蔣 磊

（遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)管理站，沈陽 110032）

α1-酸性糖蛋白與奶牛隱性乳房炎的相關(guān)性分析

蔣 磊

（遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)管理站，沈陽 110032）

為了分析奶牛隱性乳房炎的不同發(fā)病階段與乳清中α1-酸性糖蛋白含量變化之間的關(guān)系，本試驗(yàn)選取10頭健康奶牛和30頭不同發(fā)病程度（輕、中、重）隱性乳房炎患牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，采用α1-酸性糖蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組乳清樣品中α1-酸性糖蛋白的含量，對(duì)α1-酸性糖蛋白與奶牛隱性乳房炎的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，隱性乳房炎組奶牛乳清中α1-酸性糖蛋白的含量顯著或極顯著高于健康組奶牛（P＜0．01或P＜0．05），且隨著奶牛隱性乳房炎病情的加重及乳中體細(xì)胞數(shù)的增加，乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈現(xiàn)出遞增趨勢(shì)。研究結(jié)果提示，乳清中α1-酸性糖蛋白的含量變化與奶牛隱性乳房炎的發(fā)病程度具有一定的相關(guān)性，乳腺炎癥引發(fā)的乳腺損傷及乳中體細(xì)胞數(shù)增加與乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈正相關(guān)。

奶牛；隱性乳房炎；乳清；α1-酸性糖蛋白

我國約70%的奶牛乳房炎為隱性乳房炎，主要是由物理、化學(xué)或微生物感染等多種病因引起的乳房炎癥，雖然患牛的乳腺組織發(fā)生了病理學(xué)變化，乳汁理化性質(zhì)也發(fā)生了改變，但用手觸診乳腺或肉眼檢查乳汁時(shí)則難以發(fā)現(xiàn)異常[1]。隱性乳房炎是奶牛最多發(fā)、最常見、造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重的頑固性疾病之一，不但影響奶牛的產(chǎn)奶量及奶品質(zhì)，而且還增加乳汁攜帶病原微生物的危險(xiǎn)性，危害人類健康[2]。隨著我國奶牛業(yè)及乳品工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，奶牛隱性乳房炎的診斷與治療也得到了人們的高度重視。

α1-酸性糖蛋白（α1-Acid glycoprotein，α1-AGP）又稱類黏蛋白，主要由肝臟合成。α1-AGP的肽鏈結(jié)構(gòu)與結(jié)合珠蛋白α鏈結(jié)構(gòu)類似，是目前研究最廣泛的血清急性期蛋白之一[3]。α1-AGP的表達(dá)受到多種細(xì)胞因子、激素等的調(diào)控，在各種炎癥、組織損傷、腫瘤等一系列疾病發(fā)生時(shí)，其漿液中含量升高，尤其在微生物感染引起的炎癥中α1-AGP表達(dá)量的變化更為明顯,常被作為炎癥發(fā)生時(shí)的判斷指標(biāo)[4]。Bian等[5]在奶牛隱性乳房炎乳清蛋白質(zhì)組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)隱性乳房炎發(fā)生時(shí)乳清中α1-酸性糖蛋白的含量顯著升高，此研究為尋找隱性乳房炎新的分子診斷標(biāo)志物奠定了理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)擬研究乳清中α1-AGP的含量與奶牛隱性乳房炎不同發(fā)病階段之間的關(guān)系，旨在為隱性乳房炎快速診斷試劑盒的研發(fā)提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)動(dòng)物

在遼寧沈陽某奶牛場(chǎng)選擇正常泌乳且無臨床型乳房炎癥狀的奶牛，采用乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)（SCC）與加州乳房炎檢測(cè)法（CMT）進(jìn)行健康奶牛和隱性乳房炎患牛的鑒定與篩選。SCC＜10萬個(gè)/mL且CMT結(jié)果為陰性的奶牛為健康對(duì)照組；50萬個(gè)/mL＜SCC＜100萬個(gè)/mL且CMT結(jié)果呈弱陽性的奶牛為輕度隱性乳房炎組；150萬個(gè)/mL＜SCC＜200萬個(gè)/mL且CMT結(jié)果呈陽性的奶牛為中度隱性乳房炎組；SCC＞300萬個(gè)/mL且CMT結(jié)果呈陽性的奶牛為重度隱性乳房炎組。最終根據(jù)胎次、年齡、泌乳期、產(chǎn)奶量等指標(biāo)相近的原則，選擇健康奶牛10頭和不同發(fā)病階段的隱性乳房炎患牛30頭，其中輕度、中度、重度隱性乳房炎患牛各10頭。

