王衛(wèi)華

河北省邯鄲市傳染病醫(yī)院肝五科 (河北 邯鄲， 056002)

甲乙煎改善肝纖維化大鼠肝細(xì)胞的實驗研究*

王衛(wèi)華

河北省邯鄲市傳染病醫(yī)院肝五科 (河北 邯鄲， 056002)

目的：觀察中藥甲乙煎對實驗性肝纖維化大鼠肝組織炎癥活動度和肝纖維化程度及肝細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表達(dá)水平的影響。方法60只大鼠除正常組10只外，其余50只通過腹腔注射DMN(二甲基正硝胺)建立肝纖維化大鼠模型。造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為3組(模型組、甲乙煎高劑量、低劑量組各10只)，甲乙煎高、低劑量組大鼠分別給予22g/kg.d和5.5 g/kg·d甲乙煎藥汁灌胃治療；正常組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，共4W。結(jié)果甲乙煎高劑量組、甲乙煎低劑量組大鼠肝組織炎癥活動度和肝纖維化程度明顯降低，尤其是甲乙煎高劑量組大鼠肝組織肝纖維化程度降低最明顯，與甲乙煎低劑量組、模型組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。高、低劑量甲乙煎不能下調(diào)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞內(nèi)MMP-2 的陽性表達(dá)，與模型組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論：甲乙煎能明顯改善肝纖維化大鼠肝組織炎癥活動度和肝纖維化程度，但它不是通過下調(diào)肝細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2來改善肝纖維化的。

關(guān)題詞甲乙煎；肝纖維化大鼠模型；實驗研究

AbstractObjective: To Observe the effects of Jiayijian on the expression level of MMP2 in the hepatocytes of rats with hepatic fibrosis, as well as its impact on the grade of inflammation and the degree of hepatic fibrosis.Methods:After successfully establishing the hepatic fibrosis rats model based on some latest research reports, the rats were divided into normal control groups(10) and model groups(30). And then the 30 rats of model group were randomly divided into another 3 groups (model control group, the low and high dosage of Jiayijian group). The rats of the high and low dose groups were given Jiayijian at dosage of 22g/kg/d and 5.5g/kg/d by gavage for 4 weeks. The normal control and model control groups were given, according to requirements, the same volume of 0.9% sodium chloride injection by gavage once a day for 4 weeks as well.Results: For the low and high dosage of Jiayijian groups, the degree of rat liver tissue inflammation , fibrosis grade scores reduced after treatment. In particular, Compared with the hepatic fibrosis model control group and the low dose group, the difference were significant in the high dose group(P<0.05). the low and high dosage of Jiayijian cannot down-regulate the expression of MMP2. Compared with model control group , the difference was no significant in the high and low dose group(P>0.05).Conclusion: Chinese medicine Jiayijian may relieve the inflammation and inhibit fibrosis in hepatic tissue of experimental rats with hepatic fibrosis, and thereby play a role in improving the degree of hepatic fibrosis, But cannot down-regulate the expression of MMP2.

Keywords: Jiayijian; hepatic fibrosis model; experimental research

肝纖維化是由多種病因?qū)е碌穆愿尾」灿械牟±砀淖?，以?xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過度沉積為病理特征，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)途徑[1]。多年來我院使用經(jīng)驗方“甲乙煎”抗肝纖維化取得了滿意的臨床療效。我們通過注射二甲基亞硝胺(DMN)建立大鼠肝纖維化動物模型，觀察中藥甲乙煎對DMN導(dǎo)致的大鼠肝纖維化的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級Wister大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，實驗動物合格證號：603036。按清潔級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，每只大鼠喂飼料50g/d，充足飲水，相對濕度60%，溫度20℃，動物飼料由河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

1.2 藥品及試劑 甲乙煎由茵陳、茯苓、薏苡仁、佩蘭、澤瀉、郁金、柴胡、連翹、生甘草按3∶3∶3∶1∶1∶1∶1∶1∶1組成。由河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中藥制劑室制成流浸膏，每毫升藥液含生藥2.5g。二甲基亞硝胺(DMN)由東京化成工業(yè)株氏會社提供(批號：MAL05)。

