可能作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 24只6～8周齡雄性SD大鼠(實驗動物合格證號：SCXK2012-0014)，體重200～220 g，養(yǎng)育在南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心無特定病原體(specific pathogen-free,SPF)環(huán)境中。動物實驗的所有步驟均得到了南京大學(xué)動物使用和保護委員會的批準。

1.1.2實驗試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、熱滅活胎牛血清(FBS)、青鏈霉素 (均購自 HyClone公司)；重組大鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rrGM-CSF)、重組大鼠IL-4(rrIL-4)，IFN-γ、IL-12、IL-2、IL-10、IL-13大鼠ELISA試劑盒(均購自R&D公司)；牙齦卟啉單胞菌脂多糖(P.gingivalis-LPS ,standard LPS from P. gingivalis)、TLR4信號抑制劑—Polymyxin B (PmB)、TLR2/TLR4 信號抑制劑—OxPAPC (均購自Invivogen公司)；大腸桿菌脂多糖(E.coli-LPS,standard LPS from E.coli 0111:B4) (購自Sigma-Aldrich公司)；anti-CD11c-PE,anti-MHCⅡ-APC,anti-CD86-FITC,anti-CD80-APC,anti-CD40-FITC抗大鼠單克隆流式抗體(均購自eBioscience公司)；CD4抗大鼠單克隆抗體磁珠(購自Miltenyi公司)；CCK8試劑盒(購自Dojindo公司)。

1.2 方法1.2.1 細胞培養(yǎng) 從SD大鼠的脛骨、股骨和肱骨新鮮收集全骨髓細胞，將細胞培養(yǎng)于加入了10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，并在其中加入10 ng/mL rrGM-CSF和1 ng/mL rrIL-4以促進DCs的生成。細胞培養(yǎng)于37 ℃飽和濕度、5%CO2的細胞孵育箱內(nèi)，每隔1 d進行半量換液并保持所有的試劑濃度不變，收集懸浮的細胞。 培養(yǎng)6 d后，將收獲的細胞以2×106/孔的密度培養(yǎng)于6孔細胞培養(yǎng)板中。將這些細胞隨機分為7組：對照組、E.coli-LPS組、P.gingivalis-LPS組、E.coli-LPS+PmB組、E.coli-LPS+OxPAPC組、P.gingivalis- LPS+PmB組和P.gingivalis-LPS+OxPAPC組。依據(jù)分組將試劑按以下濃度加入培養(yǎng)基：E.coli-LPS 100 ng/mL；P.gingivalis-LPS 100 ng/mL；PmB 30 μg/mL；OxPAPC 30 μg/mL。其中，PmB和OxPAPC作為TLR抑制劑，均于E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS加入培養(yǎng)基30 min前被添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)48 h后，收集細胞懸浮液和粘附松散的細胞，采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面CD11c的表達，結(jié)果顯示CD11c+細胞比例高于90%，這些細胞可被認為是DCs。

1.2.2細胞表型分析 細胞培養(yǎng)的第8天，收集、計數(shù)并用PBS沖洗各組細胞，將其再懸浮后以5×105/mL轉(zhuǎn)至流式管。根據(jù)制造商的說明書分別將anti-CD11c-PE,anti-MHCⅡ-APC,anti-CD86-FITC,anti-CD80-APC,anti-CD40-FITC抗大鼠單克隆抗體加入流式管，陰性對照管加入同型對照抗體，在4 ℃黑暗環(huán)境中孵育細胞30 min，用PBS沖洗2次使細胞充分懸浮。采用流式細胞儀檢測DCs表面分子的表達，采用flowjo7.6.1軟件處理實驗中獲得的原始數(shù)據(jù)，分析各組雙標CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD40+細胞的百分比。所有檢測均一式3份進行獨立實驗。1.2.3細胞因子檢測 DCs分泌的細胞因子可影響DCs的后續(xù)功能，采用ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)、IL-10和IL-13的含量，以研究E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS刺激DCs分泌細胞因子的能力。細胞培養(yǎng)的第8天，收集各組細胞培養(yǎng)上清液以檢測DCs分泌的細胞因子。采用大鼠IFN-γ、IL-12、IL-10和IL-13 ELISA試劑盒，按照制造商的說明，在酶標儀上采用450 nm波長測量各孔上清液的吸光值(A450)，判定結(jié)果。所有檢測均一式3份進行獨立實驗。