1．2 主要儀器與試劑

Varioskan酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國）；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）；Fossmatic 5000型體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（FOSS 公司，丹麥）；Bovineα1-AGP ELISA Kit（購自上海谷研生物科技有限公司）；加州乳房炎檢測(cè)法（CMT）試劑（購自福州佳宸生物科技有限公司）。

1．3 樣品采集及鑒定

在采集乳汁之前，先用酒精棉球擦拭牛乳頭進(jìn)行消毒，棄掉頭3把乳汁，人工擠壓將乳汁擠入滅菌試管內(nèi)，每份乳樣50mL，冰浴保存后立即帶回實(shí)驗(yàn)室。

采用體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)，之后進(jìn)行CMT檢測(cè)：測(cè)試盤中倒入2mL的乳樣，加入2mL的CMT試劑，混勻后輕輕作同心圓攪拌約15s進(jìn)行觀察。若混合液均勻且流動(dòng)性好、無絮狀物，則為陰性；混合液有微量顆粒但不久后消失，為可疑；有少許絮狀物或沉淀產(chǎn)生但無凝膠，判斷為弱陽性；凝結(jié)物呈膠狀，搖動(dòng)時(shí)呈中間集聚，停止搖動(dòng)時(shí)沉淀呈凹狀附著于盤底，判斷為陽性；全部呈凝膠狀，回轉(zhuǎn)時(shí)向心集中，停止攪動(dòng)則回復(fù)原狀并附著于皿底，判斷為強(qiáng)陽性。

1．4 乳清的制備

每份乳樣取20mL，4℃ 4 000r/min離心25min，除去上層乳脂，再4℃ 12 000r/min離心15min，棄掉沉淀取乳清部分，然后將乳清樣品分裝成5mL/EP管，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 乳清中α1-酸性糖蛋白含量的測(cè)定

按照Bovineα1-AGP ELISA Kit廠家操作說明書測(cè)定乳清樣品中α1-AGP含量，加終止液后15min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算樣品中α1-AGP的含量。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0分析系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 α1-酸性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

α1-AGP標(biāo)準(zhǔn)品按濃度梯度進(jìn)行稀釋，讀取各個(gè)濃度梯度的OD450nm值，以空白對(duì)照孔和標(biāo)準(zhǔn)孔中的蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）作為橫坐標(biāo)，OD450nm作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。由圖1可知，擬合直線回歸方程為：Y=0.012X+0.004（R2=0.9985），濃度與吸光值擬合度較優(yōu)，表明該方法檢測(cè)α1-AGP的含量比較可信。

圖1 α1-酸性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2．2 乳清樣品中α1-酸性糖蛋白的含量

由表1和圖2可知，與健康對(duì)照組奶牛乳清中α1-AGP含量比較，輕、中、重度隱性乳房炎患牛乳清中α1-AGP 含量顯著升高（P＜0.05），其中中度與重度隱性乳房炎組奶牛乳清中α1-AGP 含量升高趨勢(shì)變化尤為明顯，極顯著高于輕度乳房炎組（P＜0.01）與健康對(duì)照組（P＜0.01）。試驗(yàn)結(jié)果表明，患不同程度的隱性乳房炎奶牛乳清中α1-AGP含量有著明顯的差異，研究提示奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)增加及乳腺受損程度與乳清中α1-AGP含量呈正相關(guān)。

表1 不同程度隱性乳房炎患牛乳清中α1-AGP含量比較

圖1 α1-酸性糖蛋白在隱性乳房炎患牛和健康奶牛乳清中含量的比較

3 討論

當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受到來自體內(nèi)外的刺激、損傷或微生物感染引發(fā)炎癥時(shí)，就會(huì)激發(fā)先天的免疫系統(tǒng)啟動(dòng)急性期反應(yīng)（APR），進(jìn)而導(dǎo)致血清急性期蛋白（APP）含量迅速升高到健康狀態(tài)的數(shù)倍以上，在臨床診斷中，APP常被認(rèn)為是判斷疾病狀態(tài)最為重要的生物標(biāo)記物[6]。APP主要由肝臟合成，也有研究表明，一些APP也可由乳腺上皮細(xì)胞在肝外進(jìn)行合成[7]，在奶牛乳腺發(fā)生炎癥時(shí)，血清中的APP可通過血乳屏障進(jìn)入乳清中，在乳腺對(duì)抗感染、修復(fù)受傷組織及穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的生物過程中有著重要的作用[8]。隱性乳房炎發(fā)生時(shí)乳中APP含量的改變可提供乳區(qū)炎癥階段的特異信息，因此奶牛乳清中APP的含量可作為監(jiān)測(cè)奶牛乳腺健康或疾病狀態(tài)的重要指標(biāo)。

