黃曉慧，張宏，李鵬，廖天江，趙靜

（甘肅工業(yè)職業(yè)技術學院，天水 741025）

牧草專欄

微波輔助提取航天紫花苜蓿中總黃酮工藝研究

黃曉慧，張宏，李鵬，廖天江，趙靜

（甘肅工業(yè)職業(yè)技術學院，天水 741025）

本研究通過單因素試驗和正交試驗設計確定微波輔助提取航天紫花苜蓿中黃酮的優(yōu)化工藝條件：提取時間30min、乙醇濃度60%、微波功率600W、固液比1：15、提取溫度80℃。

微波；航天紫花苜蓿；黃酮；提取工藝

紫花苜蓿有“牧草之王”的美稱，經(jīng)航天誘變選育的紫花苜蓿具有優(yōu)質、高產(chǎn)，多葉率（5葉為主）高的特性[1]。苜蓿含有多種生物活性成分，在禽畜養(yǎng)殖、生物醫(yī)藥等領域有很高的利用價值。苜蓿中的黃酮類化合物結構多樣，種類繁多，可有效清除人體內的自由基，有抗氧化作用和多種保健功效[2,3]。與傳統(tǒng)中草藥相比，以苜蓿作為黃酮類化合物的來源，具有資源豐富、價格低廉等特點。苜蓿是大田作物，適宜大規(guī)模種植，產(chǎn)量較高；將苜蓿提取物加工后作為飼料添加劑應用，具有安全環(huán)保的特點；把苜蓿黃酮類化合物等活性成分的產(chǎn)品加入到草業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈中，不僅能增加苜蓿的經(jīng)濟附加值，還可以延長產(chǎn)業(yè)鏈、提升產(chǎn)業(yè)層次，促進生產(chǎn)和科研的發(fā)展[4]。

苜蓿中黃酮的提取多采用乙醇提取法。微波法是近20年來迅速發(fā)展起來的提取新技術，具有無噪聲、能耗低、效率高、不破壞活性成分的特點[5]。目前國內對于航天育種紫花苜蓿營養(yǎng)價值和有效成分提取分離的相

關研究較少，對其在實際生產(chǎn)中的應用結果更是鮮有報道。本文研究了應用微波技術輔助提取航天紫花苜?？傸S酮的工藝，旨在為航天綠色藥材的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1．1 試驗材料

航天紫花苜蓿全草取自天水國家高新農(nóng)業(yè)園區(qū)甘肅省航天育種工程技術中心，經(jīng)中國科學院西北高原生物研究所趙強博士鑒定，將苜蓿風干、粉碎、過篩、備用；黃酮（蘆?。φ掌罚▏幖瘓F化學試劑有限公司產(chǎn)品）；水為去離子水；其余試劑均為分析純。

1．2 儀器

XH-100A型微波催化合成/萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）、759型紫外可見分光光度計（浙江福立分析儀器有限公司）、SHB-IV22A型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、FA2104型電子天平（成都一科儀器設備有限公司）。

2 方法

2．1 標準曲線繪制

精密稱取蘆丁對照品0.0258g，置于25mL容量瓶中，以80%乙醇溶解并用去離子水稀釋至刻度，搖勻，得貯備液（濃度為1mg/mL）。分別取貯備液配制成黃酮濃度為0.00mg/mL、0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.00mg/mL的標準溶液，做兩份平行樣，于510nm波長處測定吸光度[6]，制作繪制標準曲線。

2．2 工藝研究

2.2.1 黃酮提取試驗

稱取5.0g航天紫花苜蓿干粉，置于磨口三頸瓶中，加一定濃度的相應體積的乙醇溶液。放置在XH-100A0型微波催化萃取儀中，在一定溫度、功率條件下，連續(xù)微波輻射一定時間后，抽濾；濾液加石油醚萃取3～5次，去除葉綠素干擾[7]，濃縮，用相應濃度的乙醇溶液將濾液定容至100mL，于510nm波長處測定吸光度，并計算黃酮含量。

