黃海蘭, 王 鑫, 法 蕓, 張經(jīng)華, 王宗花
(1.青島大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266071;2.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所,生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266101;3.北京市理化分析測(cè)試中心,北京 100049)
微生物培養(yǎng)液成分中含有大量陰、陽(yáng)離子用于其自身生長(zhǎng)需要,有機(jī)酸、核苷酸等則主要是通過(guò)微生物新陳代謝產(chǎn)生。如藍(lán)藻和熱纖梭菌在厭氧條件下,主要產(chǎn)生乙酸和乳酸等小分子有機(jī)酸[1],在不同的生長(zhǎng)時(shí)間下有機(jī)酸的分泌量是不同的,因此通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間段發(fā)酵液中有機(jī)酸含量則能為研究熱纖梭菌的新陳代謝途徑提供必要的數(shù)據(jù)支持。 有機(jī)酸也參與生物催化過(guò)程[2],是三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物。
目前檢測(cè)有機(jī)酸含量的方法有很多種。其中,利用非酶光譜檢測(cè)[3]和酶法檢測(cè)法[4]檢測(cè)有機(jī)酸含量,此類方法的缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、外界環(huán)境影響大。目前應(yīng)用最廣泛的是色譜和電泳的方法來(lái)同時(shí)檢測(cè)和分析有機(jī)酸[5 - 7],這些方法包括薄層色譜法[6]、反相高效液相色譜法[8 - 9]、氣相色譜法[10 - 11]和毛細(xì)管電泳法[12 - 14]。盡管薄層色譜法具有快速和低成本的特點(diǎn),但是低分離度成了它的致命缺陷;高效液相色譜法具有好的選擇性和高的靈敏度,不過(guò)需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程[8];氣相色譜能夠檢測(cè)有機(jī)酸含量,不過(guò)由于儀器的成本和復(fù)雜性以及樣品前處理的繁瑣,限制了其大批量的檢測(cè)分析[15];毛細(xì)管電泳具有分辨率高、操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、分析時(shí)間短、消耗試劑和樣品少等特點(diǎn),但是重復(fù)性差,影響了其準(zhǔn)確定量[6,15]。除此之外,上述方法大部分需要有機(jī)溶劑和試劑,會(huì)對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員造成一定的危害[16]。因此需要一種前處理簡(jiǎn)單、環(huán)境友好型的檢測(cè)有機(jī)酸的分析方法。
由于有機(jī)酸能夠部分電離,可以運(yùn)用高靈敏度和選擇性的離子色譜法進(jìn)行分析檢測(cè)。本文探索性地將17種有機(jī)酸和7種陰離子高效分離,并成功分析5種藍(lán)藻培養(yǎng)液中的部分有機(jī)酸和陰離子,該方法實(shí)現(xiàn)了微生物培養(yǎng)液中有機(jī)酸和陰離子的同時(shí)測(cè)定,避免了有機(jī)酸和陰離子的分別檢測(cè),節(jié)省了分析時(shí)間和實(shí)驗(yàn)成本。
ICS-5000型多功能離子色譜系統(tǒng)(美國(guó),Thermo Scientific公司),包括雙泵(DP)模塊、電導(dǎo)檢測(cè)器(CD)/色譜(DC)模塊、自動(dòng)進(jìn)樣器(AS)模塊、Chromeleon 6.8色譜軟件操作;Milli-Q?Advantage A10 超純水制備儀。
色譜柱型號(hào):保護(hù)住AG11-HC(50×4 mm) + 分析柱AS11-HC(250×4 mm) (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);檢測(cè)器:電導(dǎo)檢測(cè)器(CD);流動(dòng)相:KOH溶液;流速:1.0 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?~15.0 min:0.8 mmol/L KOH溶液;15.1~25.0 min:15.0 mmol/L KOH溶液;25.1~31.0 min:20.0 mmol/L KOH溶液;31.1~45.0 min:22.4 mmol/L KOH溶液;45.1~55.0 min:40.0 mmol/L KOH溶液;55.1~60.0 min:45.0 mmol/L KOH溶液;60.1~65.0 min:0.8 mmol/L KOH溶液。柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:25 μL。
藍(lán)藻培養(yǎng)液樣品來(lái)自生物能源與過(guò)程研究所的微生物資源團(tuán)隊(duì),取培養(yǎng)液10 mL于離心管中,用6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心3 min。取上清液過(guò)0.22 μm 水相濾膜,過(guò)濾掉溶液中懸浮物后,再經(jīng)過(guò)IC-RP小柱除去基體中的色素和有機(jī)物等雜質(zhì),將處理后的樣品溶液稀釋相應(yīng)倍數(shù)后,進(jìn)樣分析。
IC-RP小柱在使用前應(yīng)先活化:先用注射器取10 mL甲醇慢速?zèng)_洗,再取20 mL 超純水將小柱沖凈,豎直靜置20 min后方可使用。應(yīng)注意的是使用此活化后小柱時(shí),前3 mL樣品應(yīng)棄去不用。
圖1 不同陰離子色譜柱譜圖對(duì)比情況Fig.1 Chromatogram of different anion chromatographic column