1.3 主要儀器 奧林巴斯光學(xué)顯微鏡BX41(OLYMPUS公司)；BM-Ⅱ型病理組織包埋機(jī)(安徽電子科學(xué)研究所)；303-4A數(shù)顯電熱保溫箱(上海陽光實驗儀器有限公司)；CS-Ⅱ型攤片烤片機(jī)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)。

1.4 動物分組及模型制備 60只大鼠除正常組10只外，其余50只每周連續(xù)3日腹腔注射DMN 10mg/kg·d，共4周造模，首次用量減半。造模結(jié)束后隨機(jī)抽取1只大鼠做肝臟病理切片，證實有假小葉形成，為肝纖維化4級。造模時19只大鼠死亡，故有30只大鼠進(jìn)入下一步實驗。

1.5 分組及給藥方法 30只模型大鼠隨機(jī)分為3組(模型組、甲乙煎高、低劑量組)每組10只，甲乙煎高、低劑量組大鼠分別給予22g/kg·d和5.5 g/kg·d甲乙煎灌胃治療，灌胃容量為3毫升，模型組和正常組大鼠給予等容量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，共4周。

1.6 觀察項目 末次給藥次日，空腹處死全部大鼠，取肝左葉組織部分，用10%中性福爾馬林固定24h，石蠟包埋切片，免疫組化法檢測大鼠肝細(xì)胞MMP-2的表達(dá)，光鏡下觀察各組大鼠肝組織炎癥活動度和肝纖維化程度。

1.7 判定標(biāo)準(zhǔn) 大鼠肝組織MMP-2的蛋白表達(dá)均在細(xì)胞漿內(nèi)，根據(jù)著色程度及著色細(xì)胞百分率進(jìn)行計算：不著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；著色細(xì)胞計數(shù)陽性細(xì)胞百分率5%以下為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>51%為3分，每張切片著色程度與著色細(xì)胞百分率得分，0～1分陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6分及以上為強(qiáng)陽性(+++)。參照王泰齡等慢性肝炎炎癥活動度和肝纖維化評定標(biāo)準(zhǔn)計分[2]。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟包進(jìn)行分析，計數(shù)資料組間比較采用秩和檢驗，以P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝組織的肉眼觀察情況 正常組大鼠肝臟外觀紅潤，表面光滑，質(zhì)地柔軟；模型組大鼠肝臟外觀偏小，呈黃褐色，表面粗糙，部分見細(xì)小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較脆；甲乙煎高、低劑量組大鼠肝臟外觀呈褐色，表面粗糙，部分偶見細(xì)小結(jié)節(jié)，質(zhì)地偏硬。

2.2 各組大鼠肝組織的顯微鏡觀察情況 Masson染色(纖維染綠)示：正常組大鼠肝組織無膠原纖維增生；模型組大鼠肝組織匯管區(qū)大量膠原纖維和網(wǎng)狀纖維增生，形成纖維間隔包裹假小葉；甲乙煎高劑量組大鼠在匯管區(qū)與肝竇見少量綠色膠原纖維；甲乙煎低劑量組大鼠在匯管區(qū)與肝竇有較多綠色膠原纖維，相對模型組較少。見插頁圖12.3 各組大鼠肝組織炎癥活動度、纖維化情況 經(jīng)秩和檢驗，甲乙煎高、低劑量組大鼠炎癥活動度與模型組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)，且甲乙煎高劑量組大鼠肝組織炎癥活動度改善方面優(yōu)于甲乙煎低劑量組(P<0.05)；甲乙煎高劑量組大鼠肝組織纖維化程度與模型組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)，而甲乙煎低劑量組與模型組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠肝組織炎癥活動度、纖維化程度比較 (n)

2.4 各組大鼠肝組織MMP-2表達(dá)情況 見表2、插頁圖2。

表2 各組大鼠肝組織的MMP-2的表達(dá)比較(n)