1.2.4混合淋巴細胞反應(yīng) 取SD大鼠脾細胞，按照制造商的說明書，采用CD4+T細胞磁珠分選系統(tǒng)獲取純化的CD4+T細胞。采用PE-CD4抗體經(jīng)流式細胞學(xué)檢測，獲得的CD4+T細胞純度為90%～95%。將前述實驗所獲得的各組DCs與密度為2×106/mL的CD4+T細胞按照1∶10的比例在96孔培養(yǎng)板中共培養(yǎng)。每孔加入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素 和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL，輕吹吸、混勻細胞懸液以保證DCs和T細胞充分有效的接觸。將培養(yǎng)板放置于37 ℃飽和濕度、5% CO2的細胞孵育箱內(nèi)培育72 h。細胞培育結(jié)束前4 h，按照制造商的說明書，在培養(yǎng)板的每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8。孵育4 h后，采用酶標儀測定A450 nm值，以確定T細胞的增殖。測定重復(fù)3次，取其平均值為最終結(jié)果。

如前所述，每一組的DCs均與CD4+T細胞按照1∶10的比例共培養(yǎng)72 h。采用ELISA試劑盒按照制造商的說明測定上清液中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-13 A450 nm值，判定結(jié)果。所有檢測均一式3份進行獨立實驗。

2 結(jié) 果

2.1E.coli-LPS和P. gingivalis-LPS促進DCs表面MHCⅡ、CD80、CD86和CD40分子的表達 各組CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+和CD11c+CD40+DCs比率如圖1～4所示。將結(jié)果以直方圖的形式表示如圖5所示，與對照組相比，相同濃度的P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS(100 ng/mL)均能顯著上調(diào)DCs MHCⅡ、CD80、CD86、CD40的表達水平(P<0.05)。P. gingivalis-LPS和E.coli-LPS組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果表明，P. gingivalis-LPS和E.coli-LPS均能刺激DCs成熟。

圖1 各組 CD11c+MHCⅡ+ DCs流式細胞學(xué)結(jié)果

圖2 各組 CD11c+CD80+ DCs 流式細胞學(xué)結(jié)果

圖3 各組 CD11c+CD86+ DCs 流式細胞學(xué)結(jié)果

圖4 各組 CD11c+CD40+ DCs 流式細胞學(xué)結(jié)果

E.coli-LPS和P. gingivalis-LPS均能促進DCs的成熟；PmB抑制E.coli-LPS的作用；OxPAPC抑制P. gingivalis-LPS的作用；*P<0.05圖5 各組CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+ 和CD11c+CD40+ DCs流式細胞學(xué)結(jié)果直方圖比較

2.2E.coli-LPS和P. gingivalis-LPS通過不同的TLRs通路刺激DCs成熟 E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+OxPAPC 組DCs MHCⅡ、CD80、CD86和 CD40表達均明顯低于E.coli-LPS組(P<0.05)；E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+ OxPAPC 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這些結(jié)果表明，在E.coli-LPS培養(yǎng)系統(tǒng)中加入TLR4抑制劑后，DCs 表達MHCⅡ、CD80、CD86和 CD40能力下降，即TLR4抑制劑可以抑制E.coli-LPS誘導(dǎo)的DCs成熟。P.gingivalis-LPS+PmB組與P.gingivalis-LPS組相比，DCs MHCⅡ、CD80、CD86和CD40表達未見明顯下降(P>0.05)。P.gingivalis-LPS+ OxPAPC 組DCs MHCⅡ、CD80、CD86和CD40表達明顯低于P.gingivalis-LPS組與P.gingivalis-LPS+PmB組(P<0.05)。這些結(jié)果表明，TLR4信號抑制劑不能抑制P.gingivalis-LPS刺激DCs成熟，而TLR2/TLR4信號通路抑制劑可明顯抑制P.gingivalis-LPS刺激DCs成熟。以上結(jié)果表明，E.coli-LPS對DCs的刺激依賴TLR4信號通路而P.gingivalis-LPS對DCs的刺激依賴TLR2信號通路。見圖5。

