徐曉峰,許秀娟,郝 建,吳 升,李樹雯,錢 鈞,常月進(jìn) ,劉 娟,王麗君,姚 遠(yuǎn)
·論 著·
高溫氣體吸入致豚鼠急性肺損傷動(dòng)物模型制備的實(shí)驗(yàn)研究
徐曉峰1,許秀娟1,郝 建1,吳 升1,李樹雯1,錢 鈞1,常月進(jìn)1,劉 娟1,王麗君1,姚 遠(yuǎn)2
目的制備高溫氣體吸入致豚鼠急性肺損傷(ALI)動(dòng)物模型。方法選擇20只雄性豚鼠隨機(jī)分為2組,每組10只,其中健康豚鼠為對(duì)照組、急性肺損傷豚鼠為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組吸入150 ℃高溫氣體制作豚鼠ALI動(dòng)物模型,然后處死2組豚鼠并取豚鼠右肺的大體標(biāo)本,稱重計(jì)算豚鼠肺濕/干重比(W/D),選取2組豚鼠左上肺組織進(jìn)行HE染色,利用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理變化情況,及時(shí)記錄其病理變化的結(jié)果;對(duì)豚鼠動(dòng)脈血液進(jìn)行血?dú)夥治霾⒈容^。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組豚鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的急性炎癥性改變;實(shí)驗(yàn)組豚鼠肺W/D比值顯著高于對(duì)照組[(5.72±0.31)vs(4.88±0.11),P<0.05];實(shí)驗(yàn)組豚鼠pH、PaO2顯著低于對(duì)照組[(7.02±0.12)vs(7.38±0.04),(98.80±62.60)mmHgvs(177.30±24.70)mmHg,P<0.05],而PaCO2顯著高于對(duì)照組[(74.70±23.23)mmHgvs(31.10±8.77)mmHg,P<0.05]。結(jié)論成功制作豚鼠ALI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。該模型達(dá)到ALI要求,仿真性能高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高,為今后研究高溫氣體吸入致ALI的臨床及基礎(chǔ)研究提供了可靠的動(dòng)物模型。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型;急性肺損傷;豚鼠
急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性彌漫性炎癥性肺損傷,如進(jìn)一步惡化,則表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征,引起急性呼吸衰竭。以往研究ALI發(fā)生和發(fā)展的大部分信息是從尸檢肺及肺組織活檢中得到,為進(jìn)一步了解肺損傷階段性的實(shí)況及全景,ALI動(dòng)物模型的研究發(fā)揮了重要作用[1-2]。目前有機(jī)械通氣、脂多糖注射、細(xì)菌感染、高氧、油酸、鹽酸吸入等ALI的造模方法,然而大部分動(dòng)物模型都有其局限性?,F(xiàn)代戰(zhàn)爭常使用火焰噴射器或者各種燃燒物質(zhì)作為武器,導(dǎo)致人體ALI非常常見。本研究制備高溫氣體吸入致豚鼠ALI動(dòng)物模型模擬野戰(zhàn)狀態(tài)火器傷,以期為今后研究高溫氣體吸入致ALI的病理、病理生理、機(jī)制、治療等提供可靠的動(dòng)物模型。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 健康雄性豚鼠20只,體重(203±19)g,購于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(皖)2006-002]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前,在20~29 ℃的室內(nèi)(保持新鮮空氣)適應(yīng)性喂養(yǎng)1~2 d,自由飲食飲水。高溫氣體實(shí)驗(yàn)平臺(tái)由中國科技大學(xué)火災(zāi)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)制作。動(dòng)脈血?dú)夥治鰞x(GEM Premier 3000,凱隆國際實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn))。
1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)P脱b置設(shè)計(jì) 與中國科技大學(xué)火災(zāi)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合研制高溫氣體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P脱b置,見圖1、圖2、圖3。實(shí)驗(yàn)?zāi)P脱b置由三大部組成:第一部分為艙室結(jié)構(gòu)裝置,第二部分為進(jìn)氣口和出氣口裝置,第三部分為實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷撞奎c(diǎn)火啟動(dòng)或關(guān)閉滅火的控制開關(guān)。該調(diào)控實(shí)驗(yàn)?zāi)P脱b置輸入電壓:220~380 V,輸出電流:0~20 A,輸出功率:0~5 kW,調(diào)節(jié)可變的溫度數(shù)值在0~200 ℃范圍。
圖1高溫氣體實(shí)驗(yàn)裝置三維圖
