黃大偉 陸定波Δ 高 翔 鄧郭琳

1.湖北省中醫(yī)院肝病科 (湖北 武漢， 430074) 2.湖北中醫(yī)藥大學2013級研究生班

·基礎理論研究·

抗纖軟肝顆粒調控Hedgehog通路核轉錄因子Gli1抑制肝星狀細胞活化的研究*

黃大偉1陸定波1Δ高 翔1鄧郭琳2

1.湖北省中醫(yī)院肝病科 (湖北 武漢， 430074) 2.湖北中醫(yī)藥大學2013級研究生班

目的：探討抗纖軟肝顆粒調控Hedgehog(Hh)信號通路抑制HSC活化的作用機制。方法引進人肝星狀細胞系HSC-LX2，常規(guī)培養(yǎng)及傳代，設立空白對照組、模型組和抗纖軟肝顆粒中、低劑量組。藥物作用24h后收集細胞，測定各組Hh信號通路相關信號分子Gli1、Shh、Ptc、Smo的表達，轉化生長因子-β1(TGF-β1)及PDGF-B的水平。結果模型組HSC細胞Hh信號通路相關信號分子Shh、Ptc、Smo、Gli1 mRNA表達均增高，與空白對照組比較，差異具有顯著性意義(P<0.05)；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Shh、Ptc、Smo、Gli1 mRNA表達較模型組減少，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無顯著性意義。HSC誘導活化后，模型組TGF-β1及PDGF-B合成增加，與空白對照組比較差異具有顯著性意義(P<0.05)；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組TGF-β1及PDGF-B合成較模型組下降，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無顯著性意義。結論抗纖軟肝顆粒能夠下調Hh信號通路核轉錄因子Gli1及相關信號分子Shh、Ptc、Smo的表達，從而抑制HSC活化，減少TGF-β1、PDGF-B的合成。

肝纖維化；抗纖軟肝顆粒；Hedgehog通路；Gli1

AbstractObjective:To study the mechanism of anti-hepatic fibrosis through Kangxian Ruangan granule regulating the Hedgehog (Hh) signaling pathway which activated Hepatic Stellate Cells (HSC) and inhibiting the activation of HSC.Methods:To introduce Human Hepatic Stellate Cell line HSC-LX2,culture and passage them in conventional methods. The expertment was divided into blank control group, model group and Kangxian Ruangan granule medium, low does group. Conventional cultured cells as the blank control group.For 24 hours. Followed, the cells were collected.The expression of Hh signaling pathway’s related signal molecules such as Gli1, Shh, Ptc and Smo and the effect of Kangxian Ruangan granule on HSC activation and synthesis of transforming growth factor-beta 1 (TGF-1) and PDGF-B were analyzed.Results:Compared with the blank control group,the expression of Hh signaling pathway’s related signal molecules include Shh, Ptc, Smo, Gli1 mRNA were increased in HSC cells of the model group, the difference was significant (P<0.05);The expression of Shh, Ptc, Smo, Gli1 mRNA in Kangxian Ruangan granule medium, low does group were lower than that in the model group (P<0.05), and there was no significant difference among different does groups; Compared with the blank control group, the synthesis of TGF-β1 and PDGF-B increased after HSCs activated by PDGF-BB in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the synthesis of TGF-β1 and PDGF-B decreased in Kangxian Ruangan granule medium, low does group (P<0.05).Conclusion:Kangxian Ruangan granule could regulate the expression of nuclear transcription factor Gli1 and its related signal molecules include Shh, Ptc and Smo of Hedgehog (Hh) signal pathway, and then inhibit the activation of HSCs and reduce the synthetise of TGF-β1and PDGF-B.

KeyWordsHepatic Fibrosis; Kangxian Ruangan granule; Hedgehog Pathway; Gli1.

抗纖軟肝顆粒是我院肝病研究所的院內制劑，由名中醫(yī)肝病專家張赤志教授創(chuàng)立。前期研究顯示抗纖軟肝顆粒能通過細胞因子途徑、信號轉導途徑抑制肝呈狀細胞(HSC)活化、促進HSC凋亡，進而抑制細胞外基質(ECM)的過度沉積，發(fā)揮抗肝纖維化作用。它能干擾血小板衍生生長因子(PDGF)在HSC的信號轉導，阻斷PDGF的生物學效應[1]，故推測抗纖軟肝顆粒是Glil小分子抑制劑。本研究通過體外實驗，探討抗纖軟肝顆粒對HSC中Hh信號通路核轉錄因子Gli1的調控作用。