2.3E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS刺激DCs分泌不同類型的細胞因子 P.gingivalis-LPS組DCs分泌IL-12和IFN-γ的能力低于E.coli-LPS組(P<0.05)，同時，P.gingivalis-LPS組DCs分泌IL-10和IL-13的能力高于E.coli-LPS組(P<0.05)。這些結(jié)果表明，E.coli-LPS刺激下的DCs誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，P.gingivalis-LPS刺激下的DCs誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)。TLR4抑制劑(PmB)和TLR2/TLR4抑制劑(OxPAPC)的加入都可使E.coli-LPS組DCs IL-12、IFN-γ，IL-10和IL-13的分泌明顯降低(P<0.05)；E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+OxPAPC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。P.gingivalis-LPS組加入PmB后，DCs分泌IL-12、IFN-γ，IL-10和IL-13的量未見明顯下降(P>0.05)；P.gingivalis-LPS組加入OxPAPC后，DCs分泌IL-12、IFN-γ，IL-10和IL-13的量均顯著下降(P<0.05)；P.gingivalis-LPS+OxPAPC組這些細胞因子的量也明顯低于P.gingivalis-LPS+PmB組。這些結(jié)果與前述流式細胞學(xué)結(jié)果相一致，即E.coli-LPS通過TLR4信號通路刺激DCs而P.gingivalis-LPS通過TLR2信號通路刺激DCs。見圖6。

E.coli-LPS促進DCs分泌IL-12和IFN-γ, P.gingivalis-LPS促進DCs分泌IL-10和IL-13; PmB抑制E.coli-LPS的作用；OxPAPC抑制P. gingivalis-LPS的作用；*P<0.05圖6 各組DCs分泌的細胞因子結(jié)果比較

2.4E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS刺激后的DCs觸發(fā)不同類型的T細胞反應(yīng) 各組DCs與CD4+T細胞共培養(yǎng)后的CCK8法細胞計數(shù)實驗結(jié)果見圖7。在促進CD4+T細胞增殖方面，E.coli-LPS組DCs和P.gingivalis-LPS組DCs差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。E.coli-LPS+PmB組DCs和E.coli-LPS+OxPAPC組DCs較E.coli-LPS組T細胞增殖均有明顯下降(P<0.05)，E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+OxPAPC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。P.gingivalis-LPS+PmB組DCs刺激T細胞增殖與P.gingivalis-LPS組相較未見明顯下降(P>0.05)。P.gingivalis-LPS+OxPAPC組DCs刺激T細胞增殖較P.gingivalis-LPS組和P.gingivalis-LPS+PmB組可見明顯下降(P<0.05)。

與各組DCs共培養(yǎng)的CD4+T細胞分泌細胞因子的定量分析結(jié)果見圖8。P.gingivalis-LPS組T細胞分泌IL-2和IFN-γ的量低于E.coli-LPS組(P< 0.05)，P. gingivalis-LPS組T細胞分泌IL-10的量高于E. coli-LPS組(P<0.05)，2組T細胞分泌IL-13的量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這些結(jié)果與E.coli-LPS或P. gingivalis-LPS刺激DCs分泌不同類型細胞因子的結(jié)果相一致，說明受E.coli-LPS刺激的DCs具有激發(fā)Th0細胞向Th1細胞轉(zhuǎn)化的趨勢；受P.gingivalis-LPS刺激的DCs具有激發(fā)Th0細胞向Th2細胞轉(zhuǎn)化的能力。與E.coli-LPS+PmB組DCs和E.coli-LPS+OxPAPC組DCs共培養(yǎng)的T細胞分泌的IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-13與E.coli-LPS組相比均明顯下降，E.coli-LPS+PmB組和E.coli-LPS+OxPAPC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與P.gingivalis-LPS+ PmB組DCs共培養(yǎng)的T細胞分泌的IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-13與P.gingivalis-LPS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。P.gingivalis-LPS+OxPAPC組T細胞分泌的IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-13明顯低于P.gingivalis-LPS組和P.gingivalis-LPS+PmB組(P<0.05)。這些結(jié)果與前述結(jié)果相一致，表明E.coli-LPS通過TLR4信號通路刺激DCs而P.gingivalis- LPS通過TLR2信號通路刺激DCs。

