陳進(jìn)軍， 王 元， 趙留杰， 沈錦玉， 房文紅*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001)

磺胺類藥物(Sulfonamides)是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌有抑制作用，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療。由磺胺嘧啶和甲氧芐氨嘧啶組成的復(fù)方磺胺嘧啶粉是我國(guó)國(guó)標(biāo)漁藥，允許在魚(yú)、蝦、蟹等養(yǎng)殖動(dòng)物中應(yīng)用，甲氧芐氨嘧啶與磺胺嘧啶合用，具有增效作用[1]。有關(guān)生物樣品中磺胺嘧啶和甲氧芐啶測(cè)定方法己有報(bào)道，主要集中在雞[2 - 3]、鴕鳥(niǎo)[4]、豬[5]、馬[6]等畜禽，水產(chǎn)品中魚(yú)類[7]也有報(bào)道。Baert等[2]采用波長(zhǎng)270 nm、240 nm分別檢測(cè)磺胺嘧啶、甲氧芐啶，但對(duì)于單波長(zhǎng)檢測(cè)器而言操作繁瑣；也有采用220 nm[4]、272 nm[7]和287 nm[6]紫外單波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)的報(bào)道，但方法應(yīng)用于本試驗(yàn)中，在低濃度時(shí)效果均不佳。

目前我國(guó)尚無(wú)同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中磺胺藥物和甲氧芐啶的方法，本研究?jī)?yōu)化了檢測(cè)波長(zhǎng)和生物樣品提取方法，建立了同時(shí)檢測(cè)青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鰓等組織中磺胺嘧啶和甲氧芐啶的反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，為水產(chǎn)品中磺胺藥物和甲氧芐啶藥殘檢測(cè)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)置

Waters 2695高效液相色譜儀，Aglient Zorbax SB-C18色譜柱(150×4.6 mm,5 μm)，Waters 2487紫外檢測(cè)器；Millipore Milli-Q Advantage超純水儀；Bertin precellys 240均質(zhì)器；Eppendorf微量移液器；Hitachi CF16RⅡ高速冷凍離心機(jī)；亞榮RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Rephile 0.22 μm微孔濾膜。

1.2 試劑和材料

磺胺嘧啶和甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%)購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，磺胺嘧啶和甲氧芐啶原粉(純度≥98.0%)購(gòu)于濰坊三江醫(yī)藥集團(tuán)。甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷均為色譜純，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；乙酸為優(yōu)級(jí)純，乙酸銨為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

擬穴青蟹購(gòu)于上海崇明縣某養(yǎng)殖場(chǎng)，無(wú)磺胺嘧啶和甲氧芐啶使用記錄。暫養(yǎng)于鹽度10、水溫為27 ℃±1 ℃的海水中，保持24 h充氣，期間投喂新鮮螺螄肉，一周后挑選健康、體重140±20 g的青蟹用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 色譜條件

流動(dòng)相為乙腈∶0.01 mol·L-1乙酸銨(pH=3.80)=12∶88(V/V)；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL;流速為1.0 mL·min-1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。

1.4 樣品前處理

1.4.1血淋巴樣品取出樣品置室溫融解后，10 000 r·min-1離心5 min，取0.4 mL上清液于2 mL離心管中，加入3倍體積乙腈，渦旋振蕩2 min后，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中,氮吹干后加入0.4 mL流動(dòng)相定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液用于RP-HPLC分析。

1.4.2肌肉、肝胰腺和鰓樣品樣品室溫解凍后，取適量樣品于均質(zhì)器中均質(zhì)。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后樣品1.00 g于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈，振蕩5 min，于10 000 r·min-1離心5 min，收集上清液；殘?jiān)僦貜?fù)提取兩次，合并三次上清液于100 mL具塞茄形蒸發(fā)瓶中，于溫度40 ℃旋蒸至干。加入1 mL流動(dòng)相和1 mL正己烷，蓋上塞子置超聲波清洗儀超聲15 min，瓶底殘留物完全溶解，將混合液體轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，12 000 r·min-1離心5 min，吸取下層液體，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液用于RP-HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的比較對(duì)磺胺嘧啶和甲氧芐啶母液進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，為了兼顧兩種藥物同時(shí)檢測(cè)，結(jié)合文獻(xiàn)，選定220 nm[4]、245 nm、270 nm[3]三組檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，每組3個(gè)平行。結(jié)果表明:波長(zhǎng)220 nm下，兩種藥物在低濃度時(shí)，基線噪音及雜質(zhì)峰的響應(yīng)值偏高，與藥峰分離度不佳；270 nm雖是磺胺嘧啶的最大吸收波長(zhǎng)，但不適用于甲氧芐啶，峰高和峰面積都偏低；245 nm下峰形和靈敏度良好，滿足兩種藥物同時(shí)檢測(cè)的需求。