1 材料和方法

1.1 研究材料

1.1.1 細胞系 肝星狀細胞系HSC-LX2由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院劉成海教授惠贈，表現(xiàn)為靜止的HSC。

1.1.2 藥物 抗纖軟肝顆粒為湖北省中醫(yī)院院內制劑(批準文號：鄂藥制字Z20113145)，由湖北省中醫(yī)院制劑中心制備。臨用時，以含10% 胎牛血清(美國GIBCO公司)的DMEM(高糖)培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)充分溶解，分別制備濃度為5mg/ml、1.25mg/ml的藥物溶液，采用孔徑為0.22μm的微孔濾膜針頭濾器抽濾除菌后4℃保存，1周內用完。

1.2 研究方法

1.2.1 HSC細胞傳代培養(yǎng) 將人HSC-LX2細胞系接種至含10% 胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，12h后首次更換培養(yǎng)基，以后每3天更換培養(yǎng)基一次，待細胞長滿瓶底約90% 時以0.125% 胰蛋白酶-EDTA溶液消化、傳代。

1.2.2 實驗分組及樣品處理 培養(yǎng)的HSC-LX2細胞分為空白對照組、模型組和抗纖軟肝顆粒中、低劑量組?？瞻讓φ战M為正常培養(yǎng)的HSC-LX2細胞，未做特殊處理，是靜息狀態(tài)的HSC細胞。模型組和抗纖軟肝顆粒中、低劑量組細胞均分別給予10ng/ml PDGF-BB處理24h以誘導靜息狀態(tài)的HSC細胞活化，抗纖軟肝顆粒中、低劑量組在PDGF誘導24h后再分別給予濃度5mg/ml、1.25mg/ml的抗纖軟肝顆粒藥物溶液處理24h。

1.2.3 實時熒光定量PCR法分析HSC細胞Hh信號通路相關信號分子和TGF-β1、PDGF-B mRNA的表達情況 各組細胞樣品分別處理后，吸棄培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)基，加入適量4℃預冷的TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，輕柔吹打數(shù)次以使貼壁細胞脫落，將含有細胞的TRIzol試劑轉移至1.5ml EP管，酚-氯仿法提取總RNA，采用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)逆轉錄合成第一鏈cDNA，采用熒光實時定量PCR法(KAPA SYBR FAST qPCR試劑盒，美國Kapa Biosystems公司)測定各組細胞中Hh信號通路核轉錄因子Gli1及其他相關信號分子Shh、Ptc、Smo 以及HSC合成TGF-β1、PDGF-B mRNA的表達。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有計量數(shù)據(jù)錄入Excel表格，采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PDGF-BB誘導HSC活化 HSC細胞經(jīng)PDGF-BB誘導后活化并增殖。實時熒光定量PCR法測定各組細胞合成TGF-β1、PDGF-B mRNA的表達量，以及各組細胞Hh信號通路關鍵因子Gli1、Shh、Ptc、Smo的表達量。以空白對照組細胞為對照，將該組TGF-β1、PDGF-B、Gli1、Shh、Ptc、Smo mRNA表達量視為1，采用相對定量2-ΔΔCt進行比較。HSC誘導活化后，模型組TGF-β1 mRNA相對空白對照組的表達倍數(shù)為3.55±0.20，顯著高于空白對照組(P<0.05)；模型組PDGF-B mRNA相對空白對照組的表達倍數(shù)為3.81±0.09，顯著高于空白對照組(P<0.05)；模型組細胞Hh信號通路關鍵因子Gli1、Shh、Ptc、Smo mRNA相對空白對照組的表達倍數(shù)分別為2.33±0.05、1.37±0.07、2.03±0.18、2.15±0.21，顯著高于空白對照組(P<0.05)。

2.2 抗纖軟肝顆粒對HSC合成TGF-β1、PDGF-B的影響 實時熒光定量PCR測定抗纖軟肝顆粒中、低劑量組及模型組細胞合成TGF-β1、PDGF-B mRNA的表達量，以模型組細胞為對照，將該組TGF-β1、PDGF-B mRNA表達量視為1，采用相對定量2-ΔΔCt進行比較?？估w軟肝顆粒中、低劑量組TGF-β1 mRNA相對模型組的表達倍數(shù)分別為0.31±0.02、0.35±0.01，與模型組相比差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較差異無顯著性意義；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組PDGF-B mRNA相對模型組的表達倍數(shù)分別為0.19±0.01、0.36±0.02，與模型組相比差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較差異無顯著性意義(見表2、圖1)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