1：E.coli-LPS組；2：E.coli-LPS+PmB組；3：E.coli-LPS+OxPAPC組；4：P.gingivalis-LPS組；5：P.gingivalis-LPS+PmB組；6：P.gingivalis-LPS+OxPAPC；7：對照組 E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS均可促進CD4+T細胞增殖；PmB抑制E.coli-LPS的作用；OxPAPC抑制P. gingivalis-LPS的作用；*P<0.05

圖7 CCK-8法檢測各組DCs與CD4+T細胞共培養(yǎng)的T細胞增殖結(jié)果

E.coli-LPS促進與DCs共培養(yǎng)的T細胞分泌IL-2和IFN-γ, P.gingivalis-LPS促進與DCs共培養(yǎng)的T細胞分泌IL-10; PmB抑制E.coli-LPS的作用；OxPAPC抑制P. gingivalis-LPS的作用；*P<0.05

圖8與各組DCs共培養(yǎng)的CD4+T細胞分泌的細胞因子結(jié)果比較

3 討 論

P.gingivalis-LPS是牙周炎的主要致病因素之一，其對于牙周組織細胞的作用一直是研究的熱點[6]。E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS雖然同為LPS，其兩者對于不同細胞系的作用途徑和作用結(jié)果不盡相同。Kirikae等[7]研究表明，P.gingivalis-LPS能夠刺激TLR4缺失的C3H/HeJ小鼠巨噬細胞發(fā)揮抗炎作用。Jones等[8]研究指出，E.coli-LPS刺激大鼠牙齦成纖維細胞分泌更多的IL-6、iNOS和MCP-1而P.gingivalis-LPS刺激大鼠巨噬細胞分泌更多的IL-6、IL-1和MCP-1。Barksby等[9]研究表明，E.coli-LPS通過TLR4通路激活單核細胞而P.gingivalis-LPS通過TLR2通路激活單核細胞。Jotwani等[10]研究指出，P.gingivalis-LPS刺激單核細胞來源DCs成熟需要TLR2和TLR4雙通路。Diya等[11]研究表明，E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS通過不同的信號通路刺激THP-1細胞，TLR2-JNK通路在P.gingivalis-LPS引起的慢性牙周炎病程中起重要作用。Sun等[12]研究指出，P.gingivalis-LPS通過TLR2通路刺激THP-1細胞產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受而E.coli-LPS通過TLR4通路刺激THP-1細胞產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受。這些差異產(chǎn)生的原因可能在于P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS脂質(zhì)A的親水性二磷酸鹽構(gòu)架不同導(dǎo)致P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)有所不同，致使P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS對TLR的親和力產(chǎn)生差異[13]。

有研究證實，健康牙齦、牙齦炎牙齦和牙周炎牙齦的上皮和結(jié)締組織中都存在著朗格漢斯細胞(Langerhans cells,LCs)和DCs[14]。DCs作為先天性免疫和獲得性免疫之間的橋梁在抗微生物感染方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在牙周病的病程中，DCs的分布和表型的變化調(diào)節(jié)著牙周免疫應(yīng)答[15]。P.gingivalis-LPS是公認的牙周主要致病成分，為了研究在牙周病的發(fā)生、發(fā)展過程中，P.gingivalis-LPS和DCs的相互作用，我們進行了本研究。