黃酮含量（mg/g）=（C·V）/m

式中，C為提取液中黃酮質量濃度（mg/mL）；V為提取液總體積（mL）；m為原料干粉質量。

2.2.2 單因素試驗

開展在正交試驗之前進行單因素試驗，分別考察提取時間、提取溫度、固液比、乙醇濃度和微波功率對含量的影響。

2.2.3 正交試驗

為確定提取過程中各因素對黃酮含量影響的大小，將優(yōu)化后的提取時間（A）、乙醇濃度（B）、微波功率（C）、固液比（D）、提取溫度（E）5個因素，以L10(45)正交表進行試驗設計。因素水平如表1。

表1 因素水平

3 結果與分析

3．1 蘆丁標準曲線

圖1 黃酮標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示。結果表明，蘆丁檢測濃度在0～1.0mg/mL范圍內與吸收度呈良好線性關系（R2=0.9998），得其回歸方程為：Y=0.2956X-0.0013（其中，Y為吸光度，X為檢測濃度）。

3．2 單因素試驗結果

3.2.1 提取時間對黃酮含量的影響

按照2.2.1所述方法，擬定提取溫度60℃、固液比1∶15、微波功率600W條件下用50%乙醇溶液提取一次，考察不同提取時間對黃酮含量的影響，結果如表2所示。

表2 提取時間對黃酮含量的影響

由表2可知，該條件下微波提取30min后，提取的黃酮含量趨于平衡，不隨提取時間的增加而變化，故選擇提取時間30min為宜。

3.2.2 提取溫度對黃酮含量的影響

按照2.2.1所述方法，提取時間由3.2.1確定，擬定固液比1∶15、微波功率600W條件下用50%乙醇溶液提取一次，考察不同提取溫度對黃酮含量的影響，結果如表3所示。

表3 提取溫度對黃酮含量的影響

由表3可知，60～80℃范圍內，黃酮含量隨著溫度的升高先增大后減小，80℃時提取的黃酮含量相對達到最大，故選擇提取溫度80℃為宜。

3.2.3 固液比對黃酮含量的影響

按照2.2.1所述方法，提取時間由3.2.1確定，提取溫度由3.2.2確定，擬定微波功率600W條件下用50%乙醇溶液提取一次，考察不同固液比對黃酮含量的影響，結果如表4所示。

表4 固液比對黃酮含量的影響

由表4可知，黃酮含量隨著固液比的增大而增加，但該增長趨勢并不顯著，即固液比對黃酮含量的影響不大，故選取的溶劑量只需將原料完全浸沒即可，則固液比選取1∶15為宜。后續(xù)單因素試驗均以固液比1∶15進行操作。

3.2.4 乙醇溶液濃度對黃酮含量的影響

按照2.2.1所述方法，提取時間由3.2.1確定，提取溫度由3.2.2確定，固液比由3.2.3確定，擬定微波功率600W條件下用不同濃度乙醇溶液提取一次，考察不同乙醇溶液濃度對黃酮含量的影響，結果如表5所示。

表5 乙醇溶液濃度對黃酮含量的影響

由表5可知，黃酮含量隨著乙醇濃度的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的變化；當乙醇溶液濃度為60%時黃酮含量最高，故選擇60%乙醇進行提取為宜。

3.2.5 微波功率對黃酮含量的影響

在3.2.1、3.2.2、3.2.3和3.2.4確定的最佳因素條件下，考察不同微波功率對黃酮含量的影響，結果如表6所示。

表6 微波功率對黃酮含量的影響

由表6可知，微波功率設定為600W時，同等條件下黃酮的提取含量可達最大值，故選擇微波功率600W為宜。

3．3 單因素試驗驗證結果

單因素試驗條件下得出了優(yōu)化工藝參數(shù)：提取時間30min、乙醇濃度60%、微波功率600W、固液比1∶15、提取溫度80℃。相同工藝條件下重復3批原料的提取試驗，結果如表7。

表7 單因素試驗結果

3．4 正交試驗結果

正交試驗結果見表8，方差分析結果如表9表示。

表8 正交試驗結果

表9 方差分析結果

由表8、表9可知，各因素對黃酮提取含量影響的大小順序為：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間＞微波功率＞固液比。提取溫度影響最大，固液比影響最小。由直觀的極差分析初步認為優(yōu)化工藝參數(shù)是A4B3C2D4E4，即提取時間30min、乙醇濃度70%、微波功率600W、固液比1∶25、提取溫度80℃。