圖2高溫氣體實(shí)驗(yàn)裝置平面圖
圖3高溫氣體實(shí)驗(yàn)裝置正面平面圖
1.3ALI動(dòng)物模型制作 將健康雄性豚鼠20只隨機(jī)分為2組,其中10只健康豚鼠為對(duì)照組、10只急性肺損傷豚鼠為實(shí)驗(yàn)組。將2組稱重并記錄,用400 mg/kg的10%水合氯醛注射液注入實(shí)驗(yàn)豚鼠的腹腔中進(jìn)行麻醉,麻醉完畢后,放置在實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)平臺(tái)中,啟動(dòng)點(diǎn)火,調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)?zāi)P脱b置內(nèi)可變溫度至150 ℃高溫氣體供給豚鼠吸入,整個(gè)ALI的實(shí)驗(yàn)時(shí)間控制在3 min,豚鼠ALI的實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),迅速調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)氣體高溫度至常溫狀態(tài)。
1.4實(shí)驗(yàn)樣品測定 造模成功后觀察豚鼠4 h,用10%水合氯醛對(duì)2組豚鼠進(jìn)行麻醉,打開胸腹腔,經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取4 mL血液進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治觥L崛?組豚鼠的右肺組織,在標(biāo)準(zhǔn)濾紙上吸干表面液體后,稱取濕重,放入鼓風(fēng)恒溫干燥箱100 ℃干燥48 h,待完全干燥后,稱取干重,計(jì)算W/D比值。另取豚鼠左上肺組織,10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片,HE染色行病理組織學(xué)檢查。
2.1病理學(xué)檢查結(jié)果 對(duì)照組顯示正常健康豚鼠的肺解剖組織,實(shí)驗(yàn)組可見肺泡壁斷裂破壞顯著、肺泡腔融合變大,肺間質(zhì)增寬、結(jié)構(gòu)損傷、破壞,肺毛細(xì)胞血管顯明充血、水腫和大量的炎性細(xì)胞浸潤。見圖4。
a:對(duì)照組;b:實(shí)驗(yàn)組
圖4豚鼠肺組織光學(xué)顯微鏡下病理學(xué)變化
2.2W/D和動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果 實(shí)驗(yàn)組豚鼠肺W/D比值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),提示ALI豚鼠肺組織積聚大量的水分,其肺的體積重量明顯增加。2組豚鼠動(dòng)脈血?dú)夥治霰容^,實(shí)驗(yàn)組豚鼠pH、PaO2顯著低于對(duì)照組(P<0.05),而PaCO2顯著高于對(duì)照組(P<0.05),提示高溫對(duì)肺組織破壞比較嚴(yán)重,瞬間引起小氣道的灼傷、肺泡廣泛斷裂、肺間質(zhì)明顯水腫,引起急性的嚴(yán)重氣體交換功能障礙,導(dǎo)致豚鼠出現(xiàn)氧分壓下降明顯并伴有高碳酸血癥。見表1。
組別n濕/干重比pHPaO2(mmHg)PaCO2(mmHg)對(duì)照組10488±011738±00417730±24703110±877實(shí)驗(yàn)組10572±031?702±012?9880±6260?7470±2323?與對(duì)照組比較,?P<005;1mmHg=0133kPa
在現(xiàn)代戰(zhàn)爭中常使用火焰噴射器或者各種原因火災(zāi)燃燒物質(zhì),導(dǎo)致瞬間釋放大量高溫?zé)崮芰?,使周圍環(huán)境空氣溫度迅速上升,當(dāng)人體吸入高溫?zé)崮艿目諝饪稍斐蓺獾罁p傷,導(dǎo)致ALI。本實(shí)驗(yàn)著重模擬火焰噴射器或火災(zāi)引起的高溫氣體給予豚鼠吸入,使用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的裝置制作成ALI動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)消防性能化設(shè)計(jì)指導(dǎo)原則[3],人體對(duì)煙氣層等火災(zāi)環(huán)境的輻射熱的耐受極限為2.5 kW/m2,即相當(dāng)于上部煙氣層的溫度約為180~200 ℃。當(dāng)熱輻射強(qiáng)度<2.5 kW/m2,人的耐受時(shí)間>5 min;當(dāng)熱輻射強(qiáng)度>2.5 kW/m2,人的耐受時(shí)間<30 s。另外,根據(jù)高溫環(huán)境下人員極限忍耐時(shí)間和溫度之間的關(guān)系(Crane公式) 表示為:tc(T)﹦3.28×108/T3.61,其中T為環(huán)境的溫度,單位為攝氏度;tc(T)的單位為min,據(jù)此理論[3],對(duì)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)裝置進(jìn)行研究改良,設(shè)置高溫氣體調(diào)控溫度在150 ℃左右,時(shí)間設(shè)定3 min,制作豚鼠ALI動(dòng)物模型。經(jīng)過本設(shè)計(jì)的設(shè)備裝置實(shí)驗(yàn)研究顯示,可達(dá)到ALI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的要求,仿真性能高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高。