近期已發(fā)表的研究中，學(xué)者們普遍采用濃度為10～200 ng/mL的LPS以研究其對于不同細胞系的作用[16-17]。本研究中，我們采用100 ng/mL的P.gingivalis-LPS及100 ng/mL的E.coli-LPS在體外與DCs共培養(yǎng)，以評價P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS在促進DCs成熟和發(fā)揮抗原提呈功能方面的作用。

Polymyxin B (PmB)是由類芽孢桿菌polymixa產(chǎn)生的環(huán)狀陽離子抗生素肽，PmB已經(jīng)被證實可阻斷TLR4通路從而抑制LPS的作用[18]。LPS是G-細菌細胞壁的主要成分，脂質(zhì)A是其有效致病成分。陽離子屬性的PmB與陰離子屬性的脂質(zhì)A相結(jié)合，從而抑制LPS生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮[19]。OxPAPC由1-棕櫚酰-2-花生四烯-sn-甘油-3-磷酰膽堿(phosphorylcholine,PAPC)氧化而來，是含有sn-2全長的氧化磷脂及其殘留碎片的混合物。OxPAPC可同時抑制細菌脂肽和LPS的信號通路，已經(jīng)被證實為TLR2和TLR4的抑制劑[20]。細胞上的CD14、LPS結(jié)合蛋白(LPS-binding protein，LBP)和髓樣分化蛋白2(myeloid differential protein 2,MD2)可與細菌脂質(zhì)相結(jié)合，這些蛋白與TLR共同構(gòu)成LPS受體復(fù)合物，被稱為TLR輔助蛋白。OxPAPC通過與這些TLR輔助蛋白相結(jié)合，導(dǎo)致LPS無法與LPS受體復(fù)合物相結(jié)合，從而抑制TLR2和TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。

本研究結(jié)果顯示，在E.coli-LPS培養(yǎng)系中加入PmB后，DCs成熟、分泌細胞因子及其與CD4+T共培養(yǎng)后T細胞增殖、分泌炎癥因子均被明顯抑制，這些結(jié)果表明，對于DCs，E.coli-LPS是其TLR4配體。在P.gingivalis-LPS培養(yǎng)系中加入PmB后，DCs成熟、分泌細胞因子及其與CD4+T共培養(yǎng)后T細胞增殖、分泌炎癥因子均未見明顯下降；而在P.gingivalis-LPS培養(yǎng)系中加入OxPAPC后，DCs成熟、分泌細胞因子及其與CD4+T共培養(yǎng)后T細胞增殖、分泌炎癥因子均被明顯抑制，這些結(jié)果表明，對于DCs，P.gingivalis-LPS是其TLR2配體。

在DCs抗原提呈功能方面，本研究結(jié)果顯示，P.gingivalis-LPS組DCs分泌的IFN-γ和IL-12較E.coli-LPS組少，P.gingivalis-LPS組DCs分泌的IL-10和IL-13較E.coli-LPS組多。其后的混合淋巴細胞反應(yīng)結(jié)果顯示，與P.gingivalis-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細胞分泌IFN-γ和IL-2的量少于與E.coli-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細胞，與P.gingivalis-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細胞分泌IL-10的量多于與E.coli-LPS組DCs共培養(yǎng)的T細胞。這些結(jié)果表明，較之E.coli-LPS，P.gingivalis-LPS刺激下的DCs具有更強的促進Th2型免疫反應(yīng)的能力。

本研究通過體外實驗揭示了P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS在促進DCs成熟和抗原提呈功能方面的不同作用途徑。同時，本研究闡釋了P.gingivalis-LPS刺激下DCs的免疫反應(yīng)，其結(jié)果提示P.gingivalis-LPS刺激導(dǎo)致的DCs成熟和抗原提呈并促進Th2型免疫反應(yīng)可能是牙周炎病程中細胞免疫和體液免疫共同發(fā)生的重要發(fā)病機制。這些實驗結(jié)果有助于進一步闡明DCs在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用機制。