α1-AGP作為急性期蛋白成員之一，在各種炎癥或損傷等發(fā)生時(shí)，其在漿液中的表達(dá)逐漸升高，在機(jī)體殺死病原微生物對(duì)抗感染的過程中發(fā)揮重要作用。Jain等[9]發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病伴有腎病綜合征的患者血清中α1-AGP水平顯著高于正常人，研究表明血清中α1-AGP含量可作為Ⅱ型糖尿病伴有腎病綜合征的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)標(biāo)志物，也有報(bào)道稱血清α1-AGP濃度升高的Ⅱ型糖尿病患者并發(fā)心血管病死亡率的幾率大大增加[10]。另外，一些研究也表明，在炎癥、外傷、手術(shù)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤尤其在癌轉(zhuǎn)移時(shí)，α1-AGP濃度升高更為明顯[11,12]，在臨床醫(yī)學(xué)上α1-AGP常被認(rèn)為是漿液中一種最重要的非特異性藥靶。

本試驗(yàn)通過研究乳清中α1-AGP含量和乳腺感染之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)患不同程度隱性乳房炎時(shí)，奶牛乳清中α1-AGP的含量也有明顯的不同，隱性乳房炎患牛乳清中α1-AGP的含量顯著高于健康對(duì)照組，并且隨著隱性乳房炎病情的加重，乳清中α1-AGP含量也呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)；原因可能是由于隱性乳房炎發(fā)生時(shí)白介素-1刺激吞噬細(xì)胞釋放出脂多聚糖，進(jìn)而促進(jìn)了α1-AGP的合成，使其表達(dá)水平升高。α1-AGP作為一種最穩(wěn)定的早期呈陽性的急性時(shí)相反應(yīng)物，推測(cè)其在奶牛隱性乳房炎疾病發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果表明，乳清中α1-AGP含量變化與隱性乳房炎的發(fā)病程度具有一定的相關(guān)性，不同發(fā)病階段隱性乳房炎患牛乳清中α1-AGP含量變化特點(diǎn)為隱性乳房炎診斷方法的建立提供了新參考，同時(shí)也為隱性乳房炎快速診斷試劑盒的研發(fā)也提供了更為廣闊的空間和前景。

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Abstract:In order to analyze the relationship between the changes of the content of alpha 1- acid glycoprotein,mastitis and whey in different stages, we selected 10 healthy cows and 30 different disease severity (light, medium and heavy) in subclinical mastitis milk samples as test animal, the content of alpha 1- acid glycoprotein were determined in whey samples using alpha 1- acid glycoprotein ELISA kit. The experimental results showed that the content of a 1- acid glycoprotein in cow mastitis whey group was significantly higher than that in healthy dairy group (P＜0.01 or P＜0.05), and with the increase of mastitis disease and milk somatic cell count, the content of a 1-acid glycoprotein in whey showed an increasing trend. Research results suggest that the extent of the disease has certain correlation with the content changes of 1- alpha acid glycoprotein, the content was positively related to alpha 1- acid glycoprotein and whey somatic breast lesions caused by mastitis and milk SCC.

Key word:Dairy cattle; Subclinical mastitis; Whey; Alpha 1- acid glycoprotein

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Correlation Analysis of Alpha 1- acid Glycoprotein with Cows Subclinical Mastitis

JIANG Lei
(Animal Husbandry Economic Management Station of Liaoning Province, Shenyang 110032)

S858.23

A

1004-4264（2017）09-0046-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.09.013

2016-12-14

國家級(jí)星火計(jì)劃（2015GA650008）。

蔣磊（1985-），男，黑龍江海林人，獸醫(yī)師，本科，主要從事奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定及臨床獸醫(yī)學(xué)等研究工作。