評(píng)價(jià)一個(gè)動(dòng)物模型是否合格主要取決于它是否能較好地模擬該疾病的發(fā)生、發(fā)展過程,包括組織病理學(xué)和生理學(xué)變化。ALI的主要病理學(xué)特征表現(xiàn)為上皮細(xì)胞損傷、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤和滲透性肺水腫的形成[4-5]。實(shí)驗(yàn)設(shè)備裝置能否成功制作出ALI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,取決于肺解剖病理學(xué)結(jié)構(gòu)破壞程度[6-7]、肺水腫[8-9]和是否有呼吸衰竭情況[10-11]。本研究的實(shí)驗(yàn)裝置模擬野戰(zhàn)狀態(tài)火器傷,直接對(duì)細(xì)胞組織產(chǎn)生損害及破壞作用,造成肺泡斷裂破壞、肺毛細(xì)血管明顯充血水腫,肺間質(zhì)組織可見炎性細(xì)胞浸泡等,從圖4病理學(xué)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組豚鼠肺解剖結(jié)構(gòu)與對(duì)照組比較遭受明顯破壞,病理學(xué)檢查可見肺泡壁明顯的斷裂、破壞,肺泡融合變大,肺間質(zhì)增寬、破壞、結(jié)構(gòu)紊亂,肺毛細(xì)胞血管顯明充血、水腫和大量炎性細(xì)胞浸潤。由此證明,上述高溫氣體實(shí)驗(yàn)裝置,啟動(dòng)開關(guān)點(diǎn)火,引發(fā)的高溫氣體致豚鼠吸入后,造成豚鼠發(fā)生ALI,使得肺解剖結(jié)構(gòu)遭受明顯的嚴(yán)重而廣泛破壞,與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[6,10,12-13]。從本研究實(shí)驗(yàn)組豚鼠肺W/D比值明顯比對(duì)照組增加(P<0.05),提示豚鼠伴有ALI后,肺組織間質(zhì)滲出液顯著積聚,引起肺體積增大、重量增加,證明實(shí)驗(yàn)組有明顯的肺水腫,肺水腫引起肺體積重量顯著增加,造成肺組織的順應(yīng)性明顯下降,與劉娟等[14]的報(bào)道一致。ALI早期引起過度換氣,代償中氧分壓并不降低,且因肺組織廣泛破壞而出現(xiàn)PaCO2升高。本研究PaCO2的檢測是在造模4 h后抽取豚鼠動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治觯c對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組動(dòng)脈血?dú)夥治鰌H值、動(dòng)脈血PaO2均顯著下降(均P<0.05),且PaCO2明顯升高(P<0.05),揭示本實(shí)驗(yàn)的火器高溫瞬間對(duì)肺組織破壞比較嚴(yán)重,瞬間引起小氣道灼傷、肺泡廣泛斷裂、肺間質(zhì)明顯水腫,引起急性的嚴(yán)重氣體交換功能障礙,導(dǎo)致豚鼠呈單純性高碳酸血癥合并重度呼吸性酸中毒,與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[14-17]。
綜上所述,應(yīng)用本項(xiàng)目研制的高溫氣體給豚鼠吸入,成功制作出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ALI模型的結(jié)論有:①觀察豚鼠的肺W/D比值明顯增加,提示肺水腫。②測量豚鼠的動(dòng)脈血?dú)怙@示:pH值下降伴PaCO2明顯升高,提示單純性高碳酸血癥導(dǎo)致呼吸性酸中毒。③肺組織解剖結(jié)構(gòu)損傷、破壞,病理學(xué)檢查觀察肺組織體積顯著變大、肺泡斷裂、融合氣腔擴(kuò)大、肺毛細(xì)胞血管顯明充血水腫、大量的炎性細(xì)胞浸潤以及肺間質(zhì)增寬、結(jié)構(gòu)損傷、破壞等變化情況。本研究的難點(diǎn)在模擬火焰噴射器或火災(zāi)引起的ALI動(dòng)物模型的建立。在模擬火器傷的過程中,對(duì)于溫度和爆破時(shí)間的要求都很高,因?yàn)橐坏囟冗^高,時(shí)間過長,會(huì)造成受試豚鼠其他部位的燒傷;而若溫度和時(shí)間不夠,則不能完成模擬ALI的生理病理過程。本研究的高溫氣體實(shí)驗(yàn)裝置,設(shè)計(jì)了計(jì)算機(jī)集成模塊自動(dòng)調(diào)控整個(gè)結(jié)構(gòu)裝置內(nèi)的空間輻射增熱源和可變輸出功率,調(diào)控實(shí)驗(yàn)?zāi)P脱b置內(nèi)的空氣流動(dòng)、溫度的變化,可以調(diào)控高溫氣體溫度、時(shí)間和高溫氣體流動(dòng),模擬火焰噴射器或火災(zāi)引起的高溫氣體給予豚鼠吸入,能很好地制作出ALI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的效果,仿真性能高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高,對(duì)戰(zhàn)爭及突發(fā)公共衛(wèi)生事件中高溫氣體吸入體內(nèi)致ALI的臨床及基礎(chǔ)研究提供了很好的保證。
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Anexperimentalstudyofacutelunginjuryinguineapigsinducedbyhightemperaturegas