圖1 抗纖軟顆粒中劑量組(n=3)、低劑量組(n=3)細胞中TGF-β1、PDFG-B mRNA表達圖

組別TGF-β1PDGF-B抗纖軟肝顆粒中劑量組0.31±0.02*0.35±0.01*抗纖軟肝顆粒低劑量組0.19±0.01*0.36±0.02*

注：模型組各項指標表達量視為1。(見2.2中內容)下表同。與模型組比較，*P<0.05

2.3 抗纖軟肝顆粒對HSC細胞Hh信號通路關鍵信號分子表達的影響 以模型組細胞Hh信號通路相關信號分子的表達量為對照，將該組Gli1、Shh、Ptc、Smo mRNA表達量視為1，采用相對定量2-ΔΔCt進行比較。實時熒光定量PCR結果顯示，抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Gli1 mRNA相對模型組的表達倍數(shù)分別為0.45±0.01、0.65±0.03，與模型組相比差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無顯著性意義；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Shh mRNA相對模型組的表達倍數(shù)分別為1.12±0.03、1.09±0.10，與模型組相比，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無顯著性意義；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Ptc mRNA相對模型組的表達倍數(shù)分別為0.40±0.02、0.39±0.07，與模型組相比，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無顯著性意義；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Smo mRNA相對模型組的表達倍數(shù)分別為0.44±0.09、0.42±0.05，與模型組相比，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無顯著性意義(見表3、圖2)。

表3 抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Hh信號通路相關信號分子mRNA相對模型組表達量比較(2-ΔΔCt，mean±SD，n=3)

與模型組比較，*P<0.05

圖2 抗纖軟肝顆粒中劑量組(n=3)、低劑量組(n=3)細胞中Hh信號通路Glil、Shh、Ptc、Smo mRNA表達圖

3 討論

肝星狀細胞(HSC)的異?；罨歉卫w維化進展的核心環(huán)節(jié)，表現(xiàn)為表達α-SMA，產(chǎn)生TGF、PDGF、ANGⅡ等，最終形成纖維瘢痕。近年學者認識到經(jīng)典的Hh信號通路與肝星狀細胞的活化有關。實驗研究表明：多種活化的HSC均表達Hh配體和Hh通路Shh、Patch、 Smo和Gli等多重組分[2]。

抗纖軟肝顆粒是張赤志教授在我院已故名老中醫(yī)呂繼端教授臨床經(jīng)驗的基礎之上創(chuàng)立，張教授認為肝纖維化是肝硬化“證未顯現(xiàn)”階段，“肝絡瘀阻、痰瘀互結”是這一階段的總病機，從而確立以“痰瘀阻絡”為核心的辨證治療體系?？估w軟肝顆粒具有“化痰軟堅、活血化瘀”之功效，現(xiàn)為我院自制中成藥制劑，在我院肝炎肝硬化中醫(yī)診療方案中作為代償性肝硬化治療常規(guī)用藥。該藥由海藻、鱉甲、牡蠣、莪術、丹參、山楂、地骷髏組成，具有“化痰軟堅、活血化瘀”之功效。我們采用不同濃度的抗纖軟肝顆粒干預經(jīng)PDGF誘導活化的HSC，發(fā)現(xiàn)藥物干預后，HSC中Hh信號通路核轉錄因子Gli1及其他Hh通路相關組分Shh、Ptc、Smo的相對表達量均下降，而各劑量組之間無明顯差異。這一結果說明抗纖軟肝顆粒對HSC中Hh信號通路具有調控作用，能下調Hh信號通路核轉錄因子Gli1和Hh信號通路關鍵因子Shh、Ptc、Smo的表達，從而抑制HSC活化，減少TGF-β1、PDGF-B的合成，這可能是其減輕肝纖維化病變程度、延緩病程進展的作用機制之一。

[1] 楊玲, 朱清靜, 笪邦紅, 等.中藥抗纖軟肝顆粒抑制PDGF誘導的肝星狀細胞MEK-1和c-fos表達[J].世界華人消化雜志，2004，12(2):347-350.

[2] Taipale J, Chen JK, Cooper MK,etal. Effects of oncogenic mutations in smoothened and patched can be reversed cyclopamine [J].Nature，2000，206(6799):10005-1009.

StudyofKangxianRuanganGranuleregulatingHedgehogpathway’snuclearfactorGli1foranti-activationofhepaticstellatecells

HUANGDa-wei1,LUDing-bo1Δ,GAOXiang1,etal.

1.DepartmentofHepatologydiseases,HubeiHospitalofTraditionalChineseMedicine(WuhanHubei,430061)China

2016-09-03 編輯：黃育華)

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.01.013

湖北省衛(wèi)生和計劃生育委員會資助項目(No.2012Z-Y01)；Δ通訊作者,Email:ludingbo64@163.com