2.1.2提取液的選擇采用加標(biāo)法比較了不同提取液提取肌肉中磺胺嘧啶和甲氧芐啶的回收率,見(jiàn)表1。4種提取液分別為乙腈[2,11]、甲醇[8]、乙酸乙酯[9]和二氯甲烷[10]。從回收率來(lái)看，不同提取液對(duì)肌肉提取效果不同，乙腈提取效果最好，其次為甲醇，再次為乙酸乙酯，二氯甲烷最差。二氯甲烷加入后，肌肉成團(tuán)且有油脂性物質(zhì)浮于試液之上，不利于操作；乙腈萃取樣品貼壁及沉淀蛋白效果良好，回收率高，最終選擇乙腈作提取劑。

表1 不同提取液下肌肉中添加磺胺嘧啶、甲氧芐啶的回收率(n=3)

2.2 色譜行為圖

圖1 青蟹組織樣品中磺胺嘧啶和甲氧芐啶的色譜圖Fig.1 Chromatograms of sulfadiazine and trimethoprim in Scylla Paramamosain tissues hemolymph at 4 h after dosing

青蟹組織樣品血淋巴的色譜行為見(jiàn)圖1(其余圖略)。本實(shí)驗(yàn)中，血淋巴和肌肉最終選用的是乙腈∶0.01 mol·L-1乙酸銨(pH=3.80)=12∶88(V/V)作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示雖然藥峰稍有拖尾，但峰形尖銳對(duì)稱，基線平穩(wěn)且無(wú)雜峰干擾。因肝胰腺和鰓樣品中內(nèi)源性干擾，為更好將藥峰與雜峰分開(kāi)，將流動(dòng)相比例調(diào)至乙腈∶0.01 mol·L-1乙酸銨=13∶87(V/V)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限

應(yīng)用優(yōu)化的檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相，建立磺胺嘧啶和甲氧芐啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；前粪奏ぴ?.05～10 μg·mL-1范圍內(nèi)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=7133.53x+129.61(R2=0.9999)；甲氧芐啶在0.05～10 μg·mL-1范圍內(nèi)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=5089.39x+61.12(R2=0.9999)。磺胺嘧啶在青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鰓加標(biāo)后定量限分別為0.05 μg·mL-1、0.05 μg·g-1、0.05 μg·g-1和0.05 μg·g-1；甲氧芐啶在青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鰓加標(biāo)后定量限分別為0.05 μg·mL-1、0.05 μg·g-1、0.05 μg·g-1和0.05 μg·g-1。

2.4 回收率及精密度

采用加標(biāo)法測(cè)定青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鰓中磺胺嘧啶和甲氧芐啶回收率，每個(gè)濃度3個(gè)平行，按“樣品前處理”方法處理，采用RP-HPLC法測(cè)得其藥物濃度。同時(shí)，采用加標(biāo)法測(cè)定方法學(xué)的日內(nèi)精密度和日間精密度(精密度由變異系數(shù)表示)。

加標(biāo)法測(cè)得各組織回收率結(jié)果如表2所示，可以看出，各組織的藥品回收率都較高，均在80%以上；通過(guò)精密度試驗(yàn)，得出青蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和鰓中磺胺嘧啶的日內(nèi)精密度分別為：1.77%、2.19%、2.53%和2.08%，日間精密度分別為：2.84%、2.27%、3.30%和2.96%；甲氧芐啶的日內(nèi)精密度分別為：4.09%、2.10%、1.75%和2.49%，日間精密度分別為：4.82%、1.95%、2.37%和3.10%。

表2 磺胺嘧啶和甲氧芐啶在青蟹組織樣品中的回收率(n=3)

3 結(jié)論

本文在比較檢測(cè)波長(zhǎng)和提取方法的基礎(chǔ)上，建立了同時(shí)檢測(cè)青蟹組織樣品中磺胺嘧啶和甲氧芐啶殘留的反相高效液相色譜法。在245 nm紫外波長(zhǎng)下檢測(cè)藥物，以乙腈為提取劑，方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)雜峰干擾，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性高，滿足藥物殘留檢測(cè)要求。