XU Xiao-feng1, XU Xiu-juan1, HAO Jian1,WU Sheng1, LI Shu-wen1, QIAN Jun1, CHANG Yue-jin1, LIU Juan1, WANG Li-jun1, YAO Yuan2
(1.CardiopulmonaryRehabilitationMedicineCentre,HangzhouSanatoriumofNanjingMilitaryRegion,Hangzhou310007,Zhejiang,China;2.DepartmentofEmergency,the117thHospitalofPLA,Hangzhou310034,Zhejiang,China)
AbstractObjectiveTo prepare the experimental animal models of acute lung injury (ALI) induced by high temperature gas inhalation in guinea pigs.MethodsTwenty male guinea pigs were randomly divided into 2 groups, each group of 10 guinea pigs. The healthy guinea pigs were set as the control group, and the ALI guinea pigs were set as the experimental group. High temperature gas (150 ℃) was given to the guinea pigs of the experimental group for inhaling 5 minutes to induce the animal model of ALI. Then the two groups of guinea pigs were executed and lung specimens were taken from guinea pigs. Wet/dry weight ratio (W/D) of the right lungs was calculated. Up-left lungs of the two groups were stained with HE, and the pathological changes of lung tissues were observe by optical microscope in the two groups; The blood gas of the guinea pigs arterial blood was also analyzed and compared.ResultsThe pathological structure of lung tissue of the experimental group showed obvious acute inflammatory changes. The lung W/D ratio of guinea pigs inthe experimental group was significantly higher than that in the control group [(5.72±0.31)vs(4.88±0.11),P<0.05]. The pH and PaO2of guinea pigs in the experimental group were significantly lower than those in the control group[(7.02±0.12)vs(7.38±0.04),(98.80±62.60)mmHgvs(177.30±24.70)mmHg,P<0.05], while PaCO2was significantly higher than that in the control group [(74.70±23.23)mmHgvs(31.10±8.77)mmHg,P<0.05].ConclusionThe high temperature gas supplied to guinea pigs designed in this study can successfully establish ALI experimental animal model which meets the requirement of ALI and has high simulation performance, good repeatability, high stability.It provides a reliable animal model for the clinical and basic research of ALI induced by high temperature gas inhalation.
Experimental animal model;Acute lung injury;Guinea pig
R563.8
A
1672-271X(2017)05-0449-04
10.3969/j.issn.1672-271X.2017.05.001
2017-03-22;
2017-07-05)
(本文編輯:葉華珍; 英文編輯:王建東)
全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金(10Z034)
1.310007 杭州, 南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院心肺康復(fù)醫(yī)學(xué)中心;2.310034 杭州, 解放軍第117醫(yī)院急診科
郝 建,E-mail:jianhaol05@163.com
徐曉峰,許秀娟,郝 建,等.高溫氣體吸入致豚鼠急性肺損傷動(dòng)物模型制備的實(shí)驗(yàn)研究[J].東南國防醫(yī)藥,2017,19(5):449-452.