用不同型號(hào)陰離子色譜柱AS-9、AS-11、AS-15、AS-16對(duì)4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)樣品在初始分析條件淋洗液程序1 (0~20 min:1.0 mmol/L、20.1~30.0 min:20 mmol/L、30.1~50.0 min:45 mmol/L、50.0~65.0 min:1.0 mmol/L,流速都為1.0 mL/min)下進(jìn)行分析比較,標(biāo)樣譜圖如圖1。通過(guò)比較可以看出:AS-11出峰數(shù)、峰高、峰面積都要優(yōu)于其他三根陰離子柱。具體來(lái)說(shuō)與AS-11陰離子柱相比,AS-9陰離子柱對(duì)24種標(biāo)準(zhǔn)品中組分的9種有分離作用,而AS-15 和AS-16兩陰離子柱分離效果相似,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)和AS-11接近,但是其響應(yīng)值要遠(yuǎn)低于AS-11。
從柱填料基質(zhì)材料來(lái)看,四種分離柱都是大孔的乙基乙烯基苯-二乙烯基苯(EVB-DVB)聚合物,但是選擇性和分離效果主要看鍵合到乳膠微粒上的功能基類型和柱容量決定的。而AS-9、AS-11分析柱乳膠微球的功能基是中等疏水性的三元胺(叔胺),AS-15、AS-16分析柱乳膠微球的功能基則是弱疏水性的四元胺(季胺)。因此從圖1也可看出前者要比后者的兩分析柱分析的物質(zhì)更多、響應(yīng)值也高。再比較AS-9、AS-11兩分析柱的柱容量分別為190 μmol和290 μmol,所以AS-11分析柱分離效果要更好一些,符合圖1的分離情況。
因此綜合分離效果、選擇AS-11陰離子柱作為分離分析陰離子和有機(jī)酸混標(biāo)及樣品的色譜柱。
圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of a standard solutionChromatographic peak:1.Quinic acid;2.F-;3.Acetic acid;4.Propionic acid;5.Formic acid;6.Butanoic acid;7.Pyruvic acid;8.N-pentanoic acid;13.Succinic acid;14. acid;18.Fumaric acid;21.Citric acid;22.Isocitric acid;23.Cis.Aconitic acid;24.Trans-Aconitic acid.
盡管選擇了色譜柱AS-11作為分析柱,由圖1可以看出在10 min、35 min左右時(shí)色譜峰仍有峰重疊情況??梢缘贸鲋俺踉O(shè)的程序跨度有些大,在20 min之前和20~40 min之間個(gè)別峰分離不理想,因此將20 min之前的程序分段設(shè)置,同時(shí)將20~40 min之間的淋洗液濃度上升幅度減小,目的是把出峰時(shí)間相似的物質(zhì)盡可能分開(kāi),另外延長(zhǎng)65 min以后的淋洗液看是否還有其他峰出現(xiàn)。
考慮到實(shí)驗(yàn)效率和更好地分離效果,最后得到優(yōu)化程序見(jiàn)1.2。同樣利用AS-11陰離子色譜柱對(duì)4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析,按照程序1.2節(jié)程序分離效果和實(shí)驗(yàn)效率達(dá)到了比較好的預(yù)期。
將混標(biāo)按照1.3配制方法,再分別取1 mL 混標(biāo)按照1.2分析條件進(jìn)行色譜分析;另外取4號(hào)混標(biāo)1.5 mL 重復(fù)進(jìn)樣8次,檢測(cè)其重復(fù)性。 4號(hào)混標(biāo)的離子色譜圖如圖2所示,從標(biāo)準(zhǔn)譜圖上可以看出,在此分析條件下,17種有機(jī)酸和7種陰離子分離情況良好,在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性相關(guān),且線性相關(guān)系數(shù)在99.6%以上。重復(fù)進(jìn)樣8次的24種物質(zhì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.31%~2.07%之間,說(shuō)明其穩(wěn)定性良好。
表1 混標(biāo)的線性回歸方程、線性范圍、重復(fù)性、檢測(cè)限(n=8)
圖3 藍(lán)藻培養(yǎng)液色譜圖Fig.3 Chromatogram of cyanobacteria cultureChromatographic peak:1.F-;2.Formic acid;9.Cis-Aconitic acid.
將藍(lán)藻培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)1.4步驟處理后,分別再將其稀釋400倍后進(jìn)樣分析。此外按照相同的處理方法對(duì)每份樣品加標(biāo)1.0 mg/L、10 mg/L后,每組平行進(jìn)樣3次。
圖3是將藍(lán)藻培養(yǎng)液樣品色譜圖,檢測(cè)結(jié)果和加標(biāo)回收率如表2所示,24種分析物的平均加標(biāo)回收率在80.3%~108.5%之間。該方法可用于微生物培養(yǎng)液中有機(jī)酸和陰離子的同時(shí)測(cè)定。
該方法實(shí)現(xiàn)了微生物培養(yǎng)液中有機(jī)酸和陰離子的同時(shí)測(cè)定,避免了有機(jī)酸和陰離子的分別檢測(cè),節(jié)省了分析時(shí)間和實(shí)驗(yàn)成本。利用此方法可以測(cè)定不同類型的微生物培養(yǎng)液,對(duì)于研究相應(yīng)微生物中能量轉(zhuǎn)移、物料吸收和代謝物排泄與生存環(huán)境中陰離子的關(guān)系提供幫助,也對(duì)研究有機(jī)酸的代謝產(chǎn)物提供數(shù)據(jù)支持。