3．4 正交試驗驗證結果

按照A4B3C2D4E4條件下重復3批原料的試驗進行驗證，結果如表10。

表10 驗證試驗結果

3批驗證試驗結果比較接近，說明該優(yōu)化工藝基本穩(wěn)定，適用于從航天紫花苜蓿中提取黃酮。

相比較，正交試驗驗證的黃酮含量9.04mg/g略低于單因素驗證試驗的9.48mg/g，這是由提取條件中乙醇濃度和固液比這兩個影響因素的參數(shù)不同而引起的。然而，單因素試驗和正交試驗結果中均顯示固液比對黃酮含量的影響很小，若將固液比的影響忽略不計，則可視作同等條件下，60%乙醇提取黃酮含量略高于70%乙醇提取的量，故可考慮選擇60%乙醇進行提取，提高黃酮含量的同時也可減少乙醇的用量。

3 結論

黃酮類化合物的傳統(tǒng)提取方法主要是水煎法，主要缺點是提取效率低、能耗大。超聲波輔助提取法可用來提取黃酮類化合物，但存在噪聲污染等問題從而難以廣泛應用[8]。相比較而言，微波輔助萃取天然產(chǎn)物中活性成分具有設備簡單、適用范圍廣、萃取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省時間、節(jié)省試劑、污染小等特點。采用微波輔助提取航天紫花苜蓿的工藝方法，單因素試驗與正交實驗結果比較接近，考慮到實際操作中固液比和時間的增大會增大能耗，并且增大后續(xù)工作難度，因此將該工藝條件定為：提取時間30min、乙醇濃度60%、微波功率600W、固液比1∶15、提取溫度80℃。

[1]常根柱,楊紅善,柴小琴,等．航苜1號紫花苜蓿[Z]．國家科技成果．

[2]朱見明,李娜,張亞軍,等．苜蓿黃酮的研究進展[J]．草業(yè)科學,2009,26(9)：156-162．

[3]余凡,葛亞龍,楊恒拓,等．苜蓿黃酮的研究概況[J]．食品與發(fā)酵科技．2014,50(1)：9-13．

[4]趙海福,王濤,李朋玲,等．基于HPLC測定的響應面法優(yōu)化航天紫花苜蓿中黃酮的提取工藝[J]．中國奶牛,2014,11：28-31．

[5]Shuncheng REN,Yani CHEN,Suyun HAN,et al．,Microwaveassisted Extraction of Total Flavonoids from Fructus Hippophae[J]．Medicinal Plant,2011,2(8)：49-51,55．

[6]廖天錄,方梅,陳虹,等．航天苜蓿中黃酮提取工藝及抑菌活性研究[J]．畜牧獸醫(yī)雜志,2013,32(3)：17-20．

[7]張詠梅,晏石娟,曹致中,等．微波輔助提取苜蓿黃酮方法的研究[J]．草地學報,2008,16(1)：76-80．

[8]張羽男,黃淼,張宇,等．紫花苜?？傸S酮的微波輔助提取及其體外抗腫瘤活性研究[J]．時珍國醫(yī)國藥,2014,25(6)：1300-1302．

Abstract:This study was to optimize the parameters for extraction of flavonoids from space breeding alfalfa by microwave-assisted method through single factor design and orthogonal test. And the optimum conditions of the extraction process were as follows: 30min of microwave-assisted extraction time, 60% of ethanol concentration,600W of microwave power, 1:15 of solid-liquid ratio, and 80℃ of extraction temperature.

Key words:Microwave; Space breeding alfalfa; Flavonoids; Extraction process

Study on Microwave-assisted Extraction Process of Total Flavonoids from Space Breeding Alfalfa

HUANG Xiao-hui, ZHANG Hong, LI Peng, LIAO Tian-jiang, ZHAO Jing
(Gansu Industry Polytechnic College, Tianshui 741025)

S823.3

A

1004-4264（2017）09-0061-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.09.016

2017-06-10

甘肅省高等學校科學研究自籌經(jīng)費項目（2015B-154）。

黃曉慧（1983-），女，漢族，講師，碩士，主要從事化學分析、化工技術方面的專業(yè)研究及教育教學工作。