與正常組比較，**P<0.05，與模型組比較，△P>0.05

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝纖維化是各種慢性肝病病情進(jìn)展的一個共同的病理環(huán)節(jié)，以肝星狀細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)大量生成和過度沉積為主要特征[3]。在肝內(nèi)參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的酶系為MMPs，MMPs是一類含有鋅原子其活性依賴于鈣離子的蛋白酶，可以降解ECM中的主要大分子[4],其中MMP-2又稱明膠酶A，系Ⅳ型膠原酶, MMP-2在肝星狀細(xì)胞肝竇內(nèi)皮細(xì)胞﹑庫普弗細(xì)胞均有表達(dá)，MMP-2活化后能降解I、 III型膠原(明膠)、IV型、V型天然膠原分子和纖維連結(jié)蛋白等，在肝纖維化時MMP-2表達(dá)明顯增強(qiáng)。

肝纖維化屬中醫(yī)學(xué)積聚、鼓脹、黃疸等范疇，是各種外感、內(nèi)傷因素?fù)p傷肝臟日久而致，濕熱疫毒和正氣不足是主要發(fā)病因素。其中肝病傳脾是重要的病理環(huán)節(jié)。甲乙煎是劉亞嫻教授治療肝病的基礎(chǔ)方劑，參考王旭高、秦伯未等古今醫(yī)家治療肝病的理論與經(jīng)驗而擬定，中醫(yī)理論認(rèn)為肝病傳脾是重要的病理環(huán)節(jié)，《金匱要略》曰 “見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實脾”。本方突出體現(xiàn)了上述治療原則?；舅幬镉绍蜍?、苡仁、佩蘭、澤瀉、茵陳、柴胡、郁金、連翹、生甘草等組成，全方重在健脾化濕、疏肝和胃、調(diào)理氣機(jī)，佐以解毒。以茯苓、薏仁、佩蘭、澤瀉健脾化濕為君，茵陳、柴胡疏肝，郁金理氣為臣，連翹(或加公英)解毒為佐，生甘草解毒和中，調(diào)和諸藥為使。該方并突出體現(xiàn)了中醫(yī)“異病同治”的治療特點，臨床應(yīng)用取得了較好的療效。

本實驗結(jié)果顯示，甲乙煎對大鼠肝組織炎癥程度和纖維化程度均有顯著改善作用，但沒有觀察到它對MMP-2的影響作用，有可能甲乙煎并非是通過下調(diào)MMP-2來抑制肝纖維化的，我們需要進(jìn)一步研究。高劑量的甲乙煎能明顯控制實驗性肝纖維大鼠的肝組織炎癥和抑制其纖維化程度，低劑量的甲乙煎能明顯控制實驗性肝纖維大鼠的肝組織炎癥，但抑制纖維化程度方面較高劑量差。甲乙煎從調(diào)脾入手，健脾利濕﹑理氣和胃﹑疏肝解郁，為中醫(yī)藥防治肝炎和防治肝纖維化開拓了新思路。

[1] 王衛(wèi)華. 甲乙煎對肝纖維化大鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β1蛋白水平的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2016，26 (3):171-172.

[2] 王泰齡,劉霞,周元平,等.慢性肝炎炎癥活動度及纖維化程度計分方案[J].中華肝臟病雜志,1998,6(4):195-197.

[3] Iwaisakok, BrennerDA,KisseLevaT.What’s new in Live fibrosis? The origin of myofibroblasts in liver fibrosis [J].J Gasttroenterol Hepatol,2012，27(Suppl2)：65-68.

[4] Wojtowicz-PragaSM,Dickson RB,Hawkins MJ,etal.Matrix metalloprotein-aseinhibitors[J]. Invest New Drugs,1997,15(1):61-75.

ThestudyofJiayijianontheExpressionofRatswithHepaticFibrosis

WANGWei-hua

Division5thofLiverDiseases,HospitalforInfectiousDiseasesofHandan(HandanHebei, 056002)China

2016-11-03 編輯：黃育華)

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.01.016

邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展項目(No：0923108133)