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EffectsofPorphyromonasgingivalis-lipopolysaccharideonthematurationandfunctionsofdendriticcells

SU Han1,MAO Zhao1,CHEN Wei1,GUO Ting1,YAN Xiang2

( 1.DepartmentofStomatology，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，PLA,Nanjing210002，Jiangsu，China; 2.DepartmentofOrthodontics,NanjingStomatologicalHospital,MedicalSchoolofNanjingUniversity,Nanjing210008,Jiangsu，China)

AbstractObjectivedy the roles of P.gingivalis-LPS on the maturation and functions of DCs to provide experimental evidences to explore the possible mechanism of DCs in periodontitis.MethodsFlow cytometry was used to detect CD11c, MHCⅡ, CD80, CD86 and CD40 expression on DCs which were stimulated by P.gingivalis-LPS or E.coli-LPS and ELISA was used to detect IL-12, IFN-γ, IL-10 and IL-13 secreted by DCs. CCK8 was used to assay CD4+T cells proliferation after co-cultured with DCs stimulated by P.gingivalis-LPS or E.coli-LPS and ELISA was used to detect IL-2, IFN-γ, IL-10 and IL-13 secreted by T cells. TLR4 inhibitor (polymyxin B) or TLR2 and TLR4 inhibitor (OxPAPC) was added to P.gingivalis-LPS group and E.coli-LPS group to observe the effects of these two TLR inhibitors on the maturation and antigen-presenting functions of DCs.ResultsThe capacity of P.gingivalis-

LPS to stimulate DCs maturation was similar to that of E.coli-LPS. When TLR4 inhibitor was added to E.coli-LPS group, maturation and antigen-presenting functions of DCs were significantly inhibited. When TLR4 inhibitor was added to P.gingivalis-LPS group, maturation and antigen-presenting functions of DCs were not significantly inhibited. When TLR2 and TLR4 inhibitor was added to P.gingivalis-LPS group,maturation and antigen-presenting functions of DCs were significantly inhibited.The level of IL-12 and IFN-γ secreted by DCs in P.gingivalis-LPS group was significantly lower than that of E.coli-LPS group (P<0.05), meanwhile, IL-10 and IL-13 secreted by DCs in P.gingivalis-LPS group was significantly higher than that of E.coli-LPS group (P<0.05). DCs stimulated by both P.gingivalis-LPS and E.coli-LPS could promote the proliferation of CD4+T cells. The amount of IL-2 and IFN-γ secreted by T cells stimulated by DCs in P.gingivalis-LPS group was significantly lower than that of E.coli-LPS group (P<0.05), meanwhile, IL-10 secreted by T cells stimulated by DCs in P.gingivalis-LPS group was significantly higher than that of E.coli-LPS group (P<0.05).ConclusionP.gingivalis-LPS could promote DCs maturation and antigen-presenting functions. DCs stimulated by P.gingivalis-LPS are prone to induce a stronger Th2 cell responses while DCs stimulated by E.coli-LPS are prone to induce a stronger Th1 cell responses. P.gingivalis-LPS triggers DCs through TLR2 pathway while E.coli-LPS triggers DCs through TLR4 pathway.

Dendritic cells; P.gingivalis-LPS; E.coli-LPS; Phenotype; Antigen-presenting

R780.2

A

1672-271X(2017)05-0465-08

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.05.005

2017-03-12;

2017-08-08)

(本文編輯：葉華珍; 英文編輯：王建東)

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重點項目(zkx15035);南京市第七批科技發(fā)展計劃項目(201507043)

1.210002 南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院口腔科；2.210008 南京，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院正畸科

閆 翔，E-mail: nj12345@126.com

蘇 寒，毛 釗，陳 偉，等.牙齦卟啉單胞菌脂多糖對樹突狀細胞成熟及功能影響的體外研究[J].東南國防醫(yī)藥，2017,19